傳性非綜合征耳聾( 選基因的生物信息學(xué) 分析與突變檢測(cè)及兜甲蛋白角化病的研究 作者姓名： 潘 瓊 學(xué)科專(zhuān)業(yè)： 遺 傳 學(xué) 學(xué)院 （系、 所） ： 中國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 指導(dǎo)教師： 夏家輝 院士 中 南 大 學(xué) 2007 年 12 月 密級(jí) 博士學(xué)位論文 遺傳性非綜合征耳聾( 選基因的生物信息學(xué) 分析與突變檢測(cè)及兜甲蛋白角化病的研究 of 30者姓名： 潘 瓊 學(xué)科專(zhuān)業(yè)： 遺 傳 學(xué) 學(xué)院 （系、 所） ： 中國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 指導(dǎo)教師： 夏家輝 院士 導(dǎo)師小組： 夏 昆 教授 潘 乾 副教授 論文答辯日期 答辯委員會(huì)主席 中 南 大 學(xué) 2007 年 12 月 博士學(xué)位論文 中文摘要 傳性非綜合征耳聾(選基因的生物信息學(xué)分析與突變檢測(cè) 中 文 摘 要 耳聾 (各種不同程度聽(tīng)力損失 (總稱(chēng)。聽(tīng)力損失是最常見(jiàn)的感覺(jué)障礙。在世界范圍內(nèi) , 每 1000名新生兒中就有1名先天性耳聾患兒 , 50%患兒的耳聾與遺傳因素有關(guān)。在遺傳性耳聾中，約 70%為非綜合征型耳聾 (目前為止，已定位了 100多個(gè)疾病相關(guān)基因位點(diǎn)，其中 40個(gè)疾病相關(guān)基因已被克隆。 本實(shí)驗(yàn)室收集到一個(gè)湖南懷化的遺傳了 5代的常染色體顯性遺傳的非綜合征耳聾家系。通過(guò)全基因組 點(diǎn)連鎖分析在 細(xì)定位及單體型分析提示該病基因位于 5位于 502121)和 02121)經(jīng)突變檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)突變。提示本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的常染色體顯性遺傳進(jìn)行性感覺(jué)神經(jīng)性耳聾位點(diǎn)( 有可能在 5已有研究顯示導(dǎo)致常染色體顯性遺傳的非綜合癥型耳聾的基因是不同的，許多基因參與了聽(tīng)覺(jué)形成過(guò)程，很難根據(jù)一個(gè)基因的已知博士學(xué)位論文 中文摘要 據(jù) 據(jù)庫(kù)的注釋?zhuān)g內(nèi)共有 173 個(gè) 199 個(gè) 著新的分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，特異性耳蝸特異性 庫(kù)數(shù)量的增加以及小鼠耳聾動(dòng)物模型的建立， 以及可獲得的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)的激增， 為克隆新的遺傳性耳聾基因提供了最可能的候選基因。我們應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析 5間的候選基因，通過(guò)分析 蝸 據(jù)庫(kù)，耳發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)， 文庫(kù)以及 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合耳蝸基因表達(dá)譜，基因功能，耳聾臨床表現(xiàn)特征，小鼠耳聾致病基因以及識(shí)別疾病候選基因的生物信息學(xué)軟件 (如 預(yù)測(cè)結(jié)果等資料，建立了識(shí)別耳聾候選基因的策略，在間內(nèi)優(yōu)先選擇了 52 個(gè)候選基因，包括兩個(gè)小鼠耳聾基因 在對(duì) 52 個(gè)候選基因的編碼區(qū)、剪切位點(diǎn)、部分內(nèi)含子區(qū)和部分調(diào)控區(qū)的突變檢測(cè)中， 15 個(gè)基因未發(fā)現(xiàn)任何序列變異，在其余 37 個(gè)候選基因共發(fā)現(xiàn) 108 個(gè) 中包括雜合變異和純合變異。查詢(xún)單核苷酸多態(tài)數(shù)據(jù)庫(kù) 報(bào)道的 94 個(gè)，未收錄的多態(tài)位點(diǎn)有 15 個(gè)。經(jīng)再對(duì)家系內(nèi)其他患者、家系內(nèi)正常人及家系外正常對(duì)照的突變分析，結(jié)果表明所有 疾病表型無(wú)共分離。盡管從基因表達(dá)和基因功能上來(lái)看 博士學(xué)位論文 中文摘要 點(diǎn)區(qū)間內(nèi)的最有可能與耳聾相關(guān)的基因，但突變檢測(cè)結(jié)果卻僅在這些基因中發(fā)現(xiàn)一些 找到致病性突變。這說(shuō)明這些基因可能均不是 致病基因，其致病性突變可能存在于基因的非編碼區(qū)，或新的致病基因有待于發(fā)現(xiàn)。 關(guān)鍵詞 ：耳聾，非綜合征耳聾，突變 檢測(cè)，候選基因，生物信息學(xué) 博士學(xué)位論文 中文摘要 因 730變導(dǎo)致的兜甲蛋白角皮病 中 文 摘 要 兜甲蛋白角皮病 (一個(gè)新的疾病術(shù)語(yǔ)，由因突變所引起的遺傳性皮膚病現(xiàn)統(tǒng)一命名為兜甲蛋白角皮病。兜甲蛋白角皮病的表型具有多樣性。臨床上，這些患者被診斷為伴隨魚(yú)鱗病的 合征 (殘毀性掌跖角皮病， 04117)，進(jìn)行性對(duì)稱(chēng)性紅皮膚角化病 (，或出生時(shí)為火棉膠嬰兒的先天性魚(yú)鱗病樣紅皮病。 本研究收集到一個(gè)組織學(xué)特征高度相 似的兜甲蛋白角化病家系。應(yīng)用基因組掃描方法 ,利用 1 號(hào)染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)該家系進(jìn)行連鎖分析。在 到最大兩點(diǎn)連鎖 =0)，單體型分析將疾病基因定位在 1 號(hào)染色體 5圍內(nèi)，表皮分化復(fù)合物基因 (此區(qū)間內(nèi)。表皮分化復(fù)合物基因 (表皮的終末分化密切相關(guān)，選擇表皮分化復(fù)合物基因的成員絲聚合蛋白 (兜甲蛋白 (候選基因，因已報(bào)道 變導(dǎo)致尋常性魚(yú)鱗病， 變導(dǎo)致魚(yú)鱗病型合征。 對(duì)候選基因 部分編碼區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交界處進(jìn)行突變檢測(cè)，但 序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有致病性突變，因此 因不是博士學(xué)位論文 中文摘要 因突變檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 因的核苷酸 730 有單個(gè)核苷酸的插入 (730 基末端連續(xù) 6 個(gè) G 堿基后單個(gè) G 堿基插入（ 730致其后的甘氨酸環(huán)及高谷氨酰胺 改變了其后的 84 個(gè)氨基酸密碼子的編碼，并使終止密碼子延遲出現(xiàn)，導(dǎo)致突變型蛋白較野生型延長(zhǎng) 22 個(gè)氨基酸。 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，已報(bào)道在 6 個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)了 因 730同家系的兜甲蛋白角皮病患者的臨床表型具有多樣性。在本研究的魚(yú)鱗病家系中 個(gè)患者的小指上可見(jiàn)輕度的環(huán)狀縮窄，且 現(xiàn)趾斷癥 (自行離斷 (，其它患者表現(xiàn)為彌漫性魚(yú)鱗病皮膚病。 我們認(rèn)為兜甲蛋白角皮病的兩個(gè)特征是蜂窩狀掌跖角化病和彌漫性魚(yú)鱗病樣皮膚病， 兜甲蛋白角皮病可描述為 “一種由于兜甲蛋白突變導(dǎo)致的常染色體顯性遺傳的伴隨不同臨床表現(xiàn)的魚(yú)鱗病樣和蜂窩狀掌跖角化的皮膚病” 。 關(guān)鍵詞 ： 兜甲蛋白，兜甲蛋白角皮病，魚(yú)鱗病，突變檢測(cè) 博士學(xué)位論文 英文摘要 of is of 000 at In of be to a 80% of is as on of To 00 0 a of we a 07683) to a 8.8 cM of by a by 55a of ) be in 02460) 02121) of s 士學(xué)位論文 英文摘要 it is is Of 52 6 of of it is to in of on of of in 2D， 52 to be We 2 as . In 2 in in No in of in 108 of 5 of 08 士學(xué)位論文 英文摘要 in to of no As a to be it is in of in or it a is 士學(xué)位論文 英文摘要 I 30in as a 04117),or as a of a OR in a as We a by TR in . A od =0) 1in a 1511to To we of No 士學(xué)位論文 英文摘要 LG of in OR 30 (730 an of a G in an of 30of a at 32 4 a 2 In we be in by 士學(xué)位論文 目 錄 錄 中 文 摘 要. . . 文縮略詞表. . 要實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與耗材 . 一部分 遺傳性非綜合征耳聾(選基因的生物信息學(xué)分析與突變檢測(cè). 1 前 言. . 1 第一章 生物信息學(xué)方法分析 52 的候選基因 . 14 . 14 結(jié)果. . 23 分析與討論. 26 第二章 候選基因的突變檢測(cè) . 28 . 28 結(jié)果. . 30 分析與討論. 35 第一部分 結(jié)論. 3 7 參考文獻(xiàn). . 38 第二部分 因 730 突變導(dǎo)致的兜甲蛋白角化病 . 47 前 言. . 47 材料與方法. 52 結(jié)果. . 58 討 論. . 63 第二部分 結(jié) 論. . 66 參考文獻(xiàn). . 67 綜述 . . 70 參考文獻(xiàn). . 86 附錄 . . 94 致 謝. . 101 攻讀博士學(xué)位期間主要的研究成果 . 102 博士學(xué)位論文 英文縮略詞表 合征型耳聾 非綜合征型耳聾 常染色體顯性遺傳非綜合征耳聾 常染色體隱性遺傳非綜合征耳聾 核苷酸多態(tài) 3 非翻譯區(qū) 5 非翻譯區(qū) 本局部比對(duì)搜索工具 比對(duì)工具 碼區(qū) 核苷酸多態(tài)數(shù)據(jù)庫(kù) 因組 國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心 線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù) 合酶鏈反應(yīng) 參考序列數(shù)據(jù)庫(kù) 控性單核苷酸多態(tài) 堿性磷酸酶 常型魚(yú)鱗病 s 鱗病型 合征 行性對(duì)稱(chēng)性紅皮膚角化病 聚合蛋白 甲蛋白 LK 甲蛋白角皮病 博士學(xué)位論文 英文縮略詞表 劑與耗材 主要實(shí)驗(yàn)儀器 420 型恒溫空氣搖床 司 9600 司 9700 司 77 型 序儀 司 司 養(yǎng)箱 司 40 紫外分光光度儀 司 式低溫微量離心機(jī) 司 膠成像分析系統(tǒng) 司 描儀 司 速離心機(jī) 司 司 司 超凈工作臺(tái) 蘇州凈化工程公司 低電壓電源電泳儀 司 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng) 水平電泳儀 司 移液器 司 主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材 司 司 0.5 司 l 司 1.5 司 司 10 次性移液管 100l 司 10l 司 15 次性離心管 司 15 次性離心管 司 50 次性離心管 司 海試劑一廠(chǎng) 司 司 司 司 博士學(xué)位論文 英文縮略詞表 司 州桃源新亭化工廠(chǎng) 司 司 子 司 接酶 司 NA 司 司 冰醋酸 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司 丙三醇 上海祥德精細(xì)化工廠(chǎng) 丙烯酰胺 司 多聚 司 多聚甲醛 司 肝素鈉注射液 南京新天生物化學(xué)制藥有限公司 過(guò)硫酸胺 司 甲醛 湖南師大化學(xué)試劑廠(chǎng) 普通瓊脂糖、低熔點(diǎn)瓊脂糖 司 三氯甲烷 湖南師大化學(xué)試劑廠(chǎng) 無(wú)水乙醇 湖南師大化學(xué)試劑廠(chǎng) 主要試劑配制 名 稱(chēng) 各 組 成 成 分 用途 10 硼酸 加水至 108g 55g 40000丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖膠電泳緩沖液 博士學(xué)位論文 前言 1第一部分 遺傳性非綜合征耳聾( 選基因的生物信息學(xué)分析與突變檢測(cè) 前 言 耳聾概況 耳聾 (各種不同程度聽(tīng)力損失 (總稱(chēng)。外耳和中耳傳音結(jié)構(gòu)、內(nèi)耳感音器官及聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)通路上任何部位及附近的病變都可能引起耳聾。耳聾是一種嚴(yán)重影響人類(lèi)生活質(zhì)量的常見(jiàn)先天性疾病 , 它可以由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起 , 也可由環(huán)境因素 ( 如醫(yī)療因素 , 環(huán)境暴露 , 創(chuàng)傷 , 藥物等 )或基因和環(huán)境兩者共同作用而致。 聽(tīng)力損失是最常見(jiàn)的感覺(jué)障礙。在世界范圍內(nèi) , 每 1000 名新生兒中就有 1 名先天性耳聾患兒 , 50%患兒的耳聾與遺傳因素有關(guān)1,2。據(jù)中國(guó)殘疾人聯(lián)合會(huì)網(wǎng)站統(tǒng)計(jì) , 中國(guó) 6000 萬(wàn)殘疾人口中 2100 萬(wàn)為聽(tīng)力殘疾者，居殘疾人總數(shù)的首位。據(jù)人口調(diào)查統(tǒng)計(jì)，每年出生的新生兒中，重度聽(tīng)力障礙者約占 1 3。另外，隨著全球人口老齡化加速，耳聾的絕對(duì)發(fā)病率正在顯著增高。隨年齡增長(zhǎng)聽(tīng)閾差距增大，不同程度聽(tīng)力障礙者在人群中的比例， 45 64 歲為 14%， 65 75 歲為30%， 75 歲以上者高于 50%1,3。盡管近年來(lái)遺傳性耳聾研究領(lǐng)域有許多重要進(jìn)展 , 但耳聾相關(guān)的基因的定位、 分離、 克隆及基因的突變還有待于更深入的研究。 遺傳耳聾的分類(lèi) 導(dǎo)致聽(tīng)力損害的原因眾多，但大致可以分為兩大類(lèi)：環(huán)境相關(guān)因素和遺傳相關(guān)因素。前者包括耳毒性藥物（如氨基糖甙類(lèi)等）的使用，頭部產(chǎn)傷、外傷和腫瘤，各類(lèi)細(xì)菌和病毒感染（如出生前巨細(xì)胞病毒、弓形體和風(fēng)疹病毒等感染，出生后中耳炎和腦膜炎等） ，長(zhǎng)期處于噪聲環(huán)境以及早產(chǎn)、新生兒缺氧、低體重兒、嚴(yán)重的新生兒黃疸等。除以上原因外其中一半以上的聽(tīng)力損害是遺傳因素所致。 遺傳性耳聾是指由來(lái)自親代的致聾基因或新發(fā)生的突變致聾基因所導(dǎo)致的耳部發(fā)育異?；虼x障礙，以致出現(xiàn)聽(tīng)力障礙。遺傳性耳聾根據(jù)是否伴有耳外組織的異常或病變可分為綜合征性耳聾（ 非綜合征性耳聾（ ，其 中 30%左右，而 0%，非綜合征耳聾是最常見(jiàn)的感音神經(jīng)性聾。在 ，根據(jù)遺傳方式不同將遺傳性耳聾分為常染色體顯 性 (15% 20% )、常染色體隱性( 80% )、 性連鎖 ( - 1% ) 和線(xiàn)粒體遺傳性耳聾 (線(xiàn)粒體遺傳所占的比例在不同的人群中從 1 20%之間不等 )四類(lèi)，見(jiàn)圖 1 博士學(xué)位論文 前言 2圖 1兒童中學(xué)語(yǔ)前聾的病因分類(lèi) 另外，耳聾的分類(lèi)有很多種，比如根據(jù)其病變部位、性質(zhì)、程度和病因進(jìn)行不同的分類(lèi)。臨床最常用的是按病因及病變的 部位分類(lèi)，可分為傳導(dǎo)性聾(感音神經(jīng)性 (和混合性聾(種。傳導(dǎo)性聾指因外耳、中耳或咽鼓管病變，以及迷路骨性被囊的耳硬化癥導(dǎo)致聲波不能傳入內(nèi)耳所致的聽(tīng)力損失。感音神經(jīng)性聾為內(nèi)耳、耳蝸神經(jīng)、腦干聽(tīng)覺(jué)通路及聽(tīng)覺(jué)中樞病變所致聽(tīng)力損失的統(tǒng)稱(chēng)。混合性聾是指?jìng)鲗?dǎo)性和感音神經(jīng)性聾同時(shí)存在。 耳聾的程度根據(jù)純音測(cè)聽(tīng)所測(cè)得的言語(yǔ)頻率聽(tīng)閾的平均值進(jìn)行分類(lèi)， 可分為輕度聾 (26中度聾 (41中重度聾 (56 重度聾 (71極度聾 (90上 )。 根據(jù)發(fā)病時(shí)間可分為先天性聾和后天性聾，語(yǔ)前聾和語(yǔ)后聾。先天性聾指出生時(shí)或出生后不久就已存在的聽(tīng)力障礙，是胚胎期或圍生期致聾因素所致，其病因可分為遺傳性聾和非遺傳性聾兩大類(lèi)。 語(yǔ)前聾指重度先天性聾或在嬰幼兒期即失去聽(tīng)力者，由于不能通過(guò)語(yǔ)音交流接受言語(yǔ)信號(hào)，更無(wú)自身言語(yǔ)反饋，導(dǎo)致言語(yǔ)發(fā)育障礙，最終成為聾啞，多在出生時(shí)或一歲時(shí)發(fā)病，一般為非進(jìn)行性。在語(yǔ)前聾中，常染色體隱性遺傳是主要的遺傳方式，其危害也最為嚴(yán)重。語(yǔ)后聾指在言語(yǔ)形成之后失去聽(tīng)力者（一般在 6以后發(fā)?。?。 博士學(xué)位論文 前言 3耳聾基因的克隆與分類(lèi) 遺傳性耳聾在 16 世紀(jì)就有文獻(xiàn)記載，但由于內(nèi)耳部位深，體積小，研究手段受到限制，因此認(rèn)識(shí)和理解控制聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的基因研究進(jìn)展很慢。近 10 多年來(lái)，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，人們對(duì)遺傳性聾的認(rèn)識(shí)不斷加深，并取得了顯著進(jìn)步，與耳聾相關(guān)的基因的定位、分離、克隆及基因的突變得到深入的研究。 遺傳性聽(tīng)力損害具有高度的遺傳異質(zhì)性，根據(jù)目前的研究表明與 關(guān)的位點(diǎn)有 120 多個(gè)（ ） ，并根據(jù)遺傳方式和定位的先后進(jìn)行命名，以 別代表常染色體顯性、常染色體隱性、 X 連鎖和 Y 連鎖 點(diǎn)。有人估計(jì)，非綜合征型耳聾相關(guān)的位點(diǎn)可能超過(guò) 100 個(gè)，而綜合征型耳聾的位點(diǎn)可能多達(dá) 400 個(gè)5。 截止 2007 年 9 月，已定位了 77 個(gè)非綜合征型耳聾位點(diǎn)，其中常染色體顯性遺傳 50 個(gè)，常染色體隱性遺傳 67 個(gè)， 個(gè)， 個(gè)。并且克隆了 22 個(gè)常染色體顯性遺傳 因， 25 個(gè)常染色體隱性遺傳 因，2 個(gè) 鎖遺傳 因4()（如表 1 所示） ，其 中 7 個(gè)基因突變既可以導(dǎo)致 外還有 11 個(gè) 因突變也可以導(dǎo)致 于一個(gè)特定的 點(diǎn)，可能不止一個(gè)耳聾致病基因，如 這提示染色體上特定區(qū)域有成簇耳聾基因的存在。 眾多的位點(diǎn)被定位也說(shuō)明了 有相當(dāng)高的遺傳異質(zhì)性。通常，常染色體顯性遺傳的耳聾表現(xiàn)為學(xué)語(yǔ)后聾，聽(tīng)力損失或輕或重，可單獨(dú)累及某個(gè)頻率段或各個(gè)頻率段，病程發(fā)展多呈進(jìn)行性；而呈常染色體隱性遺傳的耳聾表現(xiàn)為學(xué)語(yǔ)前聾，聽(tīng)力損失一般為中、重度以上，全頻聽(tīng)力損失多見(jiàn)。 這些耳聾基因編碼的產(chǎn)物分屬不同的蛋白家族：包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，肌球蛋白和其他骨骼肌蛋白，間隙連接蛋白和離子通道，以及轉(zhuǎn)錄因子和一些功能未知的基因表達(dá)產(chǎn)物。它們涉及聽(tīng)力器官的胚胎期發(fā)育、功能單位的形成、正常功能的維持等多個(gè)方面。從 因產(chǎn)物的功能方面， 因分為五類(lèi)。 蒂器的毛細(xì)胞上覆蓋的蓋膜在感覺(jué)傳導(dǎo)機(jī)制中扮演了重要的角色。 它產(chǎn)生剪切力使毛細(xì)胞上纖毛束彎曲從而打開(kāi)離子通道，引發(fā)產(chǎn)生聽(tīng)力的一系列反應(yīng)。蓋膜由膠原纖維和非膠原纖維的基質(zhì)組成，而后者的主要成分是 將蓋膜及其他內(nèi)耳外膠質(zhì)成分和它們下面的非感覺(jué)細(xì)胞相連系的是耳錨蛋白 ( 博士學(xué)位論文 前言 4表 1常染色體顯性遺傳及常染色體隱性遺傳耳聾基因 編碼胞外基質(zhì)的基因有：編碼 - 的 2 相關(guān) )；編碼膠原 肽亞單位 2 的 變導(dǎo)致 合征 2 型和 合征 )；編碼耳錨蛋白的 關(guān) ); 與 關(guān) )及