前 言 口腔頜面部惡性腫瘤中以癌最為常見，而在口腔癌中，以鱗狀細胞癌最為常見，占 80%以上 1，是全球第五大最常見的癌癥 2。舌鱗狀細胞癌 （ 稱舌癌。據(jù)統(tǒng)計，在口腔頜面鱗狀細胞癌排第一位 3。近年的研究亦表明，舌癌的發(fā)生率有上升的趨勢，且發(fā)病年齡趨于年輕化。舌癌一般惡性程度較高，生長快，浸潤性強，波及舌肌，致舌運動受限，影響說話、進食。舌癌晚期波及口底、下頜骨，向后侵及腭舌弓及扁桃體；侵及舌根部或伴繼發(fā)感染時發(fā)生劇烈疼痛。舌癌的發(fā) 病是多因素參與、多階段中形成的，具體的發(fā)展機制目前尚未研究清楚，長期的臨床觀察與研究得出舌癌的發(fā)病與物理因素、化學因素、生物因素、神經(jīng)因素、內(nèi)分泌因素、遺傳因素、營養(yǎng)因素、基因突變等有關 4。對于惡性腫瘤或舌癌的治療，是一個綜合性序列治療 5，以手術為主聯(lián)合其他治療，根據(jù)患者的具體情況實施治療方案。一般來說，手術切除原發(fā)病灶，但對于較大的腫瘤，可以先利用放射治療或化學藥物治療使其縮小，待其縮小再行手術治療；放射治療雖可以很好控制原發(fā)病灶，保存了器官的功能，但對頸部淋巴結的轉移的治療不理想，可以術前放射提 高切除率，減少復發(fā)；手術解決的是局部病灶及手術可涉及范圍內(nèi)的病灶，但對于已有遠處轉移病例的治療或在預防復發(fā)方面是無能為力的，這時依靠化學藥物治療或生物治療具有一定的療效。另外，利用中藥治療配合手術治療、放射治療和化學治療可起到很好的治療效果，因為中藥治療能提高免疫功能，從而起到提高和鞏固療效的作用 6。 祖國醫(yī)學博大精深，古老而又年輕，在世界范圍內(nèi)正經(jīng)歷著迅猛的發(fā)展。已經(jīng)證實，有數(shù)百種中藥材具有抑制腫瘤癌細胞生長的作用，因中藥毒副作用小且又能有效增強人體免疫能力等特點，加之近年醫(yī)學分子生物學、中藥藥理學的 大發(fā)展，中藥用于腫瘤方面的研究愈來愈受到世界各國研究者的青睞。在中藥用于口腔頜面鱗狀細胞癌研究方面，不乏報道，諸如百安、參陽、芪藍、黃岑素、清瘤亮喉等在體外實驗研究、治療或輔助治療口腔鱗癌中，均顯示出了明顯的殺腫瘤作用 7 蘇木（ 別名 蘇枋、蘇方、蘇方木、棕木、赤木、紅柴、紅蘇木、落文樹 ，中華傳統(tǒng)中藥材，在唐本草、本草拾遺、本草綱目等著名中醫(yī)典籍均有收錄，在中華人民共和國藥典中有收錄 14。蘇木在我國產(chǎn)于兩廣地區(qū)、云貴地區(qū)及臺灣 地區(qū)，國外產(chǎn)地多見于緬甸、泰國等東南亞地區(qū)及南美洲的巴西等國 15。蘇木功能主治 活血祛瘀 、 消腫定痛 、 血滯經(jīng)閉 、 痛經(jīng) 、 產(chǎn)后瘀阻心腹痛 、 產(chǎn)后血暈 、 癰腫 、 跌 打損傷 、 破傷風 等 。在日常生活中，蘇木提取物被廣泛用于食品行業(yè)用于天然色素劑的添加 ， 在染色行業(yè)用于輕紡工業(yè) ， 在臨床上和實驗室里和伊紅一起用于組織切片 色。隨著分子生物學、中藥藥理學等學科的大發(fā)展，蘇木除傳統(tǒng)的藥用價值外，其提取物還具有舒張血管、抗氧化、抗驚厥、降低血糖、免疫抑制、對 有一定的抑制等作用及抗腫瘤作用 16蘇木提取物 具有抗腫瘤作用的最早報道見于二十世紀七十年代，日本學者利用蘇木提取物體外實驗研究作用于人白血病 胞，隨著蘇木提取物的濃度的增加， 胞增殖受到抑制作用增強，初次表明蘇木提取物具有抗癌作用 24。此后包括國內(nèi)學者陸續(xù)研究得出蘇木提取物對人白血病 胞株、胃癌細胞、人肝癌細胞 植瘤、卵巢癌細胞胞株具有抑制增長的作用，具有抗癌的功效 25但此時的研究都是以蘇木提取物為一個整體來研究的，蘇木提取物是個混合物，具體有哪些成分，哪些成分具有抗癌作用再次引起眾多學者興 趣。經(jīng)研究，蘇木提取物中成分眾多，具體分為五大類：蘇木素類、原蘇木素類、蘇木查耳酮類、苯丙素類和高異黃酮類，而這五大類中又分小類 。 到目前為止，已測得的蘇木提取物中成分大概有 60 多種 29國內(nèi)學者賴鎮(zhèn)源在蘇木提取物中分離各單一的化合物分別作用人白血病 胞和人腦膠質瘤胞的實驗中得出蘇木中氧化蘇木素、 336。 圖 1 巴西蘇木素結構式 分子式 莉莉等分析蘇木抗癌的有效成分，并利用這些有效成分對人膀胱癌 蘇木素類中的主要成份，對人膀胱癌 胞具有顯著的抑制作用；抑制移植裸鼠體內(nèi)瘤體的生長，證明了巴西蘇木素能誘導膀胱癌細胞發(fā)生凋亡 37。通過對 數(shù)據(jù)庫的搜索，尚未見蘇木、蘇木提取物及蘇木提取物后的有效抗癌成分在口腔癌方面的研究，巴西蘇木素用于口腔癌方面的研究亦未見報道，鑒于此，本課題將巴西蘇木素用于口腔鱗狀細胞癌的研究，為臨床治療提供一定的理論基礎。 平陽霉素（ 稱 是我國自 行研發(fā)生產(chǎn)的一種與博萊霉素相近的抗生素， 博萊霉素為復合藥，主要成份為 單一組分 以又稱平陽霉素為博萊霉素 一種抗生素類抗腫瘤藥物，是博萊霉素類抗腫瘤藥物的一個品種 38。 平陽霉素為細胞周期非特異抗腫瘤藥物，具有抗腫瘤活性強、抗腫瘤譜廣等特點。其抗腫瘤的 作用機制亦與 博萊霉素 相似，主要抑制 胸腺嘧啶核 摻入 合 后 ，破壞 板，阻止 制 ,從而促使腫瘤細胞 變性、 發(fā)生 壞死 ,具有細胞毒性；除此之外，近幾年相關學者經(jīng)研究證實平陽霉素殺腫瘤細胞的機制還包括誘導細胞凋亡 39。 平陽霉素口服無效，需在靜脈注射、靜脈點滴、肌肉注射或瘤腔注射，靜脈注射后 30 分鐘血液中藥物濃度達到最高峰，其后迅速下降，廣泛地分布在肝、脾、腎、皮膚等組織中，在組織中經(jīng)酰胺酶水解，經(jīng)腎臟排泄，成人半衰期 為 時；在化療時成人每次劑量8周給藥 2，一個療程的總劑量為 240研究表明，對 大腸癌細胞 、 裸鼠移植的人肝癌和胃癌 和 裸鼠移植的食管癌和鼻咽癌，平陽霉素有很好的抗瘤體生長作用 40從 1978 年被應用于臨床以來，平陽霉素在大量的臨床應用研究中取得了很好的效果，臨床回顧性研 究分析表明，平陽霉素抗癌譜廣，對 乳腺癌 、皮膚癌 ，肝癌 、 食道癌 、 宮頸 癌、陰莖癌、外陰癌 、 壞死肉芽腫 、 惡性淋巴肉瘤 及頭頸部各部位鱗狀上皮癌等有效，是一種目前在臨床上普遍使用的抗腫瘤藥物 ,此外在對翼狀胬肉、尖銳濕疣的治療也有較好的治療效果 43平陽霉素在口腔臨床應用或是口腔實驗室中應用均很廣泛，最常見的就是平陽霉素治療頜面部血管瘤，將稀釋的平陽霉素注射進瘤腔，破壞血管內(nèi)皮細胞的生長，使血管瘤退化，在國內(nèi)的研究中得到研究者們的肯定，此外還見報道用于治療舌淋巴管瘤和舌下腺囊腫。在治療口腔鱗狀癌方面，平陽霉素 是很常見一種化療藥，在口腔的術前化療及術后化療中起到了一定的作用。平陽霉素局部或全身用藥后，其不良反應也是不可忽視的，可引起肺炎或肺纖維化、高熱、皮膚反應 （皮疹 、 皮炎、色素沉著、角化增厚） 、胃腸道反應、肢體麻木、多發(fā)、口腔炎、過敏等反應，近幾年有報道使用平陽霉素可引起嚴重的過敏性休克，值得臨床醫(yī)生警惕 47。平陽霉素的實驗室的研究多用于新藥的對比測試，鑒于此，本研究亦使用平陽霉素做實驗研究的對照組。 在藥物作用細胞的抑制增長實驗中， 色法 能檢測出藥物對細胞毒性和藥物作用后對細胞殺傷力的變化，這種方法 的 原理是活細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶與 用后形成藍紫色結晶后被二甲基亞砜溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀下特定的波長下測定光吸收值，間接反映藥物作用后活細胞的數(shù)量，從而能間接反映藥物對細胞的殺傷力。目前 色法是一種篩選抗腫瘤藥物最佳作用濃度、作用時間和相關毒理實驗的常用的檢測手段，具有操作簡單、經(jīng)濟適用等特點。流式細胞術（ 以流式細胞儀為工具，檢測藥物作用細胞后細胞的大小和內(nèi)部的狀態(tài)等一般理化性質，還可通過對細胞體積、 量及特異性抗原基因測定 等分析細胞的凋亡情況，通過不同的染色方法確定檢測 細胞 凋亡還是測細胞周期，對測定的細胞凋亡結果和細胞周期分布結果分析后，可間接判斷 被 檢測細胞的 增殖狀態(tài)，從而反映 對細胞的增殖抑制作用。 聚合酶鏈反應 ( 80 年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術 ， 具有易自動化 、 特異、敏感、快速、重復性好、等突出優(yōu)點 。 （ 逆轉錄 將 逆轉錄（ 靈敏且用途 廣泛，用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中 量和直接克隆特定基因的 列等。 普通 區(qū)別是在 應體系中使用熒光染料，在擴增反應中，對熒光信號的實時監(jiān)測來記錄整個 進程，得出記錄曲線，從而對起始模板 定量分析。從以上所述出發(fā)，本實驗運用 測 平陽霉素 、 巴西蘇木素分別作用 胞 對細胞 增殖能力的影響；流式細胞術檢測 平陽霉素 、 巴西蘇木素及兩者聯(lián)合后細胞凋亡率；實時熒光定量 測 凋亡基因 達水平 ，觀察平 陽霉素及巴西蘇木素體外對 胞增殖及凋亡的作用，為口腔鱗狀細胞癌臨床用藥提供理論依據(jù)。 實驗部分 一 材料與方法 驗對象 人舌癌細胞株（ 上海交通大學第九人民醫(yī)院建系 ， 蘭州大學第一醫(yī)院分子實驗中心凍存。 要儀器和設備 電子天平 上海天平廠（中國上海） 恒溫水浴箱 上海醫(yī)療器械七廠 （中國上海） 壓力蒸汽滅菌器（ 日本 ) 定時恒溫磁力攪拌器 武漢格萊莫檢測設備有限公司（中國湖北） 電熱恒溫鼓風干燥箱（ 上海柏欣儀器設備廠 (中國上海 ) 超凈工作臺 （ 吳江凈化設備公司（中國江蘇） 細胞培養(yǎng)箱（ 上海智靈醫(yī)藥科技公司（中國上海） 超低溫冰箱 （ 702型） 司 (美國 ) 普通光學顯微鏡 司（日本） 倒置顯微鏡（尼康 本） 小型離心機（ 海門市其林貝爾儀器制造有限公司（中國江 蘇） 臺式 低溫高速離心機 國） 超純水設備 美國） 4和 下層冰箱 （ 日本 ) 酶聯(lián)免疫檢測儀 華東電子醫(yī)療裝備有限公司（中國江蘇） 漩渦震蕩儀（ 上海滬西分析儀器廠（中國上海） 流式細胞檢測儀（ L） 國） 實時 熒光 定量 (80) 國） 冰盒 司 (日本 ) 要試劑及配制 注射用鹽酸平陽霉素 8 天津太河制藥有限公司（中國天津） 巴西蘇木素 10上海銘睿生物科技有限公司 (中國上海 ) 青霉素 華北制藥總廠（中國河北） 鏈霉素 華北制藥總廠（中國河北） 小牛血清 杭州四季清公司 （中國杭州） 胰蛋白酶 上海華美公司（中國上海） 養(yǎng)基干粉 國） 二甲基亞砜 (國） 四甲基偶氮唑藍 （ 國） 染 試劑盒 國） 無水乙醇 天津凱通化學試劑公司（中國天津） 異丙醇 天津凱通化學試劑公司（中國天津） 氯仿 天津凱通化學試劑公司（中國天津） 上海生工生物公司 （中國上海） 引物設計 大連寶生物工程有限 公司 （中國大連） 引物 合成 大連寶生物工程有限 公司 （中國大連） RT 連寶生物工程有限 公司 （中國大連） x 大連寶生物工程有限 公司 （中國大連） 連寶生物工程有限 公司 （中國大連） 中國北京） 陽霉素溶液的的配制：用 5管吸取 4菌注射用水（臨床上供溶解頭孢曲松鈉用），注入密封好的 8平陽霉素的小瓶中（在此過程嚴格要求無菌），充分溶解，再回吸溶解后的溶液，濃度為 2mg/為母液注入到已經(jīng)消毒好的青霉素小瓶中，密封封口，置于 20 冰箱中，待用。 西蘇木素溶液的的配制：同平陽霉素的配制方法和步驟類似，操作過程要注意無菌，均在無菌超凈臺中進行，將密封好的濃度為 2mg/母液巴西蘇木素置于 20 冰箱中，待用。 養(yǎng)液的配制： 取兩袋 粉劑 共 取碳酸氫鈉 霉素和鏈霉素各兩支，均倒入 3000量瓶中，加雙蒸水定容至 2000置在磁力震蕩攪拌器上充分攪拌至充分溶解，調(diào)節(jié) ， 在超凈工作臺中用滅菌好的過濾器過濾后封裝于無菌的 250格的玻璃瓶中，置于4 冰箱中，待用。 小牛血清的滅活：從 20 冰箱 中取出小牛血清，放在常溫下任其解凍，再在恒溫水浴箱中 56水浴半個小時，封裝在容積大約 10右的小瓶中，密封好后置于 4冰箱中，待用。此過程要求在超凈工作臺中無菌操作。 沖溶液的配制：用電子天平稱取氯化鈉（ 化鉀（ 酸氫二鈉（ 酸二氫鉀（ 接倒入容量瓶中 ，加入雙蒸水定容至 1000置在磁力震蕩攪拌器上充分攪拌至充分溶解，即配制成 沖溶液。 蛋白酶溶液的配制 :用電子天平稱取 蛋白酶粉末，量筒量取事先配制好的 液 100室溫下充分溶解，用 0右小瓶中，置于置于 4 冰箱中，待用。此過程亦要求無菌操作。 液的配制：用電子天平稱取 末 (最好避光操作 )，量筒量取事先配制好的 液 100起倒入容量瓶中，容量瓶外套一個黑色塑料袋避光， 放置磁力震蕩攪拌器上充分攪拌至充分溶解后，轉移至超凈工作臺，關掉燈管光，在用 P 管中，置于 4 冰箱中可保存兩周，置于 中可長期保存。 冷乙醇溶液的配制：用量筒量取無水乙醇 70后逐漸加入雙蒸水至 100可得冷乙醇，濃度為 70%的冷乙醇，倒入大玻璃瓶中，置于 4 冰箱中保存。 的配制 :用量筒量取 1000蒸水，倒入玻璃瓶中，往玻璃瓶中加入 1勻，避光后使用。 理水的配制：量取 1000 蒸水與 1入玻璃瓶中混合均勻后，置于 121 的壓力蒸汽滅菌器的 30樣去除殘留的 得到 理水。 驗方法 胞的復蘇、培養(yǎng)與凍存： 備好細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶等試驗器材，在紫外燈下消毒 30液氮中取出冷凍好的 胞，立即放在恒溫水浴箱中37 的水溫條件下水浴，細胞凍存液完全溶解后，在超凈工作臺中將凍存液轉移 至離心管中，在離心管中加入 10養(yǎng)液。然后對離心管進行離心（ 1000r/分鐘 ，離心完畢，倒掉離心管中的上清，用 5頭吸取 9養(yǎng)液和 1小牛血清，反復輕輕吹打離心管底部，使離心后的細胞重新混勻，吸取混勻后的細胞混合液到 75消毒好的玻璃培養(yǎng)瓶中，松松地旋上瓶蓋，將其平放在恒溫培養(yǎng)箱中，恒溫培養(yǎng)箱應保持在 37 和 5 恒定條件。隔日應在倒置顯微鏡下觀察細胞，觀察細胞是否已經(jīng)貼壁生長，及時更換培養(yǎng)液，一般在培養(yǎng)傳代兩三代，待細胞貼壁生長穩(wěn)定后可用于實驗。 胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，生長旺盛，在倒置顯微鏡下觀察，可見細胞鋪滿大部分培養(yǎng)瓶底， 這時從培養(yǎng)箱中取出，倒出培養(yǎng)瓶中液體，加入 蛋白酶進行消化，在倒置顯微鏡下觀察細胞間隙，當細胞間隙變大，加入 1止胰蛋白酶過度消化細胞，再加入 9養(yǎng)液，用 5輕輕地吹打培養(yǎng)瓶底，如此反復數(shù)次，留取 1胞液，加入血清和培養(yǎng)液繼續(xù)傳代培養(yǎng)。剩下的 9胞液收取至準備好的離心管內(nèi)，放在離心機中離心，棄去離心后的上清，加入備好的細胞凍存液，再次輕輕地吹打，使離心后的細胞重新混勻，分裝到無菌的細胞凍存管中，用膠布密封好凍存管的蓋子，將其放在 4 冰箱 一小時，再移至 冰箱兩小時后，用一層厚厚的棉卷裹好凍存管，放置于 冰箱中過夜或者不超過三天，標記好細胞的名稱、凍存日期及操作人員后，放入液氮罐中，備用。 檢測巴西蘇木素、平陽霉素對 胞增長抑制作用 : 陽霉素的母溶液，均為 2mg/照實驗設計的需要，將巴西蘇木素配成一定梯度溶液組，即 50ug/100ug/50ug/200ug/陽霉素配成一定梯度溶液組，即 1ug/10ug/00ug/ 胞，調(diào)節(jié)細胞溶液濃度，以 4105個 /密度接種于 96 孔板中。 6 孔板中中間豎行設計空白對照組 ,此組不加藥，空白組兩側從低到高分別加入一定梯度巴西蘇木素溶液組，即 50ug/100ug/150ug/00ug/一定梯度平陽霉素溶液組，即 1ug/10ug/100ug/組設置 5 個復孔，總體系 200 4h、 48h、 72h。 E、在相應的時間內(nèi)，在 96 孔板中每孔加入事先配制好的 液 10光操作），再放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h。 6 孔板傾斜放置，小心吸取溶液，完畢各孔均加入 150甲基亞砜 ，放在震蕩器上震蕩 10 于酶聯(lián)免疫檢測儀中，以 570長檢測各孔的光吸度值。 5 孔平均值，按照公式，抑制率)=(對照組數(shù)值 ) 100%，繪制出藥物濃度與生長率關系曲線，依據(jù) 選出確定巴西蘇木素與平陽霉素的最佳作用藥物濃度。各組實驗均需重復三次 。 式細胞儀檢測藥物作用后細胞凋亡率： 檢測藥物濃度后，利用檢測計算后的結果，在流式細胞術中設計實驗組，及空白對照組（未加入藥物，只加等體積培養(yǎng)液）、巴西蘇木素組(150ug/平陽霉素組 (10ug/巴西蘇木素與平陽霉素聯(lián)合組 (150ug/10ug/積各一半 )。 2h，之后胰蛋白酶消化細胞，將四組細胞收集于離心管中，放在離心機中以 1000r/4 環(huán)境中離心 5 分鐘，倒掉上清，用滌至清亮為止，但不宜清洗次數(shù)過多，以免 破壞正常細胞，一般清洗兩次即可，最后倒掉上清。 若不能檢測，可向離心管中加入70冷乙醇 1行固定，放置 4 冰箱過夜。 染試劑盒染色，在細胞懸浮液中加入 5輕混勻后于 2避光條件下孵育 15 分鐘，再加入 10輕輕混勻于 2光條件下孵育 5 分鐘。 式細胞儀激發(fā)波長采用 488測收集的波長為 630 時熒光定量 檢測細胞中 將所有使用的實驗器具嚴格刷凈消毒，除去污染的 ，玻璃器具置于 180 下干烤一個小時，塑料器具用 處理，然后再在 120中高壓半小時，除去殘留的 基因庫中查找目的基因 內(nèi)參基因 （ 基因序列，采用專業(yè) 上海生物工程公司進行合成。 因引物： 正義鏈： 5反義鏈： 5因引物： 正義鏈： 5反義鏈： 5 因引物： 正義鏈： 5反義鏈： 5C. 設計實驗組，及空白對照組（未加入藥物，只加等體積培養(yǎng)液）、巴西蘇木素組 (150ug/平陽霉素組 (10ug/巴西蘇木素與平陽霉素聯(lián)合組(150ug/ 10ug/積各一半 )，均作用 72h。 作過程中應采取嚴格的措施，防止污染提取物作用 72h 小時后，向各實驗組的瓶中各加入 00l，用 移液槍反復吹打，混勻，應無明顯沉淀，然后放在室溫下靜置 5此時的細胞裂解液移至 中，再向各組 中加入 160l 氯仿，蓋緊蓋子，用手捏緊，防止蓋子彈開，使勁搖晃震蕩 15s，至 中溶液未見明顯分層，放在室溫中放置 5各組 放置離心機中 4 以 12000g 的條件離心 15 分鐘，可見管內(nèi)液體從上至下分為三層，即無色上清層、白色蛋白質層、紅色有機層。將無色上清層小心吸取并轉移至新的 中。在各組新的 中加入與中上清液等體積的異丙醇，蓋緊 蓋子，進行上下顛倒使其充分混勻，放在 室溫中靜置 10 分鐘，靜置之后再次將各組 放置離心機中 4 以 120000 分鐘，離心之后取出各組 ， 的底部可見有沉淀物，吸掉沉淀物上層的上清液，在各組 中加入 75%的乙醇 1緊 蓋子，進行上下顛倒，接著將各組 放置離心機中 4 以 12000g 的條件離心 5 分鐘，取出后吸掉上層的乙醇，不能碰到沉淀部分，置于室溫中進行干燥（充分揮發(fā)乙醇） 10，再向各組 中加入 20 l，輕輕吹打沉淀使其溶解充分，此時可將這時的 中 取物放在 冰箱中進行長期保存。 1 試劑盒組分 試劑盒組成 使用總體積 (25 次 ) 5l 50l 10 M） 60l 10 M） 60l ml 0 l 反應體系： 表 2 總體系為 20l， 需在低溫下操作， 反應組分 如下 ： 組成成分 使用體積 l 2l 10 M） 2l 1l l 模板 l 按照比例在冰上將總 釋成實驗要求的模板量，根據(jù)反應系的要求配置溶液，充分混勻后放在震蕩器上震蕩，再進行離心，放在冰板上，再加入已經(jīng)稀釋好的模版 勻，震蕩，再次進行離心，放在 器中，在 37 恒溫條件下 孵育 60 分鐘，得到 表 3 反應體系： 試劑組分 使用體積 終濃度 x （ 2） 10l 1 . 2M*1 板 2l *2 總體系 20l 增程序： 表 4 在本實驗中 增 使用了 3步法 ， 反應條件如下： 階段 溫度 /時間 重復 預變性 95 30s 1 95 5s 62 20s 40 溶解曲線分析 95 10 30s 反應結束后，對記錄各實驗組的擴增曲線和溶解曲線進行數(shù)據(jù)分析。 計學處理 所 有實驗均需要重復三次， 數(shù)據(jù)整理后，計量資料均以 x s 表示 ,件和 件 對所有數(shù)據(jù) 進行處理， 用 件繪圖，以雙側 p p斷統(tǒng)計學意義及顯著性水平。各組間數(shù)據(jù)比較采用兩樣本的 t 檢驗及多樣本單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理。 二 實驗結果 測巴西蘇木素與平陽霉素作用 胞的生長抑制作用 西蘇木素作用 胞 不同濃度的巴西蘇木素（ 50ug/100ug/150ug/200ug/在恒定的時間內(nèi)對 胞的增殖影響不同，濃度越高，抑制作用越強；同種濃度下的巴西蘇木素在不同的時間（ 24h、 48h、 72h）對 胞的增殖影響不同，時間越長，抑制作用越強，濃度為 50ug/作用 24h 無明顯影響（ p隨時間延長和濃度增高，抑制率增高。隨時間延長和濃度增高，抑制率增高。根據(jù)增殖抑制率可算出 72 小時 146ug/近 150ug/作為本實驗 巴西蘇木素的最佳作用濃度。各時間段各濃度下增殖抑制率如表 5，抑制率曲線如圖 2 表 5 各濃度巴西蘇木素各時間點細胞增殖抑制率（ %）（ X S ）（ n=3） 組別 24 小時 48 小時 72 小時 對照組 0ug/100ug/ 150ug/ 200ug/ *與對照組相比， P *與對照組相比， P 圖 2 各濃度 時間點細胞增殖抑制率曲線圖 陽霉素作用 胞 不同濃度的平陽霉素（ 1ug/10ug/100ug/在恒定的時間內(nèi)對 胞的增殖影響不同，濃度越高，抑制作用越強；同種濃度下的平陽霉素在 不同的時間（ 24h、 48h、 72h）對 胞的增殖影響不同，時間越長，抑制作用越強，濃度為 作用 24h 無明顯影響（ p 隨時間延長和濃度增高，抑制率增高。根據(jù)增殖抑制率 72 小時 16ug/近 10ug/作為本實驗平陽霉素的最佳作用濃度。各時間段各濃度下增殖抑制率如表，抑制率曲線如圖 表 6 各濃度平陽霉素各時間點細胞增殖抑制率（ %）（ X S ）（ n=3） 組別 24 小時 48 小時 72 小時 對照組 1ug/ 10ug/ 100ug/ *與對照組相比， P *與對照組相比， P 圖 3 各濃度 時間點細胞增殖抑制率曲線圖 式細胞術檢測的細胞凋亡 流式細胞術結果顯示，作用 72h 后，與空白組（ A）相比，巴西蘇木素組 (B)、平陽霉素組 (C)以及聯(lián)合組 (D)的細胞凋亡率都顯著提高 （ p，且顯示聯(lián)合組的細胞凋亡率明顯高于其它兩組，其細胞凋亡如表 7， 如圖 4、 5、 6、 7。 表 7 各組別的細胞凋亡率 組別 細胞凋亡率（ %） （ x s ） 空白組（ A） 西蘇木素組 (B) 平陽霉素組 (C) 聯(lián)合組 (D) 注： 表示與空白組比較：表示 p顯著性差異。 表示 D 與 B、 示 p顯著性差異。 圖 4 圖 5 圖 6 圖 7 測結果 測 因的溶解曲線和擴增曲線（見圖 8、 10）， 因的擴增曲線和溶解曲線（見圖 9、 11），均顯示溶解曲線為單峰，無明顯雜峰，顯示引物特 異性良好，擴增效率高 圖 8 因的溶解曲線 圖 9 因的溶解曲線 圖 10 因的擴增曲線 圖 11 因的擴增曲線 達量的檢測結果 果顯示， A、 B、 C、 D 組的 A、 B、 C、 D 組的 巴西蘇木素組單獨用藥、平陽霉素組單獨用藥，巴西蘇木素與平陽霉素聯(lián)合組用藥與空白組相比，胞的 對表達量明顯升高（ p 72 小時內(nèi)巴西蘇木素聯(lián)合平陽霉素組細胞的 達水平明顯高于其它幾組（ r=（見圖 12、 13）。 圖 12 各組 相對表達量 圖 13 各組 相對表達量 三 討 論 舌癌是口腔頜面部嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤 ,其發(fā)病率和病死率居口腔頜面部惡性腫瘤之首 ,發(fā)展快 ,復發(fā)率高 ,愈后差，舌癌的治療主要以手術治療為主，其他治療方法積極配合 的綜合性治療 48。就目前來看，化學治療在舌癌治療中整個過程中 能 有效地控制原發(fā)灶、防止復發(fā)、減少轉移機會等 49。近年醫(yī)學分子生物學、中藥藥理學的大發(fā)展，已經(jīng)證實有數(shù)百種中藥有抑制腫 瘤 細胞生長作用。巴西蘇木素是從傳統(tǒng)中藥材蘇木中提取的， 已有研究證明其對多種腫瘤具有抑制作用。對于舌癌的化學治療，方式多采用聯(lián)合用藥 模式，可以有效地延緩患者的 存活期 50 平陽霉素已經(jīng)廣泛地應用于臨床舌癌患者的化學 治療中，在平陽霉素作用胞增殖抑制實驗中，隨著平陽霉素藥物濃度的增強， 對 胞的增殖抑制作用越強；隨著作用時間的延長， 胞的增殖抑 制作用亦增強。這說明平陽霉素具有抑制 長的作用，與眾多學者 的研究 結果是相一致的 5439。巴西蘇木素作用 胞增殖實驗中， 其 抑制趨勢與平陽霉素作用 同，隨著巴西蘇木素藥物濃度的增強， 胞的增殖抑制作用越強；隨著作用時間的延長， 胞的增殖抑制作用越強。不同靶點藥物聯(lián)合應用化療可以增強化療藥的殺傷作用，從而可以在較低濃度的情況下應用，減少了耐藥的產(chǎn)生及藥物的毒性，藥物聯(lián)合作用大于相加為協(xié)同作用，聯(lián)合作用小于相加為拮抗作用，隨著藥物不同 的濃度的匹配，協(xié)同或拮抗的作用不同。 指被抑制一半時抑制劑的濃度，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導腫瘤細胞凋亡 50%，該濃度稱為 50%抑制濃度，即凋亡細胞與全部細胞數(shù)之比等于 50%時所對應的濃度， 可以用來衡量藥物誘導凋亡的能力，即誘導能力越強，該數(shù)值越低， 在 驗中，巴西蘇木素 72 小時 146ug/近 150ug/為本次實驗最佳作用濃度 , 平陽霉素 72 小時 16ug/近 10ug/為本次實驗最佳作用濃度，與前人作出的實驗結果是相符合的。本實驗 在接下來的實驗中利用 驗中得出的巴西蘇木素和平陽霉素得出的時的藥物濃度，聯(lián)合應用，分組后測凋亡率與相關凋亡基因的表達。 細胞凋亡 (又稱為程序性死亡，是機體生長、分化、發(fā)育和病理過程中由基因編碼調(diào)控的細胞主動消亡過程。在細胞凋亡的早期，磷脂酰絲氨酸（ 從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中 一種分量為 3536 賴性磷脂結合蛋白，能與親和力特異性結合 56將 行熒光素（ 標記了的 為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶 (I)是一種核酸染料，它不能透過 完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞， 夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將 配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來 58。本實驗中利用流式細胞術測得結果顯示，與空白對照組（ A）相比，巴西蘇木素組（ B）、平陽霉素組（ C）、聯(lián)合組（ D）細胞凋亡 率顯著提高，具有顯著性差異（ p而 D 組細胞凋亡率又明顯高于 B 組合 C 組，具有顯著性差異（ p B 組和 C 組之間細胞凋亡率差異不明顯（ p 提示巴西蘇木與平陽霉素一樣，具有促進 胞凋亡的作用，聯(lián)合用藥后，這種促進細胞凋亡的作用增強，優(yōu)于單獨用藥的作用，巴西蘇木素誘導 亡的作用有望成為目前尋找治療舌癌新藥的熱點，而巴西蘇木素與平陽霉素的聯(lián)合應用于治療舌癌的研究也是很有必要。至于藥物作用哪一周期，本實驗未給予測定明確的作用周期，說明該實驗還有擴展的空間，可設 置巴西蘇木素影響胞的細胞周期的相關實驗。 近年來，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（ 族是細胞凋亡研究的熱點， 認為是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者。細胞凋亡從內(nèi)外多因子復雜的相互作用誘導產(chǎn)生凋亡信號，傳遞至 使其活化開始，以蛋白底物裂解、細胞解體為結局，從而使細胞凋亡得以完成，而 細胞凋亡的信號途徑中，處于細胞凋亡的下游，是凋亡的主要效應分子 59 4、 5、 11、 12、 13、 14作為細胞因子處理組，參與炎癥反應和參與前炎性介質的成熟； 8、9、 10 作為凋亡起始組，激活 白酶截斷或降解凋亡底物； 、 7 作為凋亡效應組參與細胞的凋亡激活 識別切割底物 61。 引起細胞的凋亡途徑有兩條：一是死亡受體途徑，死亡受體主要包括 化生長因子受體（ 腫瘤壞死因子受體（ 族，在凋亡又到信號的作用下，死亡受體 與配體結合，激活上游的 要是而激活下游的效應 是線粒體途徑，在細胞內(nèi)外各種死亡信號的誘導下，線粒體釋放細胞色素 C,細胞色素 C 與凋亡蛋白激酶激活因子（ 合，激活 而誘導激活下游的 2。另外其它相關調(diào)控基因密切相關，研究表 裂解 白，在體外從過表達 細胞中發(fā)現(xiàn) 體誘導細胞凋亡時， 在白環(huán)狀區(qū)域的 裂解 白。被死亡受體（ ）激活的 以切割 族的 裸露的 C 末端可結合在線粒體上導致釋放細胞色素 C， 割放大 胞凋亡信號，修剪后的 凋亡信號傳遞至線粒體，從而釋放細胞色素 C63。 在放射損傷小鼠胸腺細胞時發(fā)現(xiàn) 參與 導的凋亡信號傳導， 賴 活化 64。在 導的細胞凋亡的實驗中發(fā)現(xiàn) 入活化狀態(tài)后，能部分抑制 導的 細胞凋亡，說明 白酶家族，尤其是與了 導的細胞凋亡途徑 65。這在一定程度上表明， 各種途徑存在著一定的聯(lián)系。 全身腫瘤相關的研究中，陸續(xù)報道在相關的癌組織中有表達， 利用 測肝細胞癌組織，發(fā)現(xiàn)癌組織及癌旁組織中均有 表達，用免疫組織化學檢測肝癌組織時得出，所有的癌組織與癌旁組織中均有 表達 66。國內(nèi)學者在對舌癌的研究中發(fā)現(xiàn)，舌癌組織與癌旁組織中均有有 表達，免疫組織化學測得 表達，并得出惡性度較低的高分化舌鱗癌組織中 表達較高，提示促進異?；虬┳兊募毎l(fā)生凋亡，并指出舌癌患者的 期越晚， 表達越低，表明 族蛋白在舌癌的發(fā)生、發(fā)展與預后中起到 了相當重要的作用，具有促進舌癌細胞的