第一部分 文獻(xiàn)綜述 血管活性腸肽 簡(jiǎn)介 血管活性腸肽 ( 是 一種由 28 個(gè)氨基酸組成的多肽， 20 世紀(jì) 70 年代早期由 1970)首次從豬十二指腸分離并命名。因一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu) 的相似性 ， 認(rèn)為是胰高血糖素 見(jiàn)表 1)。胰高血糖素 7 和垂體腺苷酸環(huán)化激活多肽 (8(et 1989; et 1990)，胰高血糖素 (et 1978)，胰泌素 (1968)，胰高血糖素類似肽（ et 1987)，生長(zhǎng)激素釋放因子 (1et 1982)和毒蜥素 ( et 1984)。 表 1 關(guān)肽的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu) IP 源 5 10 15 20 25 30 8% 泌素 32% 高血糖素 21% 21% 25% 蜥素 54% 泛分布于中央神經(jīng)系統(tǒng)的類膽堿突觸前神經(jīng)細(xì)胞和外 周 肽能神經(jīng)細(xì)胞中 ，通過(guò)它可對(duì) 多種器官 進(jìn) 行 神經(jīng)支配，比如心臟，肺，消化系統(tǒng)和泌尿生殖道，眼睛，皮膚，卵巢和甲狀腺 (et 2000)。 中樞 和 外周 神經(jīng)系統(tǒng)中是一種重要的信號(hào)肽，在生物體 內(nèi)涉及到多種 生物學(xué)功能 (et 2006)，包括 參與 新陳代謝 、 外分泌和內(nèi)分泌 、 細(xì)胞分化和平滑肌 舒張 (1991)、 激素分泌 (et 2001)和免疫應(yīng)答調(diào)控(et 1999)?；谒亩喾N生物學(xué)功能，血管活性腸肽 (認(rèn)為是一種對(duì)多種疾病包括糖尿病，哮喘，陽(yáng) 痿和風(fēng)濕 有治療 前 景的藥物候選物 (2003; 2004; et 2006)。 管活性腸肽的結(jié)構(gòu) 一種 由 28 個(gè)氨基酸組成的直鏈小分子神經(jīng)肽，相對(duì)分子量 為 3323 于胰高血糖素 因長(zhǎng)度為 88371987)，定位 于 第 6 號(hào)染色體長(zhǎng)臂 近末端處 ， 成熟的 由 170 個(gè)氨基酸組成的前激素原經(jīng)剪切得到。 管活性腸肽的來(lái)源 要是由外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，由副交感 神經(jīng)節(jié)后纖維釋放，并且與乙酰膽堿共同存在 (文衛(wèi)東等， 2000)。內(nèi)分泌細(xì)胞和胃腸粘膜分散的神經(jīng)中也存在 合成與釋放，另外分泌 經(jīng)纖維在生物體內(nèi)的大部分淋巴器官中也有發(fā)現(xiàn) (胡滿等，2000)。許多與免疫有關(guān)的細(xì)胞，如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和多形核細(xì)胞等也會(huì)產(chǎn)生少量外，如結(jié)腸癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞，也可自分泌一定量的 翁躍頌，2006)。 體內(nèi)由肝臟分解，腎臟排泄，在體內(nèi)循環(huán)中的半衰期是 1鐘，正常時(shí)無(wú)法起到循環(huán)樣激素的作用 (1998)。 管 活性腸肽在體內(nèi)的分布 最初 從 小腸中分離出 后，又在各種淋巴組織及 外周 和中樞神經(jīng)系統(tǒng) ， 消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn) 存在 (姚泰， 2001； 李國(guó)華 ， 侯曉華， 2003； et 2003; 1998)。 在外周神經(jīng)系統(tǒng)中 ， 要分布 于 泌尿生殖道、淚腺、胰腺、胃腸道、肺、心等器官中 (et 1984)。 體內(nèi)廣泛分布 ，但其 濃度在體內(nèi)不同部位存在差異。在胃腸道中的 量最高 ， 外周神經(jīng)末梢和中樞神經(jīng)中 次之 ，外周血中 量最低（ 喻召才等， 1999）。外周血中 濃度顯著低于垂體門 靜 脈血 (et 1995)。 管活性腸肽的受體 血管活性腸肽（ 垂體腺苷酸環(huán)化激活多肽 (受體是 G 蛋白偶聯(lián)受體的一種，是由 3 個(gè)細(xì)胞外 ( 旋和 3 個(gè)細(xì)胞內(nèi) ( 旋連接的 7 次跨膜結(jié)構(gòu)域， 以及 一個(gè)長(zhǎng) N 端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和一個(gè) C 端細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 構(gòu)成 。迄今為止，已有 3 種類型的 體 被克隆和分類，分別為 et 1998)。 于 著 相同的親和力 ( 1 主要通過(guò)腺苷酸環(huán)化途徑激活。 較高親和力 ( 0.5 是對(duì) 親和力較低（ 500 時(shí)具有腺苷酸環(huán)化酶活性和磷脂酶 C 活性 (2007; 2009; et 2009)。 3 種受體在 不同的組織和器官中表達(dá)存在差異 。 達(dá)于大腦（腦皮層和海馬體）和周邊 組織如肝、肺和腸， 在免疫細(xì)胞中 也有 表達(dá)。 達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng) (主要在丘腦和神經(jīng)叉上核，在海馬體、腦干、脊髓和背根神經(jīng)節(jié)低水平表達(dá) )，并且在許多 外周 組織中表達(dá)，如胰腺、骨骼肌、肺、心臟、腎臟、脂肪組織、睪丸、胃、血管和生殖系統(tǒng)。 要存在于腦部 (大腦嗅球、丘腦、海馬體、海馬體齒狀回和小腦 )，并且存在于腎上腺髓質(zhì)中。這些受體的廣泛存在表明了 括 中樞 神經(jīng)系統(tǒng) ( 外周 組織 在內(nèi)的許多器官都會(huì)產(chǎn)生影響 ，。 管活性腸肽的生物學(xué)功能 初被認(rèn)為 是一種存在于腸道的激素 ，直到 1976 年在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了 疫反應(yīng)陽(yáng)性現(xiàn)象，才開(kāi)始認(rèn)識(shí)到 一種神經(jīng)遞質(zhì) (et 1976)。 隨著 對(duì) 究 的 深入 ， 發(fā)現(xiàn) 生物體中的 有多種生物學(xué)功能。比如，在神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì)；在消化系統(tǒng)中作為胃腸激素；在免疫系統(tǒng)中， 與 免疫細(xì)胞相 應(yīng)的受體結(jié)合，產(chǎn)生免疫效應(yīng) (王軼等， 2008)。但是在血漿中， 度低且 迅速降解。由此可以看出 旁分泌 起 局部作用的一種激素 ，而不是一種 循環(huán)激素 (楚更五， 2000)。 管活性腸肽的胃腸道激素功能 經(jīng)元按其功能的不同可分為分泌神經(jīng)元與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，分泌神經(jīng)元可以調(diào)節(jié)腸胃吸收，保護(hù)腸黏膜，刺激腸液和胰液分泌；運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 能夠 則可以 舒張胃腸和括約肌 (趙智強(qiáng)等， 2006)。 胃腸道中主要以神經(jīng)遞質(zhì)的形式發(fā)揮局部作用， 可以 舒張血管和松弛平滑肌、促進(jìn)腸道內(nèi)的電解質(zhì)和水的轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)吸收和分泌，還可以刺激小腸液和胰液的生成 (2001)。 胰泌素 可以 刺激胰島釋放出胰島素，釋放肝糖 ， 抑制胃酸的分泌，在短時(shí)間內(nèi)將血漿葡萄糖水平升高 (李尋等， 1990)。 管活性腸肽的神經(jīng)肽功能 夠 激活腦組織的 升高體溫 、 引起覺(jué)醒效應(yīng)； 它還 能 刺激胰高血糖素、生長(zhǎng)抑制素、黃體生成素、生長(zhǎng)激素等激素 的 釋放； 參與 調(diào)節(jié)人體的晝夜節(jié)律 ，并在外周神經(jīng)中起到神經(jīng)遞質(zhì)的作用。對(duì)于控制心房心律不齊的迷走神經(jīng)， 樣 起到了重要的作用 (胡仲明，柳巨雄， 2003)。 大量研究表明， 5節(jié) 作用 (et 2000)。 是一種 催乳素釋放因子 ， 具有調(diào)節(jié)催乳素釋放 的作用 (et 1989)。也有研究證明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中 作用 是轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)， 它 可 以 有效地保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞 (2000)。 管活性腸肽的免疫功能 能由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，并在外圍淋巴器官和中央淋巴器官中起到旁分泌的功能，說(shuō)明 與了免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的雙向通訊。 為免疫調(diào)節(jié)肽，其受體基因在中央淋巴器官和外圍淋巴器官中 都有 表達(dá) (1994)。 它 可以很好地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，尤其是 在 局部粘膜免疫的 調(diào)節(jié) 方面 (王偉，李偉毅， 2005)。 以通過(guò)對(duì)輔助性 T 淋巴細(xì)胞 ( 腺苷酰磷酸胞嘧啶核苷 (效應(yīng)細(xì)胞 的 作用， 調(diào)節(jié)多種 胞特異性因子 的 水平 ， 同時(shí) 還 抑制 表達(dá)、阻止由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生 的 胞克隆的清除，幫助局部產(chǎn)生記憶 胞， 有 效 抵抗存活細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，因此在體內(nèi)外 使 后 向 胞分化，之后產(chǎn)生以 主的免疫應(yīng)答 (張 松照，2005)。 許多研究表明，淋巴細(xì)胞尤其是 T 淋巴細(xì)胞 (徑 )的活動(dòng)明顯受 抑制。可以調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞的成熟、分化和增殖 。 還有研究表明， 一定程度上可以影響免疫細(xì)胞的遷移、附著以及生物體 內(nèi)的 再分布 (et 2000)。 管活性腸肽的主要生理作用 管活性腸肽對(duì)胃腸道的作用 為促胰液素族成員， 它 對(duì)胃腸道起到 著 不可忽視的作用。 它可以 有效促進(jìn)胰島素的分泌 ，同時(shí)也 能 抑制胃蠕動(dòng)和胃 酸的分泌。 刺激胰腺使其分泌碳酸氫鹽和水分，這種作用和促胰液素相類似；它還能促進(jìn)脂肪和糖元的分解，升高血糖； 刺激小腸上皮分泌 上 也擁有無(wú)法替代的作用， 它可使 腸液 電解質(zhì)的分泌明顯增加 (胡仲明，柳巨雄，2003)。 普遍認(rèn)為 胃腸道平滑肌 具有 舒張 作用 。 管活性腸肽對(duì)心血管系統(tǒng)的作用 很多研究結(jié)果表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的 刺激 迷走神經(jīng)能夠 使其 釋放 靜脈注射 以強(qiáng)烈 地 降低血壓和舒張血管 (李 蓮軍等， 2001)。此外， 生理學(xué)作用 還 包括 使 心率加快、 增加 血管 的 通透性以及增強(qiáng)心肌的收縮力。研究還發(fā)現(xiàn) 心臟和動(dòng)脈血管有較強(qiáng)的收縮作用， 它可以 降低血壓并促進(jìn)全身血液的流動(dòng)，以及降低外周血管的阻力 (楊鋼， 1996)。 一種內(nèi)源性的血管舒張劑。一定生理劑量的 藥于骨骼肌、消化腺、汗腺、肺和腎臟 ，可對(duì)這些部位 的血管產(chǎn)生舒張作用，還觀察到腦和心在使用了生理劑量的 舒張血管并隨血管的緊張度升高作用增強(qiáng)。腎上腺素能受體和膽堿能的阻斷劑 對(duì) 張血管的功效沒(méi)有影響，所以作為血管的舒張劑 非膽堿能、非 腎上腺素能的，膽堿和異丙腎上腺素對(duì)血管的舒張作用強(qiáng)于 作用時(shí)間要長(zhǎng)于膽堿和異丙腎上腺素 (et 2000)。 管活性腸肽對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響 于一部分腫瘤的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。陳潛 (1994)等發(fā)現(xiàn)帶有 體的胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)在 10-6 和 10-7 時(shí)得到 明顯的促進(jìn)。 (2000)發(fā)現(xiàn)使用核素腫瘤受體 顯像 時(shí) ， 胃癌原發(fā)灶的 體檢出率為 100%。 (1991)證實(shí) 100-5 的 外源 性 促使不同的胃癌細(xì)胞細(xì)胞株生成 是對(duì)于的 它們 生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的影響。 管活性腸肽對(duì)于免疫 的影響 為一種免疫調(diào)節(jié)分子有著重要的作用，當(dāng)存在強(qiáng)烈的致病因素誘導(dǎo)時(shí)， 主要免疫功能就 體現(xiàn)于它的抗炎作用 。當(dāng)不存在強(qiáng)烈的致病因素誘導(dǎo)時(shí)，未成熟的樹突狀細(xì)胞在 誘導(dǎo)下成熟， 免疫應(yīng)答得到促進(jìn)，通過(guò)產(chǎn)生抗體提供保護(hù)作用，從而避免了急性炎癥的誘發(fā)。 抗炎作用是通過(guò)抑制重要的前炎性細(xì)胞 (比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞 )產(chǎn)生趨化因子和細(xì)胞因子，成熟后的樹突狀細(xì) 胞抗原呈遞功能通過(guò)抑制共刺激分子的表達(dá)而受到抑制，并抑制炎癥部位的 胞的聚集和促進(jìn)胞的遷移，從而防止了慢性炎癥的發(fā)生和促進(jìn)了急性炎癥的消退。還有一點(diǎn) 就是 ，過(guò)耐受型樹突狀細(xì)胞發(fā)揮誘導(dǎo)作用誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受。由于樹突狀細(xì)胞能否有效地將抗原呈遞給 T 淋巴細(xì)胞直接受到其在體內(nèi)的遷移過(guò)程的影響，免疫應(yīng)答的發(fā)展和發(fā)生從而也受到影響，因此，關(guān)于樹突狀細(xì)胞免疫受 調(diào)節(jié)作用的一個(gè)重要方向就是對(duì)于樹突狀細(xì)胞趨化因子與其受體的表達(dá)受到 調(diào)控。 管活性腸肽在免疫細(xì)胞的表達(dá)和內(nèi)源 性 在淋巴器官中 兩個(gè)不同的來(lái)源，也就是自身神經(jīng)系統(tǒng)和免疫細(xì)胞本身。 淋巴組織中的 要來(lái)源于其本身的免疫細(xì)胞 。免疫細(xì)胞特別是 細(xì)胞表達(dá) 加工 前體和分泌 熟肽。產(chǎn)生 多的是 2 細(xì)胞，用來(lái)應(yīng)答抗原刺激 (2001a, 2001b, 2001c)。有趣的是 ， 中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌的 段 ( 體 不起到 信號(hào) 作用， 但在最近被發(fā)現(xiàn)具有抗菌活 性 (et 2008; et 2009)。 由免疫細(xì)胞生成的內(nèi)源性 調(diào)控方面起著重要的作用。早期的研究表明 敗血癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 中 高 很可能是在試圖抑制免疫反應(yīng) (et 1989; et 1994)。在患有自身免疫性甲狀腺炎和紅斑狼瘡的病患體內(nèi)，存在低水平的高水平的 ，這些現(xiàn)象都表明了 平降低可能導(dǎo)致疾病的 發(fā)展 或加劇(et 2003)。 體內(nèi) 乏的 小鼠對(duì)脂多糖 (發(fā)的敗血性休克更為敏感，并且更容易發(fā)展為支氣管哮喘和肺部高血壓，它們有更高數(shù)量的免疫細(xì)胞 浸潤(rùn) ，并在支氣管肺泡灌洗液中有更高水平的促炎細(xì)胞因子 (et 2006; et 2006)。這 一結(jié)果 與之前發(fā)現(xiàn)的外 源性 少促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生 ， 使 非特異性 免疫細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞失活 相一致。 管活性腸肽在炎癥和自身免疫性疾病中的作用 限制炎癥和免疫 應(yīng)答 的進(jìn)行 中 起 到了 重要 的 作用 ， 并能促進(jìn)炎癥的識(shí)別。 使用外源 性 療 很多 病理 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?可 以減少發(fā)病頻率及減輕癥狀的嚴(yán)重程度 ，如敗血癥、胰腺炎、肝炎、呼吸道炎癥性疾病、神經(jīng)變性失常、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸道疾病、 型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、 肖格倫綜合征和自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。在以 惡化 的炎癥反應(yīng)為特點(diǎn)的疾病中， 有益影響表現(xiàn)為 可 在全身或局部范圍內(nèi) 廣泛 下調(diào)炎性細(xì)胞因子、趨化因子和氧化應(yīng)激 介質(zhì)的水平 。 過(guò)抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活 ， 對(duì)神經(jīng)變性如脊椎損傷 (et 1999; et 2000)、腦創(chuàng)傷 (2003a, 2003b, 2003c; et 2007)和帕金森綜合癥 (2003a, 2003b, 2003c; et 2006; et 2010)也 同樣 具有治療作用 。 在自身免疫性疾病中， 治療效果 與 引發(fā)自身免疫的早期 炎癥反應(yīng)的 下調(diào) 和 對(duì)慢性激活的 晚期 炎癥反應(yīng) 的 下調(diào) 緊密相關(guān) 。在體內(nèi)， 弱自身反應(yīng) 胞 的發(fā)育和它們向靶 器官 的遷移 ， 減少 促炎細(xì)胞因 子和趨化因子 的 釋放， 導(dǎo)致 巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞 的 召 募與 激活 下降 ，并且誘導(dǎo) 產(chǎn)生 。 T 細(xì)胞分化和功能的影響 是 直接或間接的通過(guò)樹突 狀 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)完成。 管活性腸肽在炎癥和自身免疫疾病方面的應(yīng)用 治療炎癥、自身免疫性疾病方面 有 廣泛 研究， 主要 集中于 治療感染性休克、炎癥性腸病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 和 一些其他的炎癥 。在治療 自身免疫性疾病方面 ，有報(bào)道采用制 T 細(xì)胞的增殖和 產(chǎn)生等 ， 從而對(duì)肉芽腫的形成進(jìn)行調(diào)節(jié) (991)。抑制肺組織中的 活性，阻止肺上皮細(xì)胞 的 凋亡，還可 抵 抗肺部的氧化和炎癥狀態(tài)，保持氣道、肺部上皮的完整性 。 治療肺部疾病如急性呼吸窘迫癥等具有重要的意義 (000)。 對(duì)于 其 它 具有自身免疫和慢性炎癥表現(xiàn)的疾病如多發(fā)性硬化和糖尿病等的防治上 ， 樣被認(rèn)為 是有 價(jià)值 的 (et 2003)。 感染性休克是一種臨床常見(jiàn)疾病，導(dǎo)致休克的急、慢性炎癥主要由革蘭氏陰性菌感染所引起。其他類型的細(xì)菌、霉菌、原蟲及病毒也可引起這種感染。在感染性休克 時(shí)， 促炎因子 通過(guò) 抑制血液中的 升高抗炎癥因子如 平防止感染性休克發(fā)生。 炎癥性腸病 (為一種慢性疾病其主要 表 現(xiàn)為腸道炎癥，包括克隆氏病 (潰瘍性結(jié)腸炎 (在 病的作用中免疫學(xué)因素已得到肯定并已有深入的研究，特別是粘膜的固有免疫和神經(jīng)肽的免疫調(diào)節(jié)方面 (et 1996)。 (1994)研究指出類神經(jīng)肽如 水平 ， 從而 發(fā)揮了 保護(hù)性粘膜固有免疫調(diào)節(jié) 功能，因此 以用于慢性 治療。 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (一種對(duì)人類健康嚴(yán)重威脅的自身免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為骨和軟骨破壞以及慢性對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎，骨及關(guān)節(jié)軟骨破壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、功能喪失甚至殘疾是其最顯著的病理特點(diǎn)。 發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但是自身免疫和炎癥反應(yīng)已被證實(shí)是引起骨和軟骨損傷及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (兩大主要因素。以通過(guò)對(duì)炎癥和自身免疫這兩條途徑的下調(diào)有效防治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (et 2001d)。 清抵抗素 血清抵抗素 (一種肽激素，它以分泌蛋白的形式出現(xiàn)， 富 含 半胱氨酸，是因的編碼產(chǎn)物，在人體內(nèi)是一段 108 個(gè)氨基酸的前肽，在分泌前被剪切 形成抵抗素 。在外周血中的抵抗素主要是以二聚體結(jié)構(gòu)存在，其二聚體結(jié)構(gòu)是由兩段 92 個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽組成，這兩段多肽通過(guò) 二硫鍵連接。抵抗素很可能就是 胰島素 抵抗和 肥胖 之間的重要聯(lián)系。小鼠體內(nèi)的血清抵抗素在脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和干細(xì)胞中發(fā)揮功能，使這些細(xì)胞對(duì)胰島素的 敏感性 降低，小鼠的血 清抵抗素 由 脂肪細(xì)胞 產(chǎn)生和分泌。 抵抗素 可抑制 胰島素 刺激 的糖攝取 ， 血清抵抗素的含量在 肥 胖 小鼠體內(nèi)有所提高，在使用抗糖尿病藥 物 或者對(duì)小鼠禁食后抵抗素含量會(huì)降低 (et 2009)。 清抵抗素的表達(dá)調(diào)控 甾體類激素、神經(jīng)肽 Y、高血糖、生長(zhǎng)激素等 可誘導(dǎo) 抵抗素 組織或脂肪細(xì)胞中 的 表達(dá) ，衰老因素也具有相似的作用 ?？崭埂?nèi)皮素 狀腺素、異丙腎上腺素和腎上腺素 可以使抵抗素的表達(dá)受到抑制 。 與 炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化 密切相關(guān)的 因素 對(duì)于調(diào)節(jié)人單核巨噬細(xì)胞中 抵抗素的表達(dá)具有重要的意 義 (et 2009)。 清抵抗素與胰島素抵抗 抵抗素 可降低 一些細(xì)胞 ，如 脂肪細(xì)胞、骨骼細(xì)胞和肝細(xì)胞 對(duì)于胰島素 的 敏感度 ，從而誘發(fā)胰島素抵抗，進(jìn)而可 導(dǎo)致糖耐 受 量降低，空腹血糖含量升高 (et 2007)。 在 7 天后 ，隨著血清中抵抗素水平的升高， 抵抗素過(guò)表達(dá) 的 小鼠葡萄糖灌注率降低13%肝糖的輸出降低 27%游離脂肪酸的水平被胰島素抑制降低了 7%，存在胰島素抵抗現(xiàn)象。一些組織中 如 骨骼肌、肝臟和脂肪組織中的蛋白激酶途徑的激活 受到顯著 的抑制。血清抵抗素 可以 引發(fā)胰島素的全身抵抗，從而導(dǎo)致慢性高胰島素血病癥與高三酰甘油血病癥。 人的胰島素敏感性和人血清抵抗素呈現(xiàn)出 顯著 負(fù)相關(guān)性，抵抗素引發(fā)胰島素抵抗 (張望，張健， 2007)， 其可能的機(jī)制是抵抗素可以減弱胰島素刺激的脂肪細(xì)胞攝糖作用從而引發(fā)胰島素抵抗 。并且，在抵抗素高度表達(dá)的動(dòng)物模型中，骨骼肌和肝臟對(duì)葡萄糖的攝取可以被高抵抗素血癥減少，使骨骼肌細(xì)胞和肝臟細(xì)胞中的胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑減少，這包括了使 活減少， 活減少， 酸化及蛋白含量減少 (et 2006)。這些說(shuō)明了，在骨骼肌、肝臟及脂肪組織中 ，抵抗素作為一種信號(hào)，使胰島素作用下的葡萄糖攝取減緩從而減弱了胰島素的作用，引發(fā)了 胰島素抵抗。 清抵抗素與炎癥 近年來(lái)研究已經(jīng)表明 ， 炎癥因子和血清抵抗素的關(guān)系呈現(xiàn)出正相關(guān)性， 并認(rèn)為 炎癥狀態(tài)就是一種抵抗素水平升高的狀態(tài)。在外周單核細(xì)胞有血清抵抗素的表達(dá)，當(dāng)使用諸如內(nèi)毒素等炎癥刺激因子作用于外周單核細(xì)胞時(shí)，可以檢測(cè)到抵抗素表達(dá)水平顯著升高，在急性內(nèi)毒素?cái)⊙Y患者體內(nèi)的血清抵抗素含量可提高達(dá)正常值的七倍 (章建梁等， 2009)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者 體內(nèi)有血清抵抗素的聚集，其聚集在患病者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)，并且炎癥指示物的水平與血清抵抗素的含量 之 間具有關(guān)聯(lián) (杜娟 和 王純瑩， 2007)。 清抵抗素與高血壓 人體胰島素抵抗是肥胖、高血壓、糖尿病等疾病發(fā)病的基礎(chǔ)。但是高血壓與血清抵抗素之間的關(guān)系還不明確。研究表明 (李志臻，傅祖植， 2006)，血清抵抗素非編碼區(qū)部分基因的單核苷酸 多態(tài)性與許多因素有關(guān)，這些相關(guān)因素包括肥胖、腰圍、胰島素的敏感性和高血壓等 (劉玉嵐等， 2006； et 2008)。還有研究表明，脂肪細(xì)胞的活性能夠 顯著 的被某 些 高，這和細(xì)胞的氧化應(yīng)激存在著潛在的關(guān)聯(lián)。肥胖和 型糖尿病的引發(fā)有可能和血清抵抗素的分泌水平 升 高有關(guān)。血清抵抗素的表達(dá)、分泌和功能受到血清抵抗素基因的多態(tài)性影響，從而影響到糖尿病的病發(fā)，因此胰島素的敏感性也可以間接或直接的受到影響，從而與糖尿病和高血壓產(chǎn)生了聯(lián)系。 清抵抗素與動(dòng)脈粥樣硬化 許多的研究結(jié)果顯示，動(dòng)脈粥樣硬化是由白介素 腫瘤壞死因子 白介素 一些炎癥刺激因子參與形成，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，這些炎癥刺激因子起 到了重要的作用。同時(shí)人單核細(xì)胞的抵抗素 達(dá)水平也可以被這些炎癥刺激因子上調(diào)，這表明 了這些炎癥刺激因子影響到動(dòng)脈粥樣硬化的另一個(gè)機(jī)理就是調(diào)節(jié)抵抗素 表達(dá) (et 2009)。 動(dòng)脈粥樣硬化是一種具有炎癥表現(xiàn)的慢性疾病，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是許多因素相互作用引起的，這些因素包括了單核 /巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、 種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子。炎癥因子能夠顯著 地 誘導(dǎo)血清抵抗素的表達(dá) ，同時(shí)和動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的炎癥 過(guò)程也有血清抵抗素的參與，從而引發(fā)了一系列的生理和病理結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)血管壁的主要成 分如核 /巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等均直接受到血清抵抗素的作用從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的病理形成過(guò)程也可能有血清抵抗素的參與 (張遠(yuǎn)梅， 2012)。 管活性腸肽對(duì)血清抵抗素的作用 近些年來(lái) 有 研究證實(shí)， 自身炎癥和免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著極其重要的作用(2001)。血清抵抗素作為一種脂肪因子 具 有促進(jìn)炎癥的功能。血清抵抗素的基因可被 過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)，這一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括了分泌促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子。 有調(diào)節(jié)免疫和抗炎的作用， 通過(guò)其 受體 以 顯著下調(diào)由 導(dǎo)的急性炎癥狀態(tài)下產(chǎn)生的促炎因子血清抵抗素 (水平 (謝珊珊等， 2009； et 2009)。 題的提出 有廣泛的生物學(xué)活性 ， 提示 有廣闊的臨床應(yīng)用前景。 但 是，到目前為止只開(kāi) 展了 少數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)。 床 應(yīng)用的 一個(gè)主要障礙 就 是 它 在在體內(nèi) 受到蛋白 酶 作用 、抗體 中和、 自發(fā)水解而 半衰期很短 ， 這使 體內(nèi)半衰期 不足 1 分鐘。 嘗試提高 穩(wěn)定性的方法， 包括 對(duì)其母體進(jìn)行化學(xué)修飾、使用穩(wěn)定的 體激動(dòng) 劑或 似物、 肽酶抑制劑組合使用或?qū)?確地嵌入到微?；蚣{米粒子中 (et 2010)。 氨基酸的化學(xué)修飾或替換作為一種常用的方法早已被提出并用來(lái)增加神經(jīng)肽的穩(wěn)定性 (er 2010)。 他的同事最近得到了兩個(gè) 衍生物具有相當(dāng)可觀的穩(wěn)定性 (在 40 超過(guò) 60 天 )，它被做成可吸入的粉末制劑在哮喘和慢性阻塞性肺病 (型上具有一定功效 (et 2009; et 2010)。但是這些 衍生物在治療其他疾病上面受到了限制。之前也有提出使用微膠?；蛑|(zhì)體包埋神經(jīng)肽使其在體內(nèi)緩慢釋放，近期這種方法也被用于 體內(nèi)抗炎模型的應(yīng)用上(er 2009)。然而這種脂質(zhì)體包埋的神經(jīng)肽進(jìn)入目標(biāo)器官受到了其顆粒大小的限制。為了克服這個(gè)潛在的問(wèn)題，一個(gè)近期的研究描述了一種將 埋于由銀保護(hù)的納米粒子，它的功能和體內(nèi)固定 小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相類似 (2009)，這項(xiàng)研究第一次提供了使用金屬納米粒子對(duì)神經(jīng)肽靶向給藥的資料，但是在炎 癥狀態(tài)下的基于納米粒子的治療效果還需進(jìn)一步證明。雖然已有多種延長(zhǎng) 體內(nèi)半衰期的方法，但是仍需找到一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且安全可靠的方法。 人血清白蛋白 (為人血清的主要成分，對(duì)體內(nèi)血漿體積和滲透壓的維持起到了至關(guān)重要的作用。 分子量為 非糖基化蛋白，它具有非常低的腎清除率，在人體內(nèi)的半衰期為 1420 天。 體內(nèi)常作為體內(nèi)因子和藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)的載體。所以， 以作為小分子蛋白在血液中的載體從而延長(zhǎng)小分子蛋白在人體內(nèi)的半衰期 (唱韶紅等， 2006)。 的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)克魯維氏酵母表達(dá)的合蛋白在以家兔作為動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中，其半衰期達(dá)到了 體的 140 倍(et 1992)。通過(guò)維氏酵母表達(dá)的 的半衰期在獼猴體內(nèi)比8 倍 (et 2002; et 2003)。 為了延 長(zhǎng) 體內(nèi)的半衰期，我們希望通過(guò)構(gòu)建重組 表達(dá)載體，將 連，從而延長(zhǎng) 體內(nèi)的半衰期。之后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入 胞表達(dá)得到 目標(biāo) 重組蛋 白。 目前， 要的臨床應(yīng)用是 對(duì)治療炎癥、感染性休克 、 自身免疫性疾病方面。 血清抵抗素作為一種脂肪因子 具 有促進(jìn)炎癥的功能。 有調(diào)節(jié)免疫和抗炎的作用， 通過(guò)其受體 導(dǎo) 可以 顯著下調(diào)由 導(dǎo)的急性炎癥狀態(tài)下產(chǎn)生的促炎因子血清抵抗素 (水平 (謝珊珊等， 2009； et 2009)。 因此，我們考慮 利用 征 重組 血管活性腸肽（ 融合 蛋白的生物活性。 文獻(xiàn)顯示 (謝珊珊等，2009)，在給體重 20 g 左右的小鼠按照 5 g/g 體重注射 以使小鼠體內(nèi)的血清抵抗素由正常的 10 g/L 左右升高至 35 g/L 左右，當(dāng) 同作用時(shí)可以使小鼠體內(nèi)血清抵抗素降低至 5 g/L 左右 。我們給小鼠注射 其血清抵抗素 被 誘導(dǎo)升高，再給小鼠注射重組 白，收集小鼠血清，使用小鼠血清抵抗素 劑盒檢測(cè)小鼠血清中的抵抗素含量，希望通過(guò)注射重組 白能夠降低其被 導(dǎo)升高的血清抵抗素含量，從而驗(yàn)證重組 白的生物學(xué)活性。 同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)的觀察，用來(lái)輔助評(píng)價(jià) 組蛋白的生物學(xué)活性。 第二部分 重組血管活性腸肽克隆的 構(gòu)建及表達(dá) 為一種重要的小分子 信號(hào)肽，在生物體 內(nèi)涉及到多種 生物學(xué)功能 (et 2006)。 基于它的多種生物學(xué)功能， 認(rèn)為 在 對(duì)多種疾病 如 糖尿病，哮喘，陽(yáng)痿和風(fēng)濕 等的 治療 上 都 具有廣闊的前景 (2003; 2004; et 2006)。 但是由于 體內(nèi)的半衰期不到 1 分鐘 (1998) ，它在應(yīng)用方面受到了限制。目前采用 化學(xué)修飾、使用穩(wěn)定的 體激動(dòng)劑或 似物、 肽酶抑制劑組合使用或 將 埋到 微?；蚣{米粒子中 (et 2010)，但這些方法都具有一定的局限性。 為載體蛋白延長(zhǎng)小分子蛋白在血液中的半衰期是目前的一種通行技術(shù) (唱韶紅等， 2006)。許多相關(guān)研究已表明 小分子蛋白的融合蛋白在體內(nèi)的半衰期相比小分子多肽單體延長(zhǎng)了數(shù)倍 (et 1992； et 2002; et 2003)。 本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建以 為載體蛋白的 合蛋白克隆表達(dá)載體，我們將 段通過(guò)一段 連接肽連接并插入到 體上，篩選出正確克隆后轉(zhuǎn)染 胞，表達(dá)得到目標(biāo)重組蛋白。 驗(yàn)材料 驗(yàn)儀器 移液槍、超凈工作臺(tái) (安泰 )、磁力攪拌器、微波爐、高溫蒸汽滅菌鍋、 低溫冰箱(超純水儀 (制冰機(jī)、離心機(jī) ( 恒溫金屬浴、恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (上海一恒 )、 ( 臺(tái)式冷凍離心機(jī) ( 電泳儀 (伯樂(lè) )、 00 型凝膠成像儀 (。 段與載體 本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒 美國(guó) 司產(chǎn)品 (圖 1)，帶有 本 實(shí)驗(yàn)室 儲(chǔ)藏 (圖 2)。帶有 段的質(zhì)粒為華大基因公司全合成 。 圖 1 粒圖譜 2 粒圖譜 片段 2196 個(gè)堿基組成，其序列如下： 合成的 段帶有 酶切位點(diǎn)，全長(zhǎng) 114 序列如下： () 種及細(xì)胞株 大腸桿菌 胞株均為實(shí)驗(yàn)室已有。 游引物 ： 游引物 ： 主要試劑 本實(shí)驗(yàn)所用到主要試劑見(jiàn)表 2。 表 2 主要試劑 劑名稱 公司名稱 司 司 司 合酶 司 合酶 司 接酶 司 司 司 司 柱式質(zhì)粒 量抽提試劑盒 生工生物工程有限公司 柱式 回收試劑盒 生工生物工程有限公司 柱式 物純化試劑盒 生工生物工程有限公司 酵母提取物 粒 量提取 試劑盒 司 氨芐青霉素 生工生物工程有限公司 普通試劑如 瓊脂糖 、甘油、無(wú)水乙醇、 白胨、 于國(guó)內(nèi)試劑公司 。 要溶液的配置 按照表 3 稱取蛋白胨、酵母提取物和 900 餾水，置于磁力攪拌器上充分溶解，用 1 N 的 定容至 1000 入高溫蒸汽滅菌鍋中 121 滅菌 20 分鐘，冷卻后保存于 4 備用。 表 3 養(yǎng)基的配置 B 養(yǎng)基 蛋白胨 酵母膏 餾水 B 培養(yǎng)基（ 1 L） 10 g 5 g 10 g 1000 B 體培養(yǎng)基的配置 配置好 體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)將氨芐青霉素 (入到 氨芐青霉素終濃度為 100 g /勻后保存于 4 備用。 體 配置好 體培養(yǎng) 基并調(diào)完 ，向 100 B 液體培養(yǎng)基中加