I 密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 五指山豬近交系 胞建系影響因素研究 on on 文 摘 要 本實驗以五指山小型豬（ 交系為實驗材料，先后由 18 頭妊娠母豬采集了 200 枚早期胎兒，分別從不同飼養(yǎng)層、條件培養(yǎng)基、是否添加生長因子、傳代過程中所用消化液等方面對其 胞的建系影響因素進(jìn)行了研究；并對傳代獲得的 胞集落進(jìn)行了鑒定。 （ 1）從 26 28d 的新鮮豬胎兒可以獲得大量的 豬胎兒成纖維細(xì)胞（ 經(jīng)傳代培養(yǎng)后即可純化。實驗過程中， 至 10 代以上，可以在體外長期培養(yǎng)并可冷凍保存。本實驗對 的 行了核型分析，結(jié)果表明其在體外培養(yǎng)核型正常。 （ 2）采集 兒 53 枚，其中 33 枚以經(jīng)絲裂霉素 C 處理的 胞作為飼養(yǎng)層；其余 20 枚采用未經(jīng)絲裂霉素 C 處理的 胞共培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)。在使用同種培養(yǎng)基的條件下，比較不同飼養(yǎng)層對豬的 胞分離培養(yǎng)與傳代的影響。結(jié)果表明， 胞適合用作豬 胞分離培養(yǎng)、傳代的飼養(yǎng)層；而采用 胞 共培養(yǎng)的方式只適于原代分離培養(yǎng)，傳代后，仍需以 胞制備飼養(yǎng)層才能維持 胞的未分化狀態(tài)， G 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。 （ 3）采集 兒 35 枚，其中的 15 枚用 件培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng) ；其余 20枚以高糖 15%必需氨基酸 +巰基乙醇 +100IU/霉素 +100 g/霉素 常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，研究 件培養(yǎng)基對豬 果表明，以 胞作飼養(yǎng)層 ，使用 件培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基在豬 胞分離培養(yǎng)、傳代后均可獲得細(xì)胞集落，而且使用 件培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的集落數(shù)多，細(xì)胞生長速度快。因此， 件培養(yǎng)基適于豬 胞的培養(yǎng)傳代。 （ 4）采集 兒 78 枚，其中的 43 枚用常規(guī)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)；剩余 35 枚在添加 種生長因子的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基）中進(jìn)行培養(yǎng)。研究不添加生長因子對豬的 胞分離培養(yǎng)與傳代的影響。實驗結(jié)果表明，以 胞作為飼養(yǎng)層，在兩種培養(yǎng)基中都能得到可以傳代的 胞集落。但在培養(yǎng)基 中原代 落出現(xiàn)時間晚，生長速度較慢，傳代時間間隔長， 胞形態(tài)扁平；而在培養(yǎng)基中原代 落很快出現(xiàn)，生長速度較快，傳代間隔短。兩種培養(yǎng)條件下獲得的 胞都具有胚胎干細(xì)胞的形態(tài)和特征。結(jié)果提示，以 胞作為飼養(yǎng)層，不添加生長因子的培養(yǎng)基也可以維持 胞的培養(yǎng)、傳代。 （ 5）采集 兒 34 枚，分離胎兒 胞為飼養(yǎng)層，以常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在 胞傳代過程中，分別用 其進(jìn)行消化傳代，比較兩種消化液對傳代的影響 。 結(jié)果表明， 用兩種消化液消化傳代都能夠獲得新的可傳代的胞集落。因此，兩種消化液均可用于 胞的傳代培養(yǎng)。 （ 6） 對培養(yǎng) 獲得的 3 4 代的細(xì)胞集落進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明分離培養(yǎng)的 胞形態(tài)多樣，集落內(nèi)細(xì)胞排列緊密，集落邊緣清晰， 色呈強陽性， 疫熒光染色為陽性， 外懸浮培養(yǎng)可以形成簡單類胚體，具有胚胎干細(xì)胞的諸多特征。 關(guān)鍵詞 ：豬，原始生殖細(xì)胞，胚胎生殖細(xì)胞（ 胞） 00 8 to on of EG (1) 6 28d be by 10, it EF be in 196 . EF 5 by (2) To of on G in 53 33 of TO 0 TO EF 0, EF of G TO (3) To of on G in 35 15 of 0 in 5%EM - 100IU/00 g/ G TO be to G (4) To of on G in 78 35 of in ) 3 in ). be G TO G be in (5) To of on G 34 TO On by G be at It be to G (6) 3 G of in in in of as So it G G 錄 文 獻(xiàn) 綜 述 . 1 一、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性 . 1 二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 . 2 三、胚胎干細(xì)胞建系的技術(shù)路線 . 6 四、胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用價值與前景 . 12 五、本論文的研究意義 . 15 實驗一 不同飼養(yǎng)層對豬 胞分離培養(yǎng)與傳代的影響 . 16 實驗材料 . 16 實驗方法 . 18 結(jié)果與討論 . 20 實驗二 條件培養(yǎng)基對豬 胞培養(yǎng)傳代的影響 . 23 實驗材料 . 23 實驗方法 . 23 結(jié)果與討論 . 24 實驗三 無生長因子對豬 胞培養(yǎng)、傳代的影響 . 26 實驗 材料 . 26 實驗方法 . 26 結(jié)果與討論 . 27 實驗四 不同消化液對豬 胞傳代的影響 . 30 實驗材料 . 30 實驗方法 . 30 結(jié)果與討論 . 31 實驗五 胞的鑒定 . 33 實驗材料 . 33 實驗方法 . 33 結(jié)果與討論 . 34 結(jié) 論 . 37 附 圖 . 38 參考文獻(xiàn) . 41 致 謝 . 48 作者簡歷 . 50 表清單 表 1 不同飼養(yǎng)層條件下 胞的培養(yǎng)情況 21 表 2 不同培養(yǎng)基條件下 胞的培養(yǎng)情況 24 表 3 無生長因子對 胞生長的影響 27 表 4 不同消化液對 胞進(jìn)行傳代的情況 31 圖 1胞 38 圖 1純化后的 38 圖 1 38 圖 1培養(yǎng)在 養(yǎng)層上 的 胞集落（ 8d） 38 圖 1與 培養(yǎng)的 胞傳至 養(yǎng)層上形成新的集落（ 6d） 38 圖 1與 培養(yǎng)的 胞傳代后發(fā)生分化 39 圖 2用 件培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代獲得的 胞集落（ 7d） 39 圖 3無生長因子培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的 胞集落（原代 7d） 39 圖 3添加生長因子培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代后的 胞集落 （ 6d） 39 圖 4用 化傳代后形成的集落（ 4d） 39 圖 4用 化傳代后產(chǎn)生的 落（ 3d） 39 圖 5蓮花狀 胞集落（ 10d） 40 圖 5樹枝狀的 胞集落（ 11d） 40 圖 5色為陽性的 胞集落 40 圖 5表達(dá) 性的 胞集落 40 圖 5疫熒光染色為陽性的集落 40 圖 5胞分化為上皮細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞 40 略語表 性磷酸酶 性成纖維細(xì)胞生長因子 鼠肝細(xì)胞 CM 件培養(yǎng)基 d 交配后日齡 化抑制因子 s 氏培養(yǎng)液 甲基亞砜 鼠交配后日齡 EB 胚體 EG 胎生殖細(xì)胞 ES 胎干細(xì)胞 牛血清 纖維細(xì)胞生長因子 源動物胎兒成纖維細(xì)胞 細(xì)胞團(tuán) 血病抑制因子 鼠胚胎成纖維細(xì)胞 生牛血清 s 氏磷酸緩沖液 豬胎兒成纖維細(xì)胞 始生殖細(xì)胞 代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞 細(xì)胞因子 段特異性胚胎表面抗原 鼠胚胎成纖維細(xì)胞系 指山豬 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 1 文 獻(xiàn) 綜 述 胚胎干細(xì)胞 (者 ES 由動物早 期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (胎兒的原始生殖細(xì)胞 (體外分離培養(yǎng)而獲得的一種具有發(fā)育全能性或多能性的細(xì)胞。 根據(jù)其來源分為胚胎干細(xì)胞 (胞 )和胚胎生殖細(xì)胞（ 胞）。 胞是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (離培養(yǎng)出來的具有發(fā)育全能性或多能性的干細(xì)胞，而 胞是從胎兒原始生殖細(xì)胞 (離培養(yǎng)出來的具有發(fā)育全能性或多能性的干細(xì)胞， 一般將二者統(tǒng)稱為胚胎干細(xì)胞。 一、胚胎干 細(xì)胞 的生物學(xué)特性 1、 胚胎干細(xì)胞具有與早期胚胎相似的形態(tài)特征 ， 即胞體小、核大、胞漿少， 有一至二個核仁 ；且具有正常的二倍體核型。 2、 胚胎干 細(xì)胞 具有 高度的發(fā)育潛能和分化潛能 (全能性或多能性 )。 全能性 (指 胚胎干 細(xì)胞在解除分化抑制的條件下具有發(fā)育為包括生殖腺在內(nèi)的構(gòu)成機(jī)體的各種組織和細(xì)胞的潛力，即 胚胎干 細(xì)胞能發(fā)育成完整動物個體的能力；多能性 (則是指 胚胎干 細(xì)胞具有發(fā)育為多種組織的能力 ， 參與部分組織的形成（ et 1997）。 胚胎干 細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo)分化為包括 內(nèi)、中、外 三個胚層的所有細(xì)胞；若將 胚胎干 細(xì)胞注射到 分化產(chǎn)生出由三個胚層細(xì)胞組織構(gòu)成的畸胎瘤。 3、胚胎干 細(xì)胞 可以在體外 無限擴(kuò)增。在不同的生長條件下， 胚胎干 細(xì)胞具有不同的功能狀態(tài)。在體外適宜條件下，如 在飼養(yǎng)層上或含有分化抑制因子的培養(yǎng)基中， 胚胎干 細(xì)胞 可以穩(wěn)定傳代，長期培養(yǎng)， 保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性。這為胚胎干細(xì)胞研究和應(yīng)用提供了無限的細(xì)胞來源（ O1999）。 4、 胚胎干 細(xì)胞 具有生殖系 嵌合能力和 種系傳遞功能。若把胚胎干細(xì)胞注射到受體胚胎 內(nèi) ，混合后再 植入假 孕母體子宮， 胚胎干細(xì)胞可廣泛參與宿主胚胎各組織器官的生長發(fā)育， 獲得包括生殖系在內(nèi)的嵌合體后代 ， 其遺傳特性可進(jìn)入種系并遺傳給下一代， 稱之為種系傳遞 ( et 1984） 。 5、 胚胎干 細(xì)胞具有可操作性。在體外，可以對 胚胎干 細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作選擇，如導(dǎo)入異源基因、報告基因或標(biāo)志基因， 或者利用同源重組的方法插入 (或刪去 ) 某個 特定基因 ， 誘導(dǎo)基因突變，基因打靶或?qū)腩~外的原有基因使之過度表達(dá) （ 增加功能）等。理論上， 胚胎干 細(xì)胞經(jīng)遺傳操作選擇后一般仍能保持其 擴(kuò)增和發(fā)育的全能性或者多能性，因此可以通過遺傳操作選擇 生產(chǎn) 轉(zhuǎn)基因動物或基因有缺失、突變或過量表達(dá)的雜合或純合個體進(jìn)行各種基因功能的分析（ 1986）。 6、胚胎干 細(xì)胞 具有 體外 培養(yǎng)細(xì)胞所有的特征 ，可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，還可以對其進(jìn)行遺傳操作選擇和 凍存等 而不失去 其多 潛能性 。 凍存的細(xì)胞可以隨時解凍，繼續(xù)培養(yǎng)而不失其原有特性。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 2 二、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 （一）國外 1981年，英國劍橋大學(xué)的 功地建立了小鼠 試驗結(jié) 果表明，小鼠 1%，其生殖系嵌合率為 20% （ et 1981）。同年，美國加州大學(xué)舊金山分校的 樣得到了小鼠 1981）。 小鼠的 體系已基本成熟完善。小鼠 其它動物及人類胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)開辟了道路， 從此進(jìn)入了胚胎干細(xì)胞研究的新紀(jì)元。 此后，人們分別建立了 倉鼠、豬 、牛、綿羊、山羊、兔、水貂、雞、魚、 靈長類等多種動物以及人類的 胞或類 胞系。 但 迄今為止， 除小鼠 外，其他動物所分離的 胞都未能證實具有生殖系嵌合能力。 1、小鼠 自 1981年小鼠的 多實驗室致力于 們通過不同途徑分別建立了 1983年， 不同品系和孤雌生殖的小鼠胚胎及具有不同遺傳背景的胚胎建立了各種 et 1983）。1984年， S)、對硫代鳥嘌呤 (T)和烏本苷 (O)有抗性的成纖維細(xì)胞系 飼養(yǎng)層上，獲得了984）。 同年， 飼養(yǎng)層培養(yǎng) 建立了 et 1984）。 1987年， 取代飼養(yǎng)層細(xì)胞維持已成系的小鼠 小鼠上建立了非飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)（ et 1987） 。 1988年， 1988）。 1990年， et 1990） 和 et 1990） 分別在無飼養(yǎng)層條件下，向培養(yǎng)基中添加 外， 993) 和 1997)分別用免疫磁珠法從混合細(xì)胞中分離小鼠 高了 后，還有許多實驗室陸續(xù)報道建立了小鼠的 2、豬 胞研究概況： 1990 年， 離得到豬的類 胞系，但所得到的類 胞沒有進(jìn)一步分化的能力（ 1990b） 。同年， 1990）、 1990） 、 1990） 也分別報道成功地建立了豬 類 胞系。 為，在初次分離培養(yǎng)時，飼養(yǎng)層中加入豬子宮成纖維細(xì)胞，能夠促進(jìn)胚胎貼壁和細(xì)胞克隆的形成。因為豬子宮成纖維細(xì)胞與囊胚之間存在內(nèi)分泌協(xié)同關(guān)系。 1994 年， 得了能參與嵌合體形成的豬類 胞系，但未證明能否參與生殖系嵌合（ 1994）。 1998 年， 培養(yǎng)機(jī)械分離的 6 7d 的 立了豬的 胞系，并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因嵌合體豬（ et 1998）。 3、牛 1992年， 離出 傳至 4代后丟失（ 1992）。 加有硒、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和 5% 文獻(xiàn)綜述 3 的培養(yǎng)液，共得 15個細(xì)胞系。將此 得類胚體。用這種細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中體外培養(yǎng)至囊胚，再移植到假孕牛子宮內(nèi)，最后得到 4頭牛犢（ 1993）。 1994年， 立了牛的類 et 1994）。 1997年， 過分離培養(yǎng) 7利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了生殖系嵌合牛（ 1997）。 1998年， 立了牛的類 et 1998） 。 2001年， 傳至 150代（ et 2001）。 4、羊 胞研究概況： 1987 年 ， 用綿羊皮膚成纖維細(xì)胞和羊胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層，對 7 日齡和 8 日齡綿羊囊胚進(jìn)行 胞分離培養(yǎng)，只培養(yǎng)出了內(nèi)胚層樣細(xì)胞，而無 et 1987）。 綿羊 胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)果只得到上皮樣細(xì)胞（ et 1990b）。 1991 年， 分離克隆出了綿羊的 胞（ et 1991）。 1994 年， 人從綿羊中分離獲得生長緩慢，能傳至四代的類 胞集落（ et 1994）。 1996 年 ， 別 建立了綿羊和 山羊 的類 胞系（ 1996）。同 年 ， 建立了綿羊的類 胞系， 進(jìn)行核移植得到 4只羔羊（ et 1996）。 5、靈長類動物 胞研究概況 ： 1995 年， 人以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 （ 飼養(yǎng)層，從恒河猴囊胚獲得第一個靈長類的 胞系。 對該胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)傳代一年后，依然保持未分化狀態(tài)，核型正常 (且具有 胞所有的特征（ et 1995）。 1996 年，建立了 8 個狨猴的 胞系，其中兩株在體外培養(yǎng)超過一年，仍維持正常的二倍體核型和未分化狀態(tài)（ et 1996） 。 2002 年， 利用恒河猴的卵母細(xì)胞孤雌激活后發(fā)育形成的胚胎建立了胚胎干細(xì)胞系（ et 2002）。 6、人 1984年， et 1984）和 et 1984）兩個小組分別報道從人的畸胎瘤獲得了可在體外分化為神經(jīng)及其它細(xì)胞類型的克隆細(xì)胞系 。 1989年， 步表明人類胚胎干細(xì)胞建系的可行性（ et 1989）。 1994年， 分離獲得了可增殖傳代的類 并 傳至二代（ et 1994）。 1998年 ， 美國 用 體外受精 (術(shù)收集 發(fā)育至囊胚期的人胚 成功地分離 獲 得 了 人類 其中 一 株傳 32代 ， 具有正常的核型， 保持多潛能未分化狀態(tài)， 并能成功地被冷凍和解凍（ et 1998） 。 2000年，澳大利亞 新加坡大學(xué)的 且在體外分化實驗中成功地得到了神經(jīng)祖細(xì)胞（ et 2000）。 同年， 體外培養(yǎng)獲得 et 2000）。 7、其他動物 993)， 994)， 996)分別 建立了兔的類 胞系。 人于 1992 年從水貂囊胚中分離出類 胞系（ et 1992）， 1993 年又利用桑椹胚建立了水貂的 胞系（ et 1993）。 1988)， 990a)建立了倉鼠的 1996年， 次建立雞的胚胎干細(xì)胞系，并獲得嵌合體雞 （ et 1996） 。 2000年， 文獻(xiàn)綜述 4 等也 建立了雞的 et 2000） 。 1993）， 1996） 建立了青鳉魚的 （二）國外 胞研究概況 起源、遷移及增殖 目前， 有證據(jù)表明 由后腸胚層和尿囊基部向胚內(nèi)遷移，最終經(jīng)背腸系膜分兩部分到達(dá)左、右兩側(cè)生殖嵴。 用堿性磷酸酶 ( 記 且在 此可很容易地和它周圍的 此，可以用 小鼠為例， 天 (7 7原腸中期），此時 個體積較大的 于胚外中胚層 ；0 50個 位于原條的末端近尿囊蒂處 ； 8腸胚形成后期 )在后腸內(nèi)胚層和尿囊基部，出現(xiàn)不足 100個 后腸開口的邊緣并與之結(jié)合， 大約有 150個 ； 部分細(xì)胞埋藏于后腸中 (通常在中胚層 )； 部分 12 13雄性 )或減數(shù)分裂期 (雌性 )。此時， 形態(tài)上亦不同于遷移的細(xì)胞，細(xì)胞表面 特性發(fā)生了明顯改變。而沒有到達(dá)生殖嵴的 入周圍其它器官， 如腎上腺和腎（ 997） 。 一般認(rèn)為在后腸形成以前， 移主要是通過形態(tài)改變而被動進(jìn)行的；從后腸到生殖嵴則是一個主動遷移的過程 。大部分 約 6 。 以小鼠為例， 00個（ 8加到 25000（ 個。遷移中的 性的偽足 ，大量的 有極性的細(xì)胞質(zhì)， 旦到達(dá)生殖嵴，它們就呈卵圓形。在所有的脊椎動物和很多非脊椎動物中， 值得一提的是禽類的 在哺乳動物 在 系列細(xì)胞外信號在不同的時間和不同的空間表達(dá)，并一起參與了 及到一系列不同功能分子的聯(lián)合作用來共同完成，其中包括胞外基質(zhì)（ 、細(xì)胞因子 （ ）、生殖嵴的趨化作用、生殖細(xì)胞間及生殖細(xì)胞與體細(xì)胞間的相互作用。 （ 1）趨化性：在胚胎發(fā)育過程中，生殖嵴釋放某種趨化物質(zhì)吸引 鼠胚胎生殖嵴的細(xì)胞產(chǎn)生一種可擴(kuò)散的轉(zhuǎn)移生長因子 ，而 的 受體，故可沿該生長因子的濃度梯度進(jìn)行遷移。另一種趨化因子是 )，通過 的趨化作用可調(diào)控 巢”。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 5 （ 2）接觸引導(dǎo)作用：在遷移過程中，周圍的細(xì)胞和基質(zhì)影響 連蛋白和纖連蛋白引導(dǎo) （ 3） 10.5 背系膜還未完全形成時即開始從后腸遷移，幾乎是直接從后腸進(jìn)入背正中線，然后進(jìn)入發(fā)育中的生殖嵴，這表明 光鵬等， 1998； 李臻等， 1999； 傅文玉等， 2001）。 1、小鼠 早在 70年代 ， et 1973） 和 1977） 分別對小鼠 1982年， et 1982） 。 直到 1992年， et 1992）和 et 1992）體外長期培養(yǎng)小鼠 立了小鼠胚胎生殖細(xì)胞（ 系 ，并 發(fā)現(xiàn)在適宜培養(yǎng)條件下， 其形態(tài)、生長行為和發(fā)育潛能與 次證實 作 胚胎干 細(xì)胞建系的材料， 從此揭開了用哺乳動物 培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的序幕。 1994年，明 形成的兩種性別的生殖系嵌合體，都能產(chǎn)生功能性配子而生出后代（ et 1994）。 57雜 交鼠胚胎分離到多個 et 1994） 。 2003年， 無血清培養(yǎng)系統(tǒng)建立了小鼠 et 2003）。 2、 豬 1997年， 4 25并獲得嵌合體豬（ et 1997） 。 1998年， 25 27兒分離到 培養(yǎng)在 建立了 獲得的 后用轉(zhuǎn)基因的 到了轉(zhuǎn)基因嵌合體豬（ et 1998）。 1999年， 5 28立了 et 1999）。 2000年， et 2000）。 3、人 1998年， 美國 霍普金斯大學(xué)的 9周胎兒生殖嵴和腸系膜為材料，以 細(xì)胞系具有正常的核型，表達(dá)高水平的端粒酶活性和靈長類 分化發(fā)育為含內(nèi)、中、外三個胚層的組織（ 1998）。同年， 從 5 9周齡胎兒生殖嵴和腸系膜中分離 et 1998）。 4、其他動物 胞研究概況： 1990年， 分離到牛、豬、兔的 et 1990）。 1994）， 1994）， 1998） 采集牛 1998）， 2000） 建立了山羊的 1998） 建立了兔的 1994）建立了大鼠的 1999） 分離 系。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 文