密級(jí) ： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 結(jié)球甘藍(lán)遺傳圖譜 的構(gòu)建及 主要農(nóng)藝性狀的位 of a ap of a ap 摘 要 結(jié)球 甘藍(lán) 簡(jiǎn)稱甘藍(lán) (起源于地中海至北海沿岸 ，是 國(guó)內(nèi)外 普遍種植的一種重要蔬菜。 構(gòu)建一張高密度的永久分子遺傳圖譜 不僅是分子標(biāo)記輔助 育種 、 確定位的基礎(chǔ)，也是基因圖位克隆的關(guān)鍵 ，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值 。本研究利用 不同生態(tài)型的結(jié)球甘藍(lán)栽培品種的高代純 合 自交系 624 和 24交獲得 ，再通過游離小孢子培養(yǎng)獲得 102 個(gè) 系 （ ，以此 群體為 試材 ，利用 子標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)分子遺傳圖譜 并進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀的 位。 主 要研究結(jié)果如下： (1) 對(duì) 甘藍(lán) 6 種基因型的 進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，結(jié)果有 3 種基因型的出胚率較高 ，其余的 3 種基因型 卻很難獲得小孢子胚， 說明胚狀體的發(fā)生存在基因型間的差異。 最終 從 624 和 241 代中，通過 游離 小孢子培養(yǎng) 構(gòu)建了 包含 102 個(gè) 株系 的 群體 2) 利用雙親對(duì) 物進(jìn)行篩選，從 512 對(duì) 物組合中篩選出多態(tài)性較好的引物組合 87 對(duì)， 用這 87 對(duì)引物組合對(duì) 群體進(jìn)行分子檢測(cè)， 產(chǎn)生多態(tài)性標(biāo)記 771 個(gè)，平均 引物組合 ， 其中來源于親本 624 的標(biāo)記有 408 個(gè)，占總標(biāo)記數(shù)的 來源于親本 24標(biāo)記有 363 個(gè)，占總標(biāo)記數(shù)的 符合 1:1 的分離比。 另外 ， 記也 出現(xiàn) 了 高比例的偏分離，偏分離標(biāo)記有 459 個(gè)， 占 記總數(shù)的 偏分離的標(biāo)記中偏向 親本 624 的標(biāo)記為165 個(gè)，偏向 親本 24標(biāo)記為 294 個(gè)，各占總偏分離標(biāo)記數(shù)的 表明該 體 的偏分離 偏向于父本 24基因型。 (3) 運(yùn)用 件對(duì) 771 個(gè) 多態(tài)性 標(biāo)記進(jìn)行分析， 獲 得了一張由 8 個(gè)連鎖群組成，包括 458 個(gè)標(biāo)記，覆蓋基因組 655甘藍(lán) 子 連鎖圖譜，平均 圖距為 鎖群長(zhǎng)度在 30151間，連鎖群標(biāo)記數(shù)為 5 個(gè) 165 個(gè)，平均圖距為 6鎖群中包含 263 個(gè)偏分離標(biāo)記，所占比例為 統(tǒng)計(jì)偏分離標(biāo)記在連鎖群中的分布，發(fā)現(xiàn) 大部分或?qū)⒔话霕?biāo)記都為偏分離的標(biāo)記，表明這些染色體區(qū)段有可能存在偏分離熱點(diǎn)區(qū)域。 該圖譜是 目前第一張利用結(jié)球甘藍(lán)品種間雜交獲得的 體構(gòu)建的分子遺傳圖譜。 (4) 應(yīng)用軟件 多 型 法 對(duì)甘藍(lán) 25 個(gè)主要 農(nóng)藝性狀進(jìn)行 位和遺傳效應(yīng)分析 ， 共 檢測(cè)到了 11 個(gè) 與 主要農(nóng)藝 性狀 相關(guān) 的 布于 6 個(gè)連鎖群上。 其中控制開展度 、最大外葉長(zhǎng)、外葉形狀、株型、最大外葉柄長(zhǎng)和外葉葉脈這 6 個(gè) 與 葉片相關(guān) 的 性狀 的 1 個(gè)，其貢獻(xiàn)率 分別 為 控制葉球形狀 、葉球質(zhì)地、外短縮莖長(zhǎng)、葉球內(nèi)顏色和葉球高這 5 個(gè) 與 葉球相關(guān) 的 性狀 的 1 個(gè)，其貢獻(xiàn)率 分別 為 關(guān)鍵詞： 結(jié)球甘藍(lán) ， 體 ， 記 ， 遺傳圖譜 ， 農(nóng)藝性狀 ， 位 in ea ea is an in a is TL A 02 by 1 24 4-5 of In 2n=18) TL as (1) of of in It on a of a DH by 1 24 4(2) 87 as 12 Cs H 71 .9 C. 71 408 ( 24 63 ( 471 :1 In a of 59 71, 65 ( 24 94 ( 4H to 4(3) .0 71 A 58 55 cM an cM of in 0cM 51 of in 65,is cM A in G7 in in or a of is H of in .0 TL in 7 in 11 1 6 of 5 of of of DH 錄 第一章 引言 . 1 傳連鎖圖譜的構(gòu)建 . 1 圖群體的建立 . 2 于構(gòu)建圖譜的分子標(biāo)記 . 3 位 . 5 物數(shù)量性狀遺傳 . 6 位方法 . 6 薹屬作物遺傳圖譜的構(gòu)建及重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的 究進(jìn)展 . 8 薹屬作物遺傳圖譜的構(gòu)建 . 8 傳連鎖圖在蕓薹屬作物中的主要應(yīng)用 . 10 薹屬重要農(nóng)藝性狀的 位 . 11 藍(lán)類遺傳圖譜構(gòu)建中需要進(jìn)一步解決的問題 . 12 研究的目的與意義 . 13 第二章 材料和方法 . 14 圖群體的構(gòu)建 . 14 驗(yàn)材料 . 14 離小孢子的培養(yǎng) . 14 孢子苗的繼代和染色體加倍 . 14 子圖譜的構(gòu)建 . 15 因組 取與檢測(cè) . 15 析 . 15 物組合篩選與 分離群體的分子檢測(cè) . 19 據(jù)記錄 . 19 鎖圖構(gòu)建 . 19 析 . 19 H 群體田間性狀調(diào)查 . 19 據(jù)整理和 析 . 22 第 三章 結(jié)果與分析 . 23 H 群體的構(gòu)建 . 23 狀體的發(fā)生和成苗 . 23 尖鏡檢和秋水仙素加倍 . 24 藍(lán) 離群體的構(gòu)建 . 24 子圖譜的構(gòu)建 . 25 子標(biāo)記的多態(tài)性的篩選 . 25 V 析 . 34 片相關(guān)性狀的 析 . 34 球相關(guān)性狀的 析 . 37 第四章 討論和結(jié)論 . 48 同因素對(duì)圖譜構(gòu)建的影響 . 48 本的選配 . 48 H 群體的構(gòu)建 . 48 H 群體的大小 . 48 記的選用 . 49 建的分子遺傳圖譜的問題 . 50 子遺傳圖譜大小比較 . 50 記的偏分離及產(chǎn)生的機(jī)制 . 51 其他遺傳圖譜整合的可能性 . 52 析 . 52 圖及其影響因素分析 . 52 子標(biāo)記 助育種展望 . 54 論 . 55 . 55 . 55 . 55 . 55 參考文獻(xiàn) . 56 附錄 . 62 致謝 . 64 作者簡(jiǎn)歷 . 65 文 縮 略 表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 量性狀位點(diǎn) 雙單倍體 展度 of 葉葉尖形狀 葉數(shù) 高 型 葉形狀 葉蠟粉 葉葉脈 he 大外葉寬 he 大外葉長(zhǎng) 大外葉柄長(zhǎng) 球質(zhì)量 球高 球?qū)?球外露性 of 球形狀 球顏色 of 球內(nèi)顏色 球質(zhì)地 球裂球 葉球熟性 葉球緊實(shí)度 心柱長(zhǎng) 心柱寬 短縮莖長(zhǎng) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 甘藍(lán) (為 十字花科 (蕓 薹 屬 (甘藍(lán)種（ ，起源于地中海至北海沿岸，由不結(jié)球野生甘藍(lán)演化而來。甘藍(lán)的適應(yīng)性及抗逆性強(qiáng) , 容易栽培 ， 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是世界各地廣泛種植的一種重要蔬菜，在我國(guó)各地也普遍栽培，分布地區(qū)廣 , 栽培面積大 , 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值 ， 因此開展對(duì)其遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究十分必要。 許多 作物的 重要農(nóng)藝性狀為數(shù)量性狀，它們既受基因 型 的控制，又受環(huán)境 條件 等因素的影響。傳統(tǒng)的數(shù)量性狀遺傳分 析不能有效地檢驗(yàn)出某單個(gè)遺傳位點(diǎn)、染色體上的位置及與其 他 基因的連鎖關(guān)系，高密度飽和分子標(biāo)記連鎖圖的建立就使其成為可能。 體是對(duì)單倍體植株經(jīng)過自然或人工加倍就可以得到基因位點(diǎn)純合的加倍單倍體系， 體因其基因型純合，群體間存在著遺傳多樣性，且無遺傳變異，既可以進(jìn)行連 續(xù)多年的積累性研究，也可供不同實(shí)驗(yàn)室開展平行性研究，用同一群體 的 數(shù)據(jù)還可累加。因此，被認(rèn)為是數(shù)量性狀基因位點(diǎn)分析的良好群體（高用明，2000）。 20 世紀(jì) 80 年代后期發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)，以其數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定、不受基因表達(dá)與否的限制以及操 作簡(jiǎn)便等獨(dú)特的優(yōu)越性，被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，其中遺傳圖譜的構(gòu)建是遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容 , 一張高密度遺傳圖譜的構(gòu)建，不僅可用于標(biāo)記輔助選擇、數(shù)量性狀 基因 定位，還可為圖位克隆、基因組結(jié)構(gòu)和功能研究等打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)（盧鋼等， 1999）。 近二十年來，由于各種新型分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，植物高密度遺傳圖譜的構(gòu)建工作取得了很大的進(jìn)展。利用日趨飽和的遺傳圖譜為工具和日益完善的 位分析方法，已在多種作物上定位了許多控制不同性狀的 分析了各 效應(yīng)。這不僅大大加深了對(duì)數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，而且也極大地增強(qiáng)了對(duì)數(shù)量性狀的遺傳操縱能力。 傳連鎖圖譜的構(gòu)建 遺傳連鎖圖譜 （ 是指以染色體重組交換為基礎(chǔ)，采用遺傳學(xué)方法將基因或其 他 序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建的連鎖圖，以染色體重組交換率為相對(duì)長(zhǎng)度單位，單位用厘摩（ 示（楊金水， 2002）。 分子標(biāo)記遺傳連鎖圖表示各標(biāo)記所對(duì)應(yīng) 段在染色體上的相對(duì)位置 ， 是分子標(biāo)記運(yùn)用于作物遺傳育種的基礎(chǔ) ， 是進(jìn)行基因定位 、 基因克隆 、 輔助選擇育種的基礎(chǔ) ， 在遺傳 學(xué)理論 、 功能基因組學(xué)以及遺傳育種等領(lǐng)域已顯示出了十分重要的作用（ 沈法富等， 1997）。 構(gòu)建遺傳圖譜 包括以下幾個(gè)基本步驟 ： 選擇適合作圖的 記； 根據(jù)遺傳材料之間的 態(tài)性，選擇用于建立作圖群體的親本組合； 建立具有大量 記處于分離狀態(tài)的作圖群體； 測(cè)定作圖群體中不同個(gè)體或株系的標(biāo)記基因型； 將所得的條帶進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理構(gòu)建出標(biāo)記連鎖圖。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 圖群體的建立 本選配 親本的選擇直接影響到構(gòu)建連鎖圖譜的難易程度及所建圖譜的適用范圍。一般應(yīng)從以下四個(gè)方面對(duì)親本進(jìn) 行選擇，第一，選擇 態(tài)性豐富的材料作為親本。一般而言，異花授粉植物的多態(tài)性高，自花授粉植物的多態(tài)性低。例如，玉米的多態(tài)性極好，一般自交系間配制的群體就可成為理想的作圖群體；番茄的多態(tài)性差，因而只能選用不同種間的后代構(gòu)建作圖群體。一個(gè)圖譜上標(biāo)記連鎖得越多，則其利用價(jià)值就越大。因此，應(yīng)盡量選擇具有大量差異的可遺傳性狀的品種作為作圖親本。第二，盡量選用純度高的材料作為親本。第三，還要考慮雜交后代的可育性。親本間差異過大，雜種染色體之間的配對(duì)和重組會(huì)受到抑制，導(dǎo)致連鎖座位間重組率偏低， 及 嚴(yán)重的偏分離現(xiàn)象， 從而 降低所建圖譜的可信度和適用范圍，嚴(yán)重的還會(huì)降低雜種后代的結(jié)實(shí)率，甚至導(dǎo)致不育，影響分離群體的構(gòu)建。第四，選配親本時(shí)還應(yīng)對(duì)親本及其 雙親間存在相互異位，或多倍體材料（如小麥）存在單體或部分染色體缺失等問題，那么其后代就不宜用來構(gòu)建連鎖圖譜。 圖群體 到目前為止很多 作物 的遺傳圖譜已被建成，并且許多 作物 已按不同的作圖群體構(gòu)建出了多張遺傳圖譜。根據(jù)分離群體的特點(diǎn)可分為三大類：臨時(shí)性分離群體 (交 (C)群體等 )，它的顯著特征是群體中的每 一個(gè)個(gè)體其后代均可發(fā)生分離。永久性分離群體 (由基因型不同的同質(zhì)品系組成 )，包括重組自交系群體 (雙單倍體群體(H)。它的顯著特征是群體不會(huì)因種植世代的增加而發(fā)生改變，重復(fù)性好，它們研究的信息可以收集到同一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中以實(shí)現(xiàn)信息共享，為更多的研究者所利用。近等基因系群體 (它的基本特征是整個(gè)染色體組的絕大部分區(qū)域完全相同，只在少數(shù)幾個(gè)甚至一個(gè)區(qū)段彼此存在差異。因此，它能 使基因組中只存在一個(gè)或幾個(gè) 除其他背景干擾和消去主效 不同類型的 作圖 群體各有其優(yōu)缺點(diǎn) （表 ， 1代，再由其自交所得到的群體，構(gòu)建起來比較省時(shí) ， 但由于每個(gè) 只能使用一代，限制了該群體的作圖能力。 1代與一親本回交產(chǎn)生的群體， 1代配子的分離比例，因而其作圖效率最高，但其缺點(diǎn)也是不能長(zhǎng)期保存。 2個(gè)體連續(xù)自交多代，以至于后代基因組相對(duì)純合的群體，因此 且作圖的精確度也較高。但對(duì)于異花授粉植物由于存在自交衰退現(xiàn)象，建立 1進(jìn)行花藥培養(yǎng)或游離小孢子培養(yǎng)得到單倍體后代，再經(jīng)染色體加倍而獲得的純合二倍體分離群體，可 作為永久性群體，該群體可在不同環(huán)境中生長(zhǎng)，便于重復(fù)試驗(yàn)，長(zhǎng)期使用，既能提高 能揭示 曉武等， 2005； et 1982）。 但 在少數(shù)幾個(gè)甚至一個(gè)區(qū)段彼 此存在差異。因此，它能使基因組中只存在一個(gè)或幾個(gè) 離，消除其 他 背景干擾和去除主效 近發(fā)表的大量圖譜中多數(shù)是利用 建 。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 表 不同作圖群體的特性 of 征 H 體的形成 后代 準(zhǔn)確度 低 低 高 高 高 最高 需群體大小 大 大 小 小 小 小 永久性群體 否 否 否 是 是 是 分離比率 1:2:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 構(gòu)建費(fèi)用 低 低 高 中等 中等 高 構(gòu)建時(shí)間 短 短 長(zhǎng) 短 長(zhǎng) 長(zhǎng) 體大小 遺傳圖譜的精度和分辨率在很大程度上取決于作圖群體的大小。群體越大，作圖精度越高 ，但群體太大，不僅增加實(shí)驗(yàn)時(shí)間還增加費(fèi)用 ， 因此應(yīng)當(dāng)權(quán)衡確定合適的群體大小。從作圖效 率看，作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個(gè)方面：一是從隨機(jī)分離結(jié)果可以辨別的最大圖距，二是兩個(gè)標(biāo)記間可以檢測(cè)到重組的最小圖距。如果是構(gòu)建分子標(biāo)記骨架連鎖圖，可采用大群體中的一個(gè)隨機(jī)小群體 (如 150個(gè)單株或 株系 )，當(dāng)需要精細(xì)地研究某個(gè)連鎖區(qū)域時(shí)，可針對(duì)性地在骨架連鎖圖的基礎(chǔ)上擴(kuò)大群體。這種大小群體相結(jié)合的方法，既可達(dá)到研究的目的，又可減輕工作量。另外，作圖群體大小還可取決于所用群體的類型。由于 用較大的群體以保證每種基因型都可能出現(xiàn)。 1代 配子中基因的分離和重組，因此從作圖效率來看， 需太大的作圖群體。 在相 同 的作圖精度下，所需的群體大小的順序?yàn)?譚遠(yuǎn)德等， 2000）。 于構(gòu)建圖譜的分子標(biāo)記 子標(biāo)記技術(shù)的誕生和發(fā)展極大地促進(jìn)了遺傳圖譜的發(fā)展。分子標(biāo)記種類繁多，按其標(biāo)記原理主要可分為兩類（ 1996），一類是傳統(tǒng)的 以 交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如；另一類是基于 術(shù)發(fā)展起來的分子標(biāo)記，按照 需引物類型又可分為：（ 1）單引物 記，其多態(tài)性來源于單個(gè)引物長(zhǎng)度或序列的變異，包括有 技術(shù)；（ 2）雙引物選擇性擴(kuò)增的 記，通過引物 3端堿基的變化獲得多態(tài)性，主要指 記；（ 3）需要克隆、測(cè)序來構(gòu)建特殊雙引物的 記，如 記、小衛(wèi)星 衛(wèi)星 。常用于構(gòu)建圖譜的幾種分子標(biāo)記介紹如下 ： 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 ） ，為第一代分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是基因組 經(jīng)特定的內(nèi)切酶酶切消化 后，產(chǎn)生大小不同的 段，通過 跡和特定序列的探針雜交后，顯示出 子水平上的差異?；蚪M序列的改變引起內(nèi)切酶位點(diǎn) 的 缺失或插入，從而造成酶切后 段打消的多態(tài)性。與傳統(tǒng)遺傳標(biāo)記相比， 記具有數(shù)量豐富， 具 有 共顯性，且不受環(huán)境、組織特異性等因素干擾 的優(yōu)點(diǎn) ，因此，特別適合構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。由于 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 記 具有的這些優(yōu)點(diǎn)， 記 曾被廣泛應(yīng)用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建。盡管 術(shù)已在較為廣泛的研究領(lǐng)域得到應(yīng)用，并取得了許多令人矚目的研究成果，但 態(tài)性檢測(cè)的靈敏度不高， 鎖圖譜上還有許多的空間區(qū)。同時(shí)， 存在著操作復(fù)雜、成本高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等問題，特別是檢測(cè)中要使用放射性同位素，所有這些在很大程度上 限制 其推廣和應(yīng)用。 987 年，美國(guó) 司的 人推出了一種全新的生物技術(shù) 發(fā)明者因此而榮獲 1993 年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用，迄今已有的分子標(biāo)記技術(shù)除了 ，其余的都與 關(guān)，正是在 礎(chǔ)上， 1990）利用位點(diǎn)序列的核苷酸 片段（通常為 10 個(gè)堿基，也稱隨機(jī)引物（ 未知序列的基因組 行擴(kuò)增，獲得了不連續(xù)的 段，稱之為 用一系列引物， 以對(duì)整個(gè)基因組 行多態(tài)性檢測(cè)。因此， 可用于圖譜構(gòu)建工作。與 比，有以下優(yōu)點(diǎn)：（ 1）技術(shù)簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快；（ 2） 析只需少量 品；（ 3）不倚賴種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)，一套引物可用于不同生物基因組分析；（ 4）成本較低。但 1） 記是一個(gè)顯性標(biāo)記，不能鑒別雜合子和 純合子；（ 2）存在共遷移問題，凝膠電泳只能分開那些長(zhǎng)度相同但堿基序列組成不同的 段；（ 3） 術(shù)中影響因素很多，所以實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差。 術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)顯而易見，因此 術(shù)一經(jīng)發(fā)明就被迅速用于種質(zhì)資源、植物分類、基因定位、遺傳作圖等方面。 為第一代分子標(biāo)記已被廣泛地應(yīng)用于植物的遺傳作圖，而 為第二代分子標(biāo)記，又為分子連鎖圖譜提供了新的標(biāo)記來源。與 似的還有 用的引物較長(zhǎng)，一般為 10 50 使用的引物長(zhǎng)度比 至可短至 5這 3 種類似的標(biāo)記中， 用最為廣泛。 1993 年由荷蘭科學(xué)家 展起來的一種檢測(cè) 態(tài)性的新方法，是紋技術(shù)的重大突破，也是目前國(guó)際上 較