密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 利用 入突變和 涉技術(shù)研究水稻基因功能 .) NA .) NA 摘 要 水稻 (.)是世界上最重要的糧食作物之一，同時(shí)也是單子葉植物和禾谷類作物分子生物學(xué)研究的模式植物。目前水稻基因組序列測定工作已經(jīng)基本完成，預(yù)測的編碼基因超過40,000 個(gè)。已測定的水稻全長 隆數(shù)目也已經(jīng)超過 32,000 個(gè)。確定這些基因的功能將是今后研究的中心任務(wù)。鑒于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳 轉(zhuǎn)化方法近年來日趨成熟，利用轉(zhuǎn)基因的方法獲得突變體被認(rèn)為是水稻功能基因組學(xué)研究的主要途徑之一。本研究利用 入突變和 涉技術(shù)創(chuàng)制水稻突變體，并根據(jù)突變體的表型來研究相應(yīng)基因的功能和表達(dá)模式。 本研究是中國高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“水稻突變體庫的創(chuàng)制與功能基因組學(xué)研究”和國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“水稻受體激酶功能及其與環(huán)境信號分子的作用”的一部分，通過與合作者的共同努力，取得了以下主要研究進(jìn)展： 建立了一套高效快速的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化程序，從誘導(dǎo)成熟胚來源的愈傷組織開始，約 90d 后即可得到轉(zhuǎn) 化植株。獲得潮霉素抗性愈傷組織的效率超過 90%，由抗性愈傷組織分化再生植株的效率超過 80%， 交檢測表明大約 95%的潮霉素抗性植株含有入片段。提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵在于降低共培養(yǎng)溫度至 1922 在選擇培養(yǎng) 101512d。利用上述程序構(gòu)建了大規(guī)模的水稻增強(qiáng)子捕獲突變體庫。 評估了 強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)在水稻中的效率。對 9,120 株獨(dú)立增強(qiáng)子捕獲標(biāo)簽系的 色分析，觀察并統(tǒng)計(jì)了胚，胚乳和種皮中 因的表達(dá)頻率，約 40%的標(biāo)簽系在其中至少一個(gè)部位呈 性反應(yīng)。從陽性標(biāo)簽系中隨機(jī)挑選出 212個(gè)樣品，進(jìn)行 根和葉 )的 色分析，約 70%的樣品在其中至少一個(gè)部位呈 性反應(yīng)。利用 術(shù)從這 212 個(gè)樣品中分離擴(kuò)增 入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，共得到 127 條水稻基因組側(cè)翼序列，并對 插入位點(diǎn)和整合模式進(jìn)行了詳細(xì)的分析。根據(jù)插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列信息預(yù)測基因和啟動子，并隨機(jī)挑選了 10 個(gè)預(yù)測的啟動子進(jìn)行表達(dá)模式分析，有 6 個(gè)啟動子表現(xiàn)出與原增強(qiáng)子捕獲標(biāo)簽系相同的 達(dá)模式。上述結(jié)果表明強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)是一種分離水稻基因表達(dá)調(diào)控元件和研究水稻基因表達(dá)模式的有效方法。 利用 入引入 涉系統(tǒng)的方法，對一些預(yù)測的水稻類受體激酶基因進(jìn)行功能分析。通過對 涉植株的篩選，發(fā)現(xiàn)了 1 個(gè)新的與稻瘟病抗性相關(guān)的類受體激酶基因 (利用 交檢測從 因 涉植株中篩選出了 單拷貝插入且 因表達(dá)量明顯降低的株系用于進(jìn)一步的分析。對該株系的 涉植株和 因的 測，結(jié)果表明抑制 因的表達(dá)后，水稻對稻瘟菌 (敏感性增加，而過量表達(dá) 因可以增強(qiáng)水稻對稻瘟病的抗性，即 因的表達(dá)水平和水稻的稻瘟病抗性直接相關(guān)。 關(guān)鍵詞： 涉， 受體激酶，水稻，增強(qiáng)子捕獲 .) is of in a of of is 0,000 2,000 of is As is to of of In NA to on on is By as A . of of be as 0d of 0 0%, 5% 922 12d 015d. in 1 ,120 US on 0% in of at 12 US on 1 0% US CR 127 12 of in 0 6 US as of in on a on 1 0 to on V 目錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 稻基因組學(xué)研究概述 1 稻 入突變技術(shù)研究進(jìn)展 2 入與基因敲除 4 活標(biāo)簽技術(shù) 5 獲標(biāo)簽技術(shù) 6 入位點(diǎn)側(cè)翼序列的分離 8 涉技術(shù)研究進(jìn)展 9 涉的作用機(jī)制 10 涉的參與因子 11 涉的功能和意義 11 涉技術(shù)的特點(diǎn)和方法 12 涉技術(shù)在植物中的應(yīng)用 13 物類受體激酶基因研究進(jìn)展 14 研究的意義和技術(shù)路線 15 第二章 利用 17 料與方法 17 稻轉(zhuǎn)化所用雙元載體 17 稻材料和成熟胚來源的愈傷組織誘導(dǎo) 18 性愈傷組織的轉(zhuǎn)化 18 霉素抗性愈傷組織篩選和植株再生 18 V 生植株的 交檢測 19 果 19 稻遺傳轉(zhuǎn)化的效率及其影響因素 19 生植株的 交檢測 22 論 23 第三章 水稻增強(qiáng)子捕獲突變?nèi)后w的功能分析 24 料與方法 24 統(tǒng)的增強(qiáng)子捕獲功能 24 稻組織的 織化學(xué)染色 25 入位點(diǎn)側(cè)翼序列的分離 25 翼序列的測定 26 翼序列的同源性查找和啟動子預(yù)測 26 測啟動子的功能 分析 27 果 29 1代種子和幼苗中 因的表達(dá)模式 29 翼序列的擴(kuò)增 31 翼序列的結(jié)構(gòu)分析 32 入位點(diǎn)的分析 33 動子的預(yù)測和表達(dá)模式分析 33 入與 色表型的共分離分析 38 論 39 第四章 水稻類受體激酶基因的 涉分析 43 料與方法 43 稻用 涉誘導(dǎo)載體和基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建 43 受體激酶基因 涉、過量表達(dá)和啟動子檢測載體的構(gòu)建 45 瘟菌接種 46 交 46 交 47 測 48 果 49 稻用 涉誘導(dǎo)載體和基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建 49 受體激酶基因 涉載體的構(gòu)建 50 瘟菌篩選 涉突變體及相應(yīng) 因的結(jié)構(gòu)分析 51 因 涉植株的 測 53 因 涉植株的 抗瘟性檢測 53 因過量表達(dá)載體的構(gòu)建 55 因過量表達(dá)植株的 抗瘟性檢測 56 因表達(dá)模式的檢測 56 它 因的 涉突變體 58 論 59 結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn) 62 參考文獻(xiàn) 64 致謝 74 作者簡歷 75 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 水稻 (.)作為世界上最重要的糧食作物之一，是全球超過 50%人口的主要食 物和熱量來源。雖然近 30 年以來，新的高產(chǎn)品種的培育和耕作技術(shù)的進(jìn)步使得水稻產(chǎn)量翻番，但是仍然不能滿足今后的需求。據(jù)估計(jì)，今后 20 年里，全球?qū)τ谒镜男枨罅繉⒁悦磕?1%的速度遞增，這就要求水稻平均產(chǎn)量要在現(xiàn)有的約 4 噸 /公頃的基礎(chǔ)上大幅度提高。提高產(chǎn)量需要通過以下途徑來實(shí)現(xiàn)：培育更好的高產(chǎn)品種，同時(shí)提高主栽品種對于病蟲害和干旱、鹽堿、低溫等非生物逆境的抵抗能力。因此，從水稻中分離鑒定與產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和發(fā)育等農(nóng)藝性狀密切相關(guān)的基因，闡明它們作用的分子機(jī)理和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并應(yīng)用于育種實(shí)踐，是水稻生物技術(shù)研究的長期任務(wù)。水稻基因組學(xué)的研究是上述工作的基礎(chǔ)，對水稻基因組序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析，具有重要的意義 (et 2004)。 稻基因組學(xué)研究概述 水稻成為單子葉植物和禾谷類作物分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的模式植物 (n, 2001)，得益于以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：基因組小，僅 390右 (et 2005)；分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的基礎(chǔ)良好，積累了大量的背景資料 (et 2005)；已經(jīng)構(gòu)建了精細(xì)的遺傳和物理圖譜 (et 2002; et 2002)；建立了較為成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法 (et 1997; et 2004)；水稻與小麥 (玉米 (大麥 (黑麥 (高粱 (禾本科作物的基因組具有良好的共線性關(guān)系，因此水稻基因組結(jié)構(gòu)和功能分析的方法、技術(shù)和結(jié)果對這些作物的相關(guān)研究有重要的借鑒作用 (2002)。水稻和擬南芥 (因組序列測定和分析結(jié)果表明，兩種模式植物基因組之間的共線性關(guān)系十分有限，因此水稻基因組學(xué)研究具有不可替代的作用 (2000; et 2002; et 2002; et 2002)。 水稻結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究成果為功能基因組學(xué)研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 1997 年，國際水稻基因組測序計(jì)劃 (始實(shí)施，以粳稻 (種日本晴 (模式材料，繪制高質(zhì)量的基因組遺傳和物理圖譜，采用鳥槍法(定 1 隆序列并根據(jù)它們在物理圖譜上的先后順序進(jìn)行拼接，所得到的數(shù)據(jù)隨 時(shí)釋放到 公共數(shù)據(jù)庫中 (2000)。 2002 年 12 月完成基因組草圖的繪制，精確度達(dá)到 并預(yù)測了超過 60,000 個(gè)遺傳基因； 2004 年 8 月完成全部 12 個(gè)水稻染色體共 序工作量的 370并公布了裝配完成的 12 個(gè)染色體分子的 列；2004 年 12 月序列測定工作全部完成 (et 2005)。 司的水稻測序工作 (et 2002)同樣選擇日本晴為模式品種，結(jié)果表明水稻 基因組含有 32,00050,000 個(gè)基因， 98%的玉米、小麥和大麥的已知蛋白可以在水稻基因組中找到編碼其同源物的基因，對各類基因的數(shù)量及其在基因組中所占的比例也進(jìn)行了估算 (圖 日本水稻全長 定計(jì)劃工作組于 2003 年公布了他們的研究進(jìn)展 (et 2003)：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 2 從日本晴中分離并測定了 28,469 個(gè)水稻全長 隆的序列；通過在公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性查找，推測了其中 21,596(個(gè) 編碼的蛋白及其功能；通過將 隆作圖定位到基因組 ，揭示了水稻基因組中 19,00000 個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的位置；蛋白信息分析結(jié)果表明部分 碼的蛋白存在于水稻中，而不存在于擬南芥中， 64%的 碼產(chǎn)物可以在擬南芥中找到同源物。目前，全長 隆的測定量已達(dá) 32,127 個(gè)，克隆的平均長度為 圖 稻預(yù)測基因的分類 (et 2002) of 著序列測定及基因發(fā)掘工作的完成，確定這些基因的功能將是今后研究的中心任 務(wù) (An et 2005)。利用轉(zhuǎn)基因的方法獲得突變體被認(rèn)為是水稻功能基因組學(xué)研究的主要途徑之一，根據(jù)所得突變體的表型在分子水平鑒定與表型相關(guān)的基因，從而揭示它們的功能 (et 2004)。目前已經(jīng)獲得的各種類型的水稻突變體為基因的功能分析提供了極大的便利，突變表型涉及器官發(fā)育，形態(tài)發(fā)生和各種生理農(nóng)藝性狀，如葉、莖、根等營養(yǎng)器官以及花、花序、種子、胚、胚乳等生殖器官和組織的發(fā)育缺陷，生長期的變化和抗病蟲害及非生物逆境能力的改變等 (et 2005)。 入突變 ( 涉 (術(shù)是目前較為常用的兩條創(chuàng)制水稻突變體的技術(shù)路線。利用 入突變技術(shù)不僅可以獲得基因敲除 (變體，還能用于捕獲基因表達(dá)調(diào)控元件和獲得激活標(biāo)簽 (變體； 術(shù)能夠特異性的抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，其效率要高于傳統(tǒng)的反義 術(shù)。本研究利用這兩種方法對水稻基因進(jìn)行功能分析。 稻 入突變技術(shù)研究進(jìn)展 得基因的功能發(fā)生改變并產(chǎn)生突變表型， 簽”。與轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法相比， 后代中較為穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。根癌農(nóng)桿菌 (導(dǎo)的 化效率高，嵌合體少， 入基因以孟德爾方式遺傳等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)化的首選方法 (2003)。目前 對于 文獻(xiàn)綜述 3 (et 2004)，酚類化合物作為信號分子激活農(nóng)桿菌 物轉(zhuǎn)化所用的質(zhì)粒載體多為雙元 (體系統(tǒng)，即遺傳操作和攜帶轉(zhuǎn)移基因所用的小質(zhì)粒帶有去除了 質(zhì)?？稍诖竽c桿菌 (農(nóng)桿菌中繁殖；農(nóng)桿菌中的 前 et 2003; 2004; An et 2005)，其基本技術(shù)路線如圖 et 1999)。 圖 et 1999) 前已經(jīng)構(gòu) 建了多種類型的水稻突變?nèi)后w，包括普通的插入突變 (et 2004)，激活標(biāo)簽(et 2002)，基因捕獲 (et 2000; et 2004)和增強(qiáng)子捕獲 (et 2003; Wu et 2003; et 2004; et 2004)等，所得到的 00,000份。并對轉(zhuǎn)基因水稻 植株中 et 2003)， et 2003; An et 2003)以及 報(bào)告基因在水稻中的表達(dá)模式 (et 2005; et 2005)進(jìn)行了詳細(xì)的分析。從水稻 文獻(xiàn)綜述 4 相應(yīng)基因的功能分析 (et 2003; et 2003; et 2003, 2004a, 2004b)。 et 1999)：當(dāng) 可能造成無義突變 (即功能完全缺失；當(dāng)插入位點(diǎn)在啟動子或 3端非翻譯區(qū)上，有可能造成基因表達(dá)量降低；當(dāng)帶有啟動子的 能會使基因表達(dá)增強(qiáng)； 區(qū)也可能只造成基因功能的部分失活；當(dāng)基因組中存在多個(gè) 以發(fā)生多點(diǎn)敲除，使多個(gè)基因同時(shí)失活；另外 選獲得具有突變表型的株系后，需要先得到 后通過共分離 (或互補(bǔ)實(shí)驗(yàn) (根據(jù)側(cè)翼序列分析找到 對應(yīng)的野生型拷貝轉(zhuǎn)入突變株后，能夠使其表型恢復(fù)正常 )來確認(rèn)突變表型是由 目前植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)使得飽和突變 體庫的建立成為可能 (et 2003; 2003)。所謂飽和突變體庫是指在一個(gè)突變體庫中基因組的每個(gè)基因中都至少含有一個(gè)外源片段的插入。所創(chuàng)建的突變體庫的飽和程度是影響利用插入突變研究基因功能的效率的重要因素。 1999)認(rèn)為，決定一個(gè)特定基因中 因平均大小、基因組大小和 中只有一個(gè)因素，即 入 概率的計(jì)算可以由公式 P=1-(1-(L/C)中 n(2001)依據(jù)此公式估算，在假定 f=果突變體庫的 9%，庫的大小應(yīng)達(dá)到 471,000個(gè)標(biāo)簽系。 曾經(jīng)認(rèn)為 近年來的研究表明這種隨機(jī)性只是相對的， 錄活性高的區(qū)域 (et 2000)。 2003)對超過 1000個(gè) 有 標(biāo)簽在重復(fù)序列區(qū)；標(biāo)簽在基因內(nèi)部和基因間區(qū)的分布比例與這兩種區(qū)域在水稻基因組中的分布比例相吻合； 端和3端外側(cè)各 500及內(nèi)含子區(qū)域。 2003)從 6,749個(gè)水稻標(biāo)簽系中分離了 3,793條 建立了側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫，他們的分析表明在編碼區(qū)起始和終止位置，以及接近 有插入位點(diǎn)的平均 稻全基因組的1,846個(gè)被 記”了的基因按功能分類后的分布比例也與水稻基因組中各類基因的分布比例相似，表明 入頻率在染色體末端較高，著絲粒處較低。 2004)分離了 7,480條 據(jù)此在水稻染色體上定位了 6,645個(gè) 果表明 、 2、 3、 6號染色體上的插入頻率略高； 50慮到以上因素， 以及有些基因功能的破壞是致死的，不可能得到突變株，使水稻基因組飽和所需 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建的水稻突變庫， ， 3045%中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 5 的標(biāo)簽系為單拷貝插入。多拷貝插入的標(biāo)簽系比單拷貝插入的標(biāo)簽系更容易產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象。2003)對插入到水稻基因組中的 果表明 為穩(wěn)定，超過一半的 左邊界 (守性較低，缺失片段長度可達(dá) 180 NA(列； 5%，這對 et 2003)。 許多插入突變體沒有可見的表型改變，可能原因之一是突變基因有冗余 (同一基因家族的其它成員有功能重復(fù)。突變 體觀察不到表型的另一可能原因是所破壞的基因可能已經(jīng)進(jìn)化到僅在特定的生理狀態(tài)下才有功能，為檢驗(yàn)?zāi)骋晃粗δ芑虻挠袟l件表型，必須采用一系列環(huán)境條件或生理?xiàng)l件的處理加以誘導(dǎo)。而且許多基因在多個(gè)發(fā)育階段有功能，這些基因的突變可導(dǎo)致早期致死，或者可能有多效性，它能在一個(gè)特定的代謝途徑中掩蓋某一基因的作用。此外，瞬間表達(dá)的基因、表達(dá)水平很低的基因、以及在少數(shù)細(xì)胞中表達(dá)的基因，都可能難以被鑒定出來。因此在大多數(shù)情況下基因的敲除并不能夠產(chǎn)生明顯的表型變化，這給分析基因功能帶來了難度。對傳統(tǒng) 如激活標(biāo)簽和捕獲標(biāo)簽 (術(shù)，在一定程度上解決了上述問題。 對于一些被插入破壞后并不能導(dǎo)致明顯的表型變化基因，可以利用激活標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，產(chǎn)生功能獲得性突變。具體做法就是使 動或增強(qiáng)插入位點(diǎn)附近基因的轉(zhuǎn)錄，使它們過量表達(dá)或異時(shí)空表達(dá)。該技術(shù)已在擬南芥中得到廣泛應(yīng)用 (2003)。最常用的 花椰菜花葉病毒 ) 35 上游或下游 )，則可以激活正常情況下不表達(dá)或表達(dá)極弱的基因，導(dǎo)致顯性的功能獲得性 (變。另一種激活標(biāo)簽的方法是使 得被 前在擬南芥中已有應(yīng)用熱激的或化學(xué)誘導(dǎo)的激活標(biāo)簽系統(tǒng)分離鑒定基因的報(bào)道 (et 2000; et 2002)。激活標(biāo)簽系 統(tǒng)引起的基因表達(dá)增強(qiáng)，其突變表型一般在當(dāng)代植株中就能觀察到；增強(qiáng)子可以遠(yuǎn)距離作用，且不具備方向性，這些因素均有助于提高激活標(biāo)簽標(biāo)記基因的效率。目前還不能肯定增強(qiáng)子作用時(shí)是否會改變靶基因原有的表達(dá)模式(et 2000)。 2000)通過分析擬南芥 定出了 30個(gè)不同表型的顯性突變體，并證實(shí)在其中幾個(gè)突變體中與外源增強(qiáng)子相鄰的基因發(fā)生了過量表達(dá)。激活標(biāo)簽系統(tǒng)不僅可以用來分離與植物生長發(fā)育相關(guān)的基因，而且能夠用于植物抗病基因的分離鑒定 (et 2004)。 水稻中存在大量的冗余基因序列 (et 2002)，因此激活標(biāo)簽系統(tǒng)的引入對于研究這些基因的功能是十分必要的。 35et 2002)，抽樣分析結(jié)果表明大約 40%的增強(qiáng)子插入位點(diǎn)附近的基因表達(dá)量獲得升高。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 6 簽”的基因和報(bào)告基因 (合來反映該基因的活性或表達(dá)模式，可以在沒有突變表型和序列信息的 情況下鑒定出目標(biāo)基因 (2000)。該方法 可分離鑒定雜合子中的致死基因， 功能上冗余的基因和在多個(gè)發(fā)育階段發(fā)揮功能的基因， 而且報(bào)告基因檢測的敏感性使瞬間表達(dá)的、低豐度的和只在少數(shù)細(xì)胞中表達(dá)的基因也可分離， 這些都是傳統(tǒng)的遺傳分析方法難以做到的 。 捕獲標(biāo)簽系統(tǒng)有 3種基本類型：增強(qiáng)子捕獲，啟動子捕獲(基因捕獲，每種類型的系統(tǒng)都能對插入位點(diǎn)的順式作用元件作出反應(yīng) (圖 圖 強(qiáng)子捕獲，啟動子捕獲及基因捕獲載體的結(jié)構(gòu) (2000) of 強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)中的報(bào)告基因和一個(gè)基礎(chǔ)啟動子融合，基礎(chǔ)啟動子一般只包含 憑自身不能驅(qū)動報(bào)告基因的表達(dá)；但是當(dāng)帶有增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)的 些調(diào)控元件就會激活基礎(chǔ)啟動子，驅(qū)動報(bào)告基因的表達(dá)，同時(shí)這些元件和受到它們調(diào)控的植物基因就被報(bào)告基因“捕獲”了。 啟動子捕獲和基因捕獲系統(tǒng)包含無啟動子的報(bào)告基因 ，只有當(dāng)報(bào)告基因以正確的方向插入到一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位里時(shí)，才可能驅(qū)動報(bào)告基因的表達(dá)。啟動子捕獲系統(tǒng)需要報(bào)告基因插入到一個(gè)外顯子中，形成轉(zhuǎn)錄融合，然后被捕獲的啟動子驅(qū)動報(bào)告基因的表達(dá)。 通過檢測報(bào)告基因是否表達(dá)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 文獻(xiàn)綜述 7 以及報(bào)告基因在生物體中的表達(dá)部位，可以判斷報(bào)告基因插入位置附近是否有基因的啟動子存在以及該基因的表達(dá)是否有特異性。進(jìn)而可以從報(bào)告基因的鄰近順序中分離出啟動子及其相應(yīng)的基因。 2000)試驗(yàn)了用無啟動子的 過 分離水稻中的啟動子。 2004)構(gòu)建了 提高該系統(tǒng)在水稻中的捕獲效率。 基因捕獲系統(tǒng)在報(bào)告基因之前有一個(gè)或多個(gè)剪接受體序列，當(dāng)報(bào)告基因插入到一個(gè)內(nèi)含子中時(shí)，染色體上被捕獲基因的剪接供體位點(diǎn)就會和報(bào)告基因的剪接受體位點(diǎn)發(fā)生剪接，導(dǎo)致被捕獲基因的上游外顯子和報(bào)告基因的融合。除了轉(zhuǎn)錄融合，啟動子捕獲和基因捕獲系統(tǒng)還能產(chǎn)生翻譯融合，提供有關(guān)蛋白質(zhì)定位的信息。 3種基因捕獲系統(tǒng)各有優(yōu)缺點(diǎn)。增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)沒有報(bào)告基因必須以正確方向插入基因內(nèi)的限制，因此在該系統(tǒng)中報(bào)告基因的表達(dá)頻率較高，但 由于增強(qiáng)子能在相當(dāng)遠(yuǎn)的距離外激活基因的表達(dá)，給分離鑒定目標(biāo)基因及調(diào)控元件帶來了一定困難；啟動子捕獲和基因捕獲系統(tǒng)雖然有上述限制，導(dǎo)致報(bào)告基因表達(dá)頻率低，但是一旦報(bào)告基因表達(dá)，就表明報(bào)告基因很可能已經(jīng)插入基因內(nèi)部，使得被捕獲基因的分離鑒定相對增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)要容易一些。 圖 酵母的轉(zhuǎn)錄激活蛋白個(gè) 以特異性的結(jié)合到上游激活序列 (激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。因此，報(bào)告基因的表達(dá)與 來又用單純皰疹病毒 樣改建后的反式轉(zhuǎn)錄激活能力得到了進(jìn)一步加強(qiáng)。研究表明 et 1998; et 2004)。本研究采用改進(jìn)的水稻轉(zhuǎn)化方法，構(gòu)建了大規(guī)模的帶有群體。 該系統(tǒng)還可以用來誘導(dǎo)在 圖 其過程如下：首先利用載體 從中篩選獲得特異性的增強(qiáng)子捕獲系；然后利用載體 獲