密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 大豆 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子 基因的克隆與鑒定 2L.) 2L.) I 摘 要 鋅指蛋白是一類廣泛存在于原核和真核生物體中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 ， 在動植物的生長發(fā)育過程中均起著重要作用。 鋅指 蛋白又稱為 鋅指或經(jīng)典鋅指，是鋅指蛋白家族中最大的一個亞族，也是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中研究最多的一種與 蛋白質(zhì)結(jié)合的模式 結(jié)構(gòu)。 目前報道的植物 鋅指蛋白主要參與植物各個 時期的生長 發(fā)育， 以及脅迫應答的調(diào)控過程。 本 研究 通過 分析 豆 據(jù)庫 中 已知 的兩 段 保守 序列，發(fā)現(xiàn) 它們的 3和 5端拼接后其重疊部分具有 100% 同源性，表明它們是同一個基因序列的兩個片段，該序列 與已發(fā)現(xiàn)的大量的植物中的 鋅指蛋白保守基序 具有很高的同源性 。 根據(jù) 該序列 設計特異性引物，進行 得 了 一個 包含兩段序列的 放閱讀框序列，其 核苷酸 長度分別為 516 名為 碼一個具有 172 個氨基酸的蛋白，分子量約 19 有兩個由 21個氨基酸組成的 守基序，每個保守基序都具有植物 鋅指蛋白 特有的 一個典型的 鋅指蛋白 。 同時， 有 結(jié)構(gòu)序列。 定量分析表明： 表達受冷、 誘導。 夠 在大腸桿菌中以 合蛋白的形式表達 ， 純化融合蛋白 行凝膠阻滯實驗，結(jié)果表明 ：指蛋白在體外能與核心序列 很強的結(jié)合活性 ， 反向重復中的一半位點中引入兩個堿基突變的突變探針結(jié)合活性有所下降 ， 反向重復中的兩半位點中都引入兩個堿基突變的突變探針幾乎沒有結(jié)合活性 。 說明 指蛋白與核心序列 異性結(jié)合。 通過設計特異性引物 增及酶切、連接等方法獲得了 : 1 個缺失第一個保守域及與第一個保守域 C 端順次銜接的 7 個氨基酸的突變體 （命名為 、 1 個缺失第二個保守 域及與第二個保守域 N 端順次銜接的 19 個氨基酸的突變體 （命名為 和 3個分別缺失 7 個、 19 個和 26 個氨基酸的不同程度地縮短兩個保守域之間的距離的 分別順次命名為 。突變體凝膠阻滯實驗結(jié)果表明： 核心序列不結(jié)合， 氨基酸缺失 最少的 核心序列 結(jié)合活性比 幾乎不結(jié)合 。 說明 指蛋白的第一個保守域及與第一個保守域 C 端順次銜接的 7 個氨基酸、 白第二個保守域及與 第二個保守域 N 端銜接的19 個氨基酸對其與核心序列 結(jié)合都是必需的 ， 而 兩個保守域之間的氨基酸序列組成則 是影響 指蛋白與核心序列 結(jié)合的重要因素。 通過 將構(gòu)建的 因的雙子葉植物轉(zhuǎn)基因表達載體 空 體，借助于農(nóng)桿菌侵染法，轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中 發(fā)現(xiàn) ， 同期 轉(zhuǎn)基因型擬南芥的根長明顯小于 對照，但是側(cè)根 數(shù)目似乎 比轉(zhuǎn)入空 體的擬南芥 的多 ， 說明該基因可能參與根的發(fā)育。 氨基酸分析表明 表達 不僅 提高了 基因型擬南芥 中 脯氨酸的含 量，而且在低溫 脅迫 條件下， 轉(zhuǎn)基因型擬南芥中以脯氨酸為代表的多種氨基酸以及 含量在 5 小時都有顯著增加，且都明顯高于對照 , 說明能 對提高植物的抗冷特性有 一定的 作用。 本研究 克隆 的 因 ，是大豆中的一個新的轉(zhuǎn)錄因子基因，對其性質(zhì)和功能進行了初步研究。并通過突變鋅指蛋白基因， 初步 明確了鋅指蛋白的分子 作用 機制。 關(guān)鍵詞 ： 大豆 ， 錄因子 ， 鋅指 蛋白 ， 缺失突變 ， 脅迫 he of is an of in an in in of 2as a in a of At it is in In on ST of a a 2H2 an 16 bp a 9 KD 72 2H2 a of by as to in or in BA is . to in or of of of We of of or is of of is of of It of a is 2H2 on of ro is of in is in of of H3 in is in As a in is on is 錄 第一章 前言 . 1 錄因子的研究背景 . 1 物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu) . 1 錄因子的研究進展 . 3 指蛋白的研究進展 . 4 2指蛋白的起源 . 4 指蛋白的分類及 鋅指蛋白的基本結(jié)構(gòu) . 5 指蛋白調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能 . 6 物 鋅指蛋白 . 7 題目的、意義 . 10 術(shù)路線 . 11 第二章 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子 因的克隆 . 12 言 . 12 料 . 12 物材料 . 12 種及載體 . 12 及化學試劑 . 12 劑盒 . 12 物 . 12 序 . 12 要儀器 . 12 蛋白質(zhì)序列分析 . 13 法 . 13 豆基因組 提取 . 13 豆總 提取及純化 . 13 的質(zhì)量及濃度測定 . 14 . 15 . 15 物的回收與純化 . 16 接反應 . 16 受態(tài)細胞的制備 . 17 組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 . 17 粒 提取 . 17 切反應 . 18 2 物及酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測 . 18 列測定 . 19 果與分析 . 19 的基因 片段的獲得 . 19 標片段的 T 載體重組體構(gòu)建 . 21 組體的篩選和鑒定 . 22 標基因序列、 結(jié)構(gòu)及功能分析 . 23 論 . 27 第三章 表達特性與 其突變體的體外結(jié)合特異性及轉(zhuǎn)基因植物分析 . 28 料 . 28 物材料 . 28 株及載體 . 28 及化學試劑 . 28 劑盒 . 29 要儀器 . 29 法 . 29 因的表達特性分析 . 29 白及其突變體的體外結(jié)合特異性分析 . 29 化載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植物分析 . 35 果與分析 . 39 因的表達特性分析 . 39 白及其突變體的體外結(jié)合特異性分析 . 40 因轉(zhuǎn)基因植物分析 . 48 論 . 54 第四章 結(jié)論 . 56 參考文獻 . 57 致謝 . 65 作者簡歷 . 66 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 前言 1 第一章 前言 錄因子的研究背景 基因轉(zhuǎn)錄 分為 正調(diào)控和負 調(diào)控。如細菌基因的負調(diào)控機制是 ： 當一種阻遏蛋白 （ 結(jié)合在受調(diào)控的基因上時，基因不表達； 從靶基因上去除阻遏蛋白后， 合酶識別受調(diào)控基因的啟動子，使基因得以表達，這是正調(diào)控。這種阻遏蛋白是反式作用因子。 轉(zhuǎn)錄因子 （ F） 也稱反式作用因子，是指那些具有同真核生物啟動子特定列結(jié)合活性的蛋白質(zhì)分子，或者是具有已知 合域結(jié)構(gòu)特征的蛋白質(zhì)分子，其主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄效應。 轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄起始過程中 合酶所需的輔助 因子。真核生物基因在無轉(zhuǎn)錄因子時處于不表達狀態(tài)， 合酶自身無法啟動基因轉(zhuǎn)錄，只有當轉(zhuǎn)錄因子 （ 蛋白質(zhì) ） 結(jié)合在其識別的 列上后，基因才開始表達。 轉(zhuǎn)錄因子在 生物個體發(fā)育的復雜過程中，通過蛋白質(zhì)與 相互作用，實現(xiàn)了對基因表達的調(diào)節(jié)?；虮磉_的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，而在轉(zhuǎn)錄水平上與 生相互作用的蛋白質(zhì)分子中，最具多樣性的是轉(zhuǎn)錄因子。 植物各種誘導型基因的表達主要受特定轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。 自從 1987 年 繼從高等植物中分離出的調(diào)控干 旱、高鹽、低溫、激素、病原反應及生長發(fā)育等相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子已達數(shù)百種（ et 2001） 。 近年來，發(fā)現(xiàn)很多逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如大豆中 編碼一個受冷脅迫誘導的 鋅 指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的基因 et 2001） 。 在高等植物中結(jié)構(gòu)了解較清楚的是擬南芥中的 結(jié)合蛋白等少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子（ et 1997）。擬南芥基因組測序已經(jīng)完成，據(jù)推斷，至少有 1553個編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因 。 約占其估計基因總數(shù)的 （ et 2002） 。擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量如此之大，種類之多，表明了高等植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復雜性 。 所以，轉(zhuǎn)錄因子的研究，對揭示基因表達的發(fā)育調(diào)節(jié)的分子機理具有重要的意義。 如何 利用可以調(diào)控多個逆境相關(guān)基因的表達 轉(zhuǎn)錄因子來改良植物的抗逆性獲得 較為理想的效果 、明確 有關(guān)高等植物轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的結(jié)構(gòu)和功能已成為植物基因表達調(diào)控領(lǐng)域的熱門課題。 物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu) 從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析， 典型的植物轉(zhuǎn)錄因子 一般 具有 合 域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控域 （ 包括激活域或抑制域 ） 、寡聚化位點，以及核定位信號等 4 個功能區(qū)域。轉(zhuǎn)錄因子通過這些功能區(qū)域與啟 動子順式元件作用，或其它轉(zhuǎn)錄因子的功能區(qū)域相互作用來調(diào)控基因的表達。但是，不同的轉(zhuǎn)錄因子可能缺少某一結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控域（ et 1992）或 合域 （ 包括激活域或抑制域 ） (et 1997)。 典型的轉(zhuǎn)錄因子一般只有一個 合區(qū)，但有的轉(zhuǎn)錄因子如擬南芥（ 水稻（ 南芥（ 含兩個 合區(qū)（ et 2001） 。 在 長期演化過程中，盡管同類型轉(zhuǎn)錄因子的功能可能不相同，但它們與 合的結(jié)構(gòu)域或與其他蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域是高度保守的（楊致榮 等 ，2004）。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 前言 2 合域（ 合域是指轉(zhuǎn)錄因子識別 式作用元件并與之結(jié)合的一段氨基酸序列，相同類型轉(zhuǎn)錄因子 合域的氨基酸序列較為保守。 合區(qū)中氨基酸的排列決定了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的專一性。例如在水稻 白的 構(gòu)域中，第 14 位的纈 氨酸和第 19 位的谷氨酸決定了 白對 件的核心序列 ） 具有同樣的結(jié)合效率。在 白的 構(gòu)域中，第 14 位是 纈 氨酸，但第 19 位卻不是谷氨酸，而是 纈 氨酸，它與順式作用元件 結(jié)合活性大于與 結(jié)合活性 （ et 2003） 。因此，這段氨基酸序列決定了轉(zhuǎn)錄因子特異性。轉(zhuǎn)錄因子中其 它 氨基酸起到增強其結(jié)合的作用，另外， 合域的二級結(jié)構(gòu)也可能影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特異性。在這一過程中一些中性氨基酸殘基，例如脯氨酸和甘氨酸更為重要。 典型的高等植物轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域 有： 構(gòu)域 (et 1996)、鋅指結(jié)構(gòu)域（ 1998）、 構(gòu)域（ et 1995）、 構(gòu)域（ et 1997）、 構(gòu)域（ et 1997）、 構(gòu)域（ et 1996）以及 et 1997）結(jié)構(gòu)域等。其中的一些結(jié)構(gòu)域又可根據(jù)其特征中保守氨基酸殘基的數(shù)量和位置分為幾個亞類，如根據(jù)鋅指蛋白特征去中 半胱氨酸（ 組氨酸 (殘基的數(shù)量和位置分為： 3 亞類 錄調(diào)控域（ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控域是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)目的基因表達的區(qū)域，包括轉(zhuǎn)錄激活域和轉(zhuǎn)錄抑制域，它們決 定轉(zhuǎn)錄因子功能的差異。一般有一個或多個。將去掉的 合區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子與酵母 l 連接，形成融合蛋白，可用來研究轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活功能 (et 1997)。轉(zhuǎn)錄因子的主要區(qū) 別在于轉(zhuǎn)錄調(diào)控域各不相同 (et 1998)。轉(zhuǎn)錄因子的激活或抑制作用依賴于它對靶基因的轉(zhuǎn)錄起激活還是抑制作用。 轉(zhuǎn)錄因子對靶基因的抑制作用可能是通過與其他轉(zhuǎn)錄因子競爭同一順式調(diào)控元件進行的。 聚化位點（ 寡聚化位點是不同轉(zhuǎn) 錄因子借以發(fā)生相互作用的功能域。它們的氨基酸序列具有高度的 保守性 ，大多與 合域相連并形成一定的空間構(gòu)象，如 轉(zhuǎn)錄因子的寡聚化位點包括 1 個拉鏈結(jié)構(gòu)，而 b/ 轉(zhuǎn)錄因子含有螺旋 環(huán) 螺旋 結(jié)構(gòu)， 錄因子的寡聚化域則形成兩個螺旋和兩個折疊（ et 2001）。這些寡聚化位點空間構(gòu)象的變化導致了轉(zhuǎn)錄機制的多樣性，從而使轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控高等植物基因表達的能力。許多高等植物的轉(zhuǎn)錄因了形成異聚或同聚物以影響 合的特異性、轉(zhuǎn)錄因子對啟動子元件的親和（ et 1992）和核的定位 （ et 1997） 。 定位信號（ 核定位信號是轉(zhuǎn)錄因子中富含精氨酸和賴 氨酸殘基的核定位區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子進人細胞核的過程受該區(qū)段控制（ et 1994）。不同轉(zhuǎn)錄因子的核位信號在序列、結(jié)構(gòu)和數(shù)量上存在差中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 前言 3 異，主要是根據(jù)精氨酸和賴氨酸的排列分類。不同轉(zhuǎn)錄因子中 數(shù)目有所不同，一個轉(zhuǎn)錄因子可含 1 至數(shù)個 能區(qū)，它們不規(guī)則的分布在轉(zhuǎn)錄因子中，有的 玉米的 et 1995）轉(zhuǎn)錄因子的 存在于其他功能區(qū)域內(nèi)。 在研究 5 5在細胞中定位的分子機制時發(fā)現(xiàn)， 核定位信號對 5細胞分布有決定作用。目前，已經(jīng)在水稻的 et 1995），玉米的 轉(zhuǎn)錄因子 et 1995）等多種轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)了核定位信號區(qū)。不同植物轉(zhuǎn)錄因子核定位信號的序列、組織器官的分布和數(shù)量存在著差異。另外，不同轉(zhuǎn)錄因子的核定位信號的數(shù)目也不相同。有的轉(zhuǎn)錄因子只有一個核定位信號區(qū)，該類核定位信號區(qū)的堿性氨基酸或者聚集在一起或者形成兩個被非保守氨基酸隔開的功能群。而有一的轉(zhuǎn)錄因子具有多拷貝的核定位信號區(qū)，這些多拷貝 的核定位信號區(qū)或者在功能上相互獨立，或者成簇存在。 錄因子的研究進展 目前研究轉(zhuǎn)錄因子功能的方法主要有瞬間 表達 分析、突變分析、以及近年來發(fā)展起來的 間表達分析 瞬間表達分析可以較迅速地研究轉(zhuǎn)錄因子的 合特性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性 （ 激活或抑制 ） （ et 1998） 。轉(zhuǎn)化方法有基因槍、電擊法和聚乙二醇法等，在數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)可以進行測定。這種方法可以快速提供轉(zhuǎn)錄因子的 合特性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性等信息，根據(jù)材料的不同又劃分為 植物細胞 （ 或原生質(zhì)體 ） 瞬間轉(zhuǎn)化分析、酵母細胞瞬間轉(zhuǎn)化分析和動物細胞瞬間轉(zhuǎn)化分析。 能突變分析 與功能基因突變分析相同，轉(zhuǎn)錄因子也可以運用功能突變包括缺失突變和獲得突變進行分析。以前通過篩選自然突變體來獲得基因功能部分喪失的突變植株， 但效率很低，且篩選到的突變體數(shù)量有限?，F(xiàn)在都采取人工方法，僅 增加了所需突變體的數(shù)量，而且可以實現(xiàn)定點突變。 通過 人工獲得功能缺失突變體的方法有 T 入突變、轉(zhuǎn)座子插入突變、反義抑制以及 。反義抑制 (是指反向的基因全長或部分序列與高活性的組成型啟動子或組織特異性啟動子融合，通過轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。由于該序列所表達的 列與其靶 而抑制相應內(nèi)源基因的表達。共抑制 （ 是指正向的基因全長序列與高活性的組成型啟動子或組織特異性啟動子融合，通過轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株中該序列所表達的 制了相應內(nèi)源基因的表達。擬南芥、玉米和矮牽牛都有大量的插入突變體群體。該方法已成功用于分離擬南芥轉(zhuǎn)錄因子 因家族的突變體 （ 1999） 。它的主要的局限性在于植物中有一定數(shù)量的基因是多拷貝的，有的甚至緊密的串聯(lián)在一起，通常不易得到目標基因的純合突變體。雙鏈 是指同時表達的同基因序列的正義和反義 形成的雙鏈 構(gòu)，它能強有力地抑制相應內(nèi)源基因的表達。抑制機理目前仍不清楚，但已有證據(jù)表明植物中 引起細胞質(zhì)中同源 解及細胞核中同中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 前言 4 源基因組 基化，從而使目標基因沉默 （ et 2001） . 轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定及突變分析主要利用超表達和 誘導表達 兩種 方法 。超表達是指目的基因全長序列與高活性的組成型啟動子或組織特異性啟動子融合，通過轉(zhuǎn)化獲得該基因產(chǎn)物大量積累的植株。應用該方法已經(jīng)鑒定了一些高等植物的轉(zhuǎn)錄因子，但是該方法也有其局限性?；虻某磉_會導致致死效應或強烈的多重效應，從而很難從表型中鑒定出所需的轉(zhuǎn)基因植株，即使得到轉(zhuǎn)基因植株，也很難評價其超表達的程度。而基因誘導表達可以實現(xiàn)基因表達的時間控制、空間控制和數(shù)量控制，就