密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 利用噬菌體展示技術(shù)鑒定豬 瘟病毒 白 抗原 表 位 2 2 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 1 - 第一章 緒 論 在抗原分子表面具有特殊立體結(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團稱為抗原決定簇（ 由于抗原決定簇通常位于抗原分子的表面，因而又稱為抗原表位（ 戴和平等， 2002），是 具有刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞并能夠與抗體或細胞識別的部位 。正確而詳細地繪制抗原表位圖譜對疾病的診斷、定點改造蛋白質(zhì)分子以降低蛋白質(zhì)藥物的免疫原性，設(shè)計無毒副作用的人工疫苗以及免疫治療劑等有重要的意義。例如， 基于多個表位的疫苗可以避免由于病毒的變異而造成的免疫失敗，又很容易與野毒株區(qū)別開來，為疾病的凈化提供條件。 豬 瘟 （ 豬 瘟 病毒（ 起 豬的一種高度接觸性傳染病 ， 臨床上主要以稽留高熱、皮膚和粘膜出現(xiàn)大量出血點為特征（ et 1991）。豬瘟 被 世界動物衛(wèi)生組織（ 列入 病名錄（ ， 為 須申報 的（ 動物 傳染病 ，我國 也 將其列為一類傳染病 。 自 1983 年爆發(fā) 的百余年 來， 已經(jīng)遍布全世界（除北美洲和大洋洲外）， 給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。盡管世界各養(yǎng)豬大國對 但是由于 參差不齊的疫苗質(zhì)量 、 不合理的免疫程序 以及 野豬 群中 攜帶 的 豬瘟病毒 等因素 ， 致使 前 仍 是 威脅各國養(yǎng)豬業(yè)的一個極重要的傳染病 ， 每年用于預(yù)防接種、治療、撲殺的費用數(shù)以億計，因其影響畜產(chǎn)品的 貿(mào)易所造成的間接損失更是不可估量。 瘟病毒 概述 于黃病毒科（ 病毒屬（ 員（ et 1992），與其同屬的還有牛病毒性腹瀉病毒 I 型 （ ， 、牛病毒性腹瀉病毒 2 型（ ， 綿 羊邊界病病毒（ 長頸鹿瘟病毒（ of 。 因組為單股正鏈 約 et 1996； et 1996； et 1996）， 5端無帽子結(jié)構(gòu)， 3端也沒有多聚腺苷酸（ ）尾。含有一個大的開放性讀碼框（ 由其編碼一條約 3 898 個氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻譯和翻譯后加工過程中形成 12 種成熟的病毒蛋白，在聚蛋白上從 N 端到 C 端的順序依次為： C、 C、 于 復(fù)制是必不可少的（ et 1996）。四種結(jié)構(gòu)蛋白 C、 ，只有 以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，抵御強毒攻擊。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 2 - 瘟病毒 結(jié)構(gòu) 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能 C 蛋白 C 也稱 病毒的衣殼蛋白，由病毒 的 成，是一 帶 大量堿性電荷的蛋白質(zhì)。其主要區(qū)域在瘟病毒中極為保守，同源性大于 91%（ et 1991）。 端由 稱 水解作用而產(chǎn)生， C 端可能是由宿主細胞的信號肽酶作用所致（ et 1993）。 稱 8，舊稱 病毒囊膜糖蛋白。由 227 個氨基酸殘基（ 成，分子量約為 44誘導(dǎo)產(chǎn)生中和譜很窄的中和抗體。 有疏水的膜錨定結(jié)構(gòu)，為可分泌蛋白。它在由細胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒顆粒囊膜上并不穩(wěn)定，在細胞培養(yǎng) 卻含有大量被分泌出的 僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，而且也是一種功能性蛋白，它與 宿主細胞的嗜性以及致病力有密切關(guān)系，但該蛋白不是細胞培養(yǎng)所必需的（ 1997），失活后可引起細胞病變（ et 1998）。 性（ et 1994； et 1996），可降解病毒和細胞的 活性可能是維持 細胞致病性所必需的，因為通過使 性失活得到的突變病毒在其感染的宿主細胞出現(xiàn)了 導(dǎo)致免疫抑制， 完全抑制由刀豆素 導(dǎo)的豬、牛、羊和人淋巴細胞的增殖，強烈抑制動物淋巴細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成（但不損害細胞膜 )，引起淋巴細胞的凋亡，但是卻不能引起上皮細胞的凋亡 et 1998；。由于 具有的底物特異性，即針對尿苷的嗜好性以及其活性受 影響，因此這種選擇性引起細胞凋亡的特性是可以理解的。 宿主嗜性也與 關(guān)，用 和單抗可有效阻斷 易感動物細胞的感染（ et 1997）。 表現(xiàn)出神經(jīng)細胞毒性和抗凝集活性， 染動物后所產(chǎn)生的 近有研究表明， 變后失去 性，并使病毒毒力降低（ et 1999）。 稱 病毒囊膜糖蛋白。由 195 個氨基酸殘基（ 成， 常和 成異源二聚體，在免疫沉淀試驗時共沉淀出來。一般認為 聚化后包埋在病毒囊膜內(nèi)，不能誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體，也不能保護豬抵抗致死量 攻擊。最近有實驗證實，含 力遺傳確定因子（ et 2005）。 膜糖蛋白，也稱 編碼 370 個氨基酸殘基 （ ，分子量約為53非糖基化的肽鏈骨架分子量為 面有 5 個 常有 34 個位點被糖基化，因此隨糖基化程度的不同而呈現(xiàn)出不同的分子量 et 1999 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 3 - 與病毒對細胞的感染過程，攜帶有能刺激機體產(chǎn)生保護性免疫的抗原決定簇，是 et 1990），常以二聚體形式存在于病毒粒子及 染的細胞表面，其二聚體包括分子量為 100同源二聚體及與 成的分子量為 75體外， 誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒的中和抗體，在體內(nèi)可誘導(dǎo)抗 保護性免疫，保護豬抵抗致死劑量 攻擊。 3 個病毒糖蛋白中保守性最低、最易變異的分子。保護性抗原 白上存在 4 個不同的抗原區(qū)域 A、 B、 C、 D（ et 1993； 1994）。 A 區(qū) 可進一步分為 區(qū)， 守， B、 C、 D、 易變異。 B 和 C 區(qū)域的抗原表位可誘發(fā)動物的保護性免疫反應(yīng)。在 A、 B、 C 3 個中和區(qū)中，各有一段與中和性密切相關(guān)的高頻突變序列或位點。這些序列或位點的突變株將逃脫中和性單抗的中和作用，免疫血清對這類突變株的中和作用也會降低（ 謝慶閣 等， 1996）。 以前并不認為 一個主要的 T 細胞抗原（ et 1993），近來， 用穩(wěn)定表達 d/胞作為靶細胞在 d/驗中鑒定出 細胞毒性 et 2005）。 是 毒力確定因子，因為只用株的 換就足以使 毒株致弱（ et 2005）。 值得注意的是， 子內(nèi)部有一抗原表位，它在豬瘟病毒各毒株間保守，即從 結(jié)合單抗為 但是這段區(qū)域在 株間卻非常易變，因此它具有一定的診斷價值（ et 2000； Yu et 1996）。另外， 病毒吸附進入細胞方面也發(fā)揮了重要作用，只是它不 像 細胞表面具有相應(yīng)的受體而呈特異性結(jié)合，它的結(jié)合是非特異性的（ et 1998）。 瘟病毒抗原表位的研究 進展 早期 對 利用 對豬瘟病毒抗原表位進行了大致的分區(qū)（ et 1989； et 1993； 1994），并沒有進行精確地定位。隨著免疫學(xué)理論、蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，及生物物理學(xué)的發(fā)展和生物物理技術(shù)、計算機技術(shù)的廣 泛 應(yīng)用，人們對蛋白質(zhì)抗原表位的研究方法和思維方法有了新的進 展。 2糖蛋白是 能獨自誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和性抗體，保護機體免受強毒的攻擊，尤其是 為近年來研制新型疫苗和血清學(xué)診斷抗原及 2000）通過基因缺失突變的方法發(fā)現(xiàn)， 緒 論 - 4 - （ 2006）利用噬菌體展示隨機肽庫將此表位精確定位于 該表位 在豬瘟病毒 毒株間 高度保守，而在 且 示該表位具有潛在鑒別診斷 用價值 。 1996）通過靶基因表位文庫和噬菌體展示隨機肽庫，同時使用人工合成表位肽進行驗證，結(jié)果 表明在 端存在一個線性表位，核心序列為 。 但此表位 接近 能 充分暴露 于 病毒粒子表面， 故 不與完整病毒粒子反應(yīng)。這一表位在瘟病毒屬的不同成員中是高度保守的，因此被認為是瘟病毒共有的抗原表位。 2002）也通過多肽疫苗證實 2蛋白氨基酸序列中的 一抗原表位。 （ 2006） 構(gòu)建了 6 個 涵蓋 白 A 抗原區(qū)重疊的多肽疫苗，將此 6 個多肽 疫苗分別免疫豬只，結(jié)果多肽疫苗 以誘導(dǎo)機 體產(chǎn)生潛在的保護率，而其它表位疫苗表現(xiàn)出很弱或者無保護率。表明 間內(nèi)存在線性中和決定族，但在此研究中作者未對兩個抗原決定族進行精確的定位。 （ 2005） 通過構(gòu)建多肽疫苗鑒定出在 白 B/C 抗原區(qū)（ 以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生多肽特異性的中和抗體，并且可以保護 機體抵抗致死量的 的攻擊。作者在2006 年對此區(qū)間的多肽構(gòu)建了 5 個截短多肽疫苗，分別進行豬體免疫結(jié)果表明在 存在 線形中和表位，但 沒有精確定位。 （ 2002） 通過構(gòu)建多肽疫苗 鑒定出在 蛋白 N 端（ 在一個線性中和表位。隨后在 2006 年（ et 2005）的研究中，構(gòu)建了 4 個表位多肽疫苗，動物實驗結(jié)果表明表位疫苗 以誘導(dǎo)高水平的中和抗體，由此表明 白 N 端的一個中和表位。 2001）應(yīng)用大腸桿菌表面展示技術(shù)，構(gòu)建豬瘟病毒 行 性表位 的 分析， 結(jié)果 在 （ 2001）表明該表位具有鑒別診斷功能，它不僅能夠?qū)?且 在以 夠?qū)⒁呙缑庖哓i和野毒感染豬鑒別開，具有很好的應(yīng)用前景。 2004）等 將 87株多聚蛋白 構(gòu)建了截 短 的 重疊氨基酸片段分段表達于大腸桿菌中，然后 利用豬瘟病毒抗血清通過 們 的活性，發(fā)現(xiàn)都位于以這三個區(qū)間存在抗原決定族。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 5 - 1995）通過構(gòu)建一系列含 定出 為 細胞的表位，位于 表位也是第一個鑒定出來的 10進行 結(jié)果 發(fā)現(xiàn) 35個具有 中的 9肽 （ 和 15肽（ 用最強，作者已將所有這些序列申請專利保護。 2002）人工合成重疊多肽，分別 免疫 動物，通過測定 多肽的 現(xiàn)多肽 二次刺激后能誘導(dǎo) 干擾素的產(chǎn)生，在 細胞毒性試驗中， 淋巴細胞能溶解含有該段多肽的靶細胞，提示該肽段存在 細胞抗原表位和 目前已知的 于單克隆抗體針對的表位不夠廣泛，因此所反映的抗原信息受到一定程度的限制，從而不能鑒定出所有的 于多數(shù)已鑒定的表位，未闡明關(guān)鍵性氨基酸的分布及表位氨基酸變異與其免疫反應(yīng)性的相關(guān)性。目前，有關(guān) 實上，只有大約 10%左右的表位為線性表位， 90%左右是構(gòu)象依賴型的。目前對于構(gòu) 象表位來說，缺乏簡單可行的精確定位方法。相比而言，噬菌體展示技術(shù)是當(dāng)前較為適合篩選構(gòu)象表位的工具。 原表位研究方法 抗原表位有兩種分類方法：一是根據(jù)細胞抗原受體不同，分為 細胞抗原表位。另一是按結(jié)構(gòu)不同，分為連續(xù)性抗原表位和不連續(xù)性抗原表位，前者又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成；后者又稱構(gòu)象型表位，是由那些一級結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的氨基酸殘基，經(jīng)過肽鏈的折疊在空間聚集在一起而形成的一定的空間結(jié)構(gòu)（沈倍奮， 2001）。 以其表面的 蛋白抗原表位（抗原決定簇）結(jié)合，此過程與抗原 抗原表位的預(yù)測法 該法適用于已知一級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽抗原的線性表位的預(yù)測。人們通過觀察抗原表位與已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)某些結(jié)構(gòu)特征關(guān)系 ， 發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)的序列或結(jié)構(gòu)特征與抗原表位有關(guān)。從 80 年代 出親水性參數(shù)對抗原表位預(yù)測的方法以來（ et 1981）， 已有許多參數(shù)、算法發(fā)表對 B 細胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動作用。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 6 - 現(xiàn)已被大眾認可并具有較好預(yù)測效果的方法 ， 主要有以下 6 種 ： (1) 親水性方案 （ 常用的有五種方法 （ et 1983）： 中以 案最為有名。蛋白質(zhì)抗原各氨基酸殘基可分為親水殘基和疏水殘基兩類。在機體內(nèi) ， 疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部 ， 而親水性殘基位于表面 ， 因此蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系。案是以殘基由有機相環(huán) 境轉(zhuǎn)移到水相環(huán)境的自由能為依據(jù)計算各個氨基酸的親水性 。 現(xiàn)已明確 ， 親水性部位與抗原表位并無很好的一致性 ， 即高親水性部位不一定是表位 ， 表位也不一定是親水性部位。 (2) 可及性方案 （ 如 及性參數(shù) ， 指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性 （ 1990） 。它反映了蛋白質(zhì)抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況。 (3) 抗原性方案 （ 對 20 個已研究得很透的蛋白質(zhì)的 69 個連續(xù)位點的 606 個氨基酸統(tǒng)計分析 ， 立了抗原性刻度 （ et 1985） 。每個氨基酸用出現(xiàn)在抗原區(qū)的頻率描述 ， 此頻率除以各氨基酸在所有蛋白質(zhì)中的頻率就可推出此刻度值。該法研究表明 ， 疏水性氨基酸殘基對抗原表位形成亦有貢獻。缺點是其所用的數(shù)據(jù)庫有限 ， 并且連續(xù)位點內(nèi)的殘基被認為是同等重要的。顯然那些不重要的殘基歸入計算會明顯降低相關(guān)性。 (4) 可塑性方案 （ 指蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的 ， 其多肽鏈骨架有一定程度的活動性 ， 活動性強的氨基酸殘基即可塑性大的位點 ， 易形成抗原表位。 于已知結(jié)構(gòu)的 31 個蛋白質(zhì)的 溫度因子 ， 發(fā)展了一種預(yù)測蛋白質(zhì)片段活動性的方法 （ et 1985） 。 (5) 電荷分布方案 （ 認為對堿性抗 原特異的抗體多趨于酸性，對酸性抗原特異的抗體多趨于堿性 （ et 1997） 。 (6) 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方案 （ 認為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu) ， 多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面 ， 利于與抗體嵌合 ， 較可能成為抗原表位。而螺旋、片層結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變 ， 較難嵌 合 抗體 ， 一般不作為抗原表位 （ 來魯華 ， 1993） ?？深A(yù)測蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)角的有 中各種方法預(yù)測的成功率均不超過 65%。一般認為 對于已知折疊類型的蛋白質(zhì) （ 類、 類和 /類） 正確率高達 95%， 對于未知結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì) ， 可用 3種類型分別預(yù)測 ， 3類預(yù)測一致的轉(zhuǎn)角對預(yù)測表位有幫助。 用上述各種方案單一的來預(yù)測表位，其準確率均不高，最好將多種方案綜合考慮。概括而言，作為 利于與抗體結(jié)合。另外，具有一定柔韌性，因中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 7 - 為抗原與抗體結(jié)合時蛋白 構(gòu)象有一定的變化。用軟件預(yù)測出的抗原表位需用實驗進一步驗證。在實際應(yīng)用中，常用 克隆、表達，檢測表達產(chǎn)物與抗體的反應(yīng)性，但常因表位預(yù)測不準或表達產(chǎn)物沒有糖基化、不能正確的折疊而不與抗體反應(yīng)。 化學(xué) “ 切割 ” 法或酶解法 將純化的蛋白質(zhì)多肽用某種化學(xué)試劑或蛋白酶切割成若干小片段，經(jīng) 分離開來，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，再用單克隆抗體或高免血清進行 測小段多肽與抗體是否有反應(yīng)，有反應(yīng)的多肽片段中就含有抗原表位。使用這種方法需要知道蛋白質(zhì)的一級 結(jié)構(gòu)，并且事先清楚切割片段的大小。在實際工作中可以將蛋白質(zhì)序列輸入用工具欄中的 “ “ 可以列出幾種試劑（或酶）的切割位點和切割片段的數(shù)量，例如： 以從甲硫氨酸（ M）處將多肽切割成若干小片段。 肽探針掃描技術(shù)（ 術(shù)） 術(shù) 是指合成連續(xù)的重疊的短肽，與相應(yīng)的抗體反應(yīng)，分析檢測結(jié)果以確定陽性反應(yīng)片段。這一技術(shù)要求有明確的抗原一級結(jié)構(gòu)，并且檢測結(jié)果為線性抗原表位，對 構(gòu)象型表位則無法獲知，而且合成多肽的費用較高。 白雪帆等（ 2000）利用單抗對人工合成的 15 肽和 8 肽兩個陣列進行了免疫學(xué)的檢測，從而確定了漢坦病毒的抗原表位。（ 2000）利用一系列交叉重疊的多肽鑒定了狂犬病毒 N 蛋白中一個位于 抗原表位。 肽庫 （ 肽庫是大量的某一長度范圍的短肽集合 ， 它包括了該長度的短肽的各種可能的序列或其中的絕大部分 ，是一種強有力的用于快速研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間相互作用的工具（ et 2002） 。 肽庫基本可以分為以下 3 種類型 ： 有機合成肽庫、基因工程肽庫和突變體肽庫 。有機合成肽庫就是直接利用固相肽合成技術(shù)，合成含有各種可能序列的短肽集合。通過這種合成可以保證各種序列的多肽等幾率出現(xiàn)。每個載體上只含有一種序列的短肽，其優(yōu)點是構(gòu)建方法簡單快速；缺點是不能擴增，價格昂貴?；蚬こ屉膸焓侵赶壤没蚩寺〖夹g(shù)將合成的一組寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式在噬菌體的外殼蛋白的氨基端表達（有關(guān)噬菌體 展示 肽庫將在下文中詳細表述）。突變體肽庫是指某一抗原蛋白的一系列突變體的集合，通過其與抗體的結(jié)合反應(yīng)的強弱，判定與該抗體結(jié)合的抗原表位的位置，其中 的各突變體與天然抗原一般僅有 1 個氨基酸的差異。構(gòu)建突變體庫的方法有：變體文庫（ et 1996）、 法構(gòu)建的突變庫（ et 1992）。對于已經(jīng)粗略定位的表位來說，可以合成多肽突變體庫（組）進行精確地定位。 分析 抗 原 X 射線衍射被認為是真正能夠反映抗原、抗體相互識別的一種技術(shù)。該技術(shù)最初研究抗原抗體相互作用時抗原中氨基酸的參與識別情況以及表位類型（線性或構(gòu)象型）。 但該技術(shù)受獲得抗原 物的晶體的限制。法可避免結(jié)晶，但其只能研究小分子的多肽抗原。由于對設(shè)備有特殊要求，所以該技術(shù)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 8 - 在一般實驗室的應(yīng)用受到限制。 蛋白質(zhì) 實際應(yīng)用中，常根據(jù)具體情況選擇應(yīng)用。 是抗原經(jīng)過抗原提呈細胞 （ 加工后 ， 由 淋巴 細胞受體 （ 的短肽。 確定 于研究細胞免疫機理、過程及研制亞單位多肽疫苗和基因疫苗具有重要的意義。目前 研究 法主要有： 合成重疊肽法 即在合成 重疊的肽后，通過 細胞識別的肽段，即 管應(yīng)用該方法成功鑒定了幾個 是這種方法有其局限性 ，不但工作量大，費用高，而且由于合成的重疊肽一般是 10個氨基酸 殘基 ， 含有 5個氨基酸重疊，因此重疊區(qū)之間的表位就可能被忽略了，所以不能夠鑒定出目的蛋白上所有的 即根據(jù) 預(yù)測表位，再合成肽段，以 前已經(jīng)有 很多預(yù)測方法，這些方法可以概括為 3種類 型 ： a）根據(jù) 據(jù)用已構(gòu)建的 et 1990） 。但不是所有預(yù)測的抗原表位都能與b) 根據(jù)多肽結(jié)構(gòu)預(yù)測：如 分析 射圖入手找到對應(yīng)的口袋，錨插入口袋時結(jié)合的前提。 c) 根據(jù)蛋白酶體裂解特點預(yù)測：如 些蛋白酶體裂解產(chǎn)物是作為 此蛋白酶體的裂解特性決定抗原蛋白的特定序列是不是可能作為 et 1990） 。在 有一些根據(jù) 目前對于人和哺乳動物 于畜禽 國內(nèi)這方面研究尚處于初始階段。國內(nèi)表位研究偏向于 疫與診斷，尚未見直接從亞分子水平對 陳繼明等 ， 1998）。 菌體展示技術(shù) 在抗原表位研究中的應(yīng)用 噬菌體展示技術(shù)的原理 噬菌體展示技術(shù)（ 985年開創(chuàng)的 （ 1985） 。其原理是將外源基因整合到噬菌體的基因組中，外源蛋白與噬菌體衣殼蛋白融合表達，并展示在噬菌體表面，從而將多肽的基因型與其表型直接聯(lián)系起來，再利用生物分子間的親和力（如酶 原 體 行篩選，將感興趣的蛋白質(zhì)或多肽從庫中挑選出來。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 9 - 噬菌體展示技術(shù) 在抗原表位研究中 的應(yīng)用 確定抗原表位 ， 包括表位的序列和構(gòu)象 ， 是免疫學(xué)家感興趣的一個問題。表位的確定不僅可以了解有關(guān)免疫反應(yīng)的眾多信息 ， 為進一步人工控制免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ) ， 而且對藥物 合成、疫苗設(shè)計等也具有指導(dǎo)意義。確定表位常用的方法有 ： 還原法、蛋白印跡法、肽掃描、突變分析等 ， 后兩種方法還同時解決了蛋白分子一級序列問題（ et 1997） 。但這些方法大多困難而繁瑣。 近幾年來，噬菌體展示技術(shù)成為探測蛋白空間結(jié)構(gòu)、探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具，在蛋白分子相互識別的研究、新型疫苗的研制以及腫瘤治療等研究領(lǐng)域產(chǎn)生 了 深遠的影響。 肽庫 （ 的應(yīng)用為確定表位序列以至其 構(gòu)象提供了另一有力工具。 噬菌 體 展示 肽庫是以噬菌體外殼蛋白 P 或 P 基因為載體，插入一段編碼外源短肽的基因片段，噬菌體的浸染能力不受到影響，而外源短肽亦可在噬菌體表面 P 或 P 蛋白 1990年 融合，并 展示 在噬菌體表面，首次建立了噬菌體隨機肽庫。 從噬菌體 展示 隨機肽庫中篩選抗原表位的基本原理是生物淘選（ 以單克隆抗體篩選蛋白質(zhì)抗原表位為例，其基本技術(shù)流程如下：將單抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌體 展示肽庫，使其充分與單抗反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體 ，再用洗脫液將結(jié)合狀態(tài)的噬菌體洗脫下來。將其浸染宿主大腸桿菌擴增后回收，再進行下一輪篩選。通常經(jīng)過 3、 4輪的篩選，并且每次增加篩選強度，這樣就可獲得與單抗結(jié)合較緊密的噬菌體克隆。通過序列測定和分析，就能推知該噬菌體克隆所攜帶的外源短肽序列，從而確定該單抗所針對的抗原表位。 借助于噬菌體 展示 肽庫技術(shù) ， 已經(jīng)成功分析了多種蛋白質(zhì)抗原的表位 ，如 et 1993； 杜勇等， 2000） 、 杜勇等， 1999； et 2001； 潘衛(wèi)等， 2001） 、日本 血吸蟲 （歐陽理等， 2002） 等 ， 說明完全可以利用隨機肽庫鑒定抗原的線性和構(gòu)象表位 ， 大大簡化了重組免疫原的克隆、鑒定和表達等過程 ， 為表位鑒定研究增添了新的手段。 絲狀噬菌體具有免疫原性，無須佐劑即可產(chǎn)生抗體，這意味著噬菌體展示系統(tǒng)可以作為候選疫苗抗原表位的遞呈工具。 利用展示肉毒梭菌 中和表位的噬菌體不加佐劑直接免疫小鼠，血清疫小鼠是對照小鼠的 10倍。表明噬菌體展示的表位具有明顯的抗原性 。 噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點 噬菌體展示技術(shù)作為一種新興的研究方法和工具，在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上已被廣 泛應(yīng)用。它具有很多顯著的優(yōu)點，如： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 10 - A. 高通量的淘選 將靶標分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數(shù)量可達 1011 利用抗原 能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，如此反復(fù)數(shù)輪擴增、淘選，即可將有用的基因從多達百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。 B. 可用于模擬表位的篩選 利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報道較多（ 2001；et 2002； et 2003）。李全喜等（ 1997）利用單抗 9選噬菌體隨機肽庫，結(jié)果獲得了兩個陽性克隆，其中一個與抗原天然序列同源，而另一個則完全不同（即為模擬表位）。模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如 利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。 C. 易于純化 重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實驗室條件下就可以完成。目前用于鑒定表位和受體所用的噬菌體載體為 鏈噬菌體。由于 菌體是溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的 噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過離心收集培養(yǎng)上清，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。 盡管如此，在噬菌體展示技術(shù)中仍然存在一些不足。首先，目前所建的肽庫容量只能達到 109，要想構(gòu)建大片段的肽庫很困難。其次，需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數(shù)多肽由于疏水性過強，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。作為一種新技術(shù)，類似的具體問題還很多。但這些暫時的缺點并不能掩蓋其巨大應(yīng)用潛力。 究內(nèi)容和方法 本研究擬對 2蛋 白進行抗原表位的鑒定。主要研究內(nèi)容有： 2單克隆抗體 2肽庫進行抗原表位的篩選 。 備 體，然后 用 噬菌體 展示 肽庫篩選抗原表位。 抗原表位的研究方法中，以表達蛋白或合成短肽結(jié)合單克隆抗體的方法應(yīng)用最為廣泛。但表達蛋白所需時間長，而且在原核表達時，由于蛋白不能正確的折疊以及糖基化等蛋白質(zhì)的后期加工，往往表達的蛋白沒有活性，真核表達的量一般又不是很高，而且通常需要借助于單抗。所有這些都限制了蛋白表位的研究。近兩年來人們開始利用噬 菌體展示技術(shù)鑒定抗原表位。噬菌體展示使表達的多肽以融合蛋白形式展現(xiàn)在噬菌體表面，保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，并且可用免疫學(xué)方法篩選（親和純化），因此噬菌體展示是一種篩選靶蛋白和多肽的強有力方法。該技術(shù)可用于研究多肽（蛋白質(zhì)）的性質(zhì)、相互識別和作用，并據(jù)此從巨大展示肽庫中選擇特定功中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 緒 論 - 11 - 能的多肽結(jié)構(gòu)。噬菌體展示技術(shù)則是一種高通量的表位作圖方法，即便在沒有單抗的情況下，用多抗可直接鑒定抗原表位。 對于連續(xù)表位，噬菌體展示隨機肽庫提供了簡單價廉的方法；對于不連續(xù)表位，可以從中得到模擬表位，即能特異性地結(jié)合到抗體的結(jié) 合部位 。 在本研究中，我們 以體為 固相篩選分子，分別對 商品化 噬菌體展示 隨機 12肽庫進行篩選，來鑒定病毒蛋白的抗原表位。 究目的和意義 豬 瘟爆發(fā)的一百多年 來 ， 其流行遍及全世界，對養(yǎng)豬業(yè)造成了 巨大 的 經(jīng)濟損失。 科學(xué)家 在豬瘟病毒分子生物學(xué)、 診斷學(xué)、疫苗學(xué) 方面 進行了大量的研究 ， 但迄今為止，對豬瘟病毒抗原 結(jié)構(gòu)還沒有完全清楚。 鑒于此， 本研究對 門 株 白 進行抗原表位的鑒定，以期深入認識其抗原結(jié)構(gòu) ，為 闡明 其 蛋白抗原結(jié)構(gòu)、探討表位生物學(xué)功能 奠定基礎(chǔ)。 同時 在 豬瘟預(yù)防與控制工作中 ， 鑒定的 抗原表位 也可以 為科學(xué)、有效地設(shè)計基因工程疫苗和相應(yīng)的診斷試劑提供科學(xué)依據(jù)和生物材料 。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 利用噬菌體展示隨機肽庫鑒定豬瘟病毒 蛋白 細胞抗原表位 - 12 - 第二章 利用噬菌體展示隨機肽庫鑒定豬瘟病毒 蛋白 個 線性 B 細胞 抗原表位 摘要 以豬瘟病毒 石門 株 膜糖蛋白單克隆抗體 為固相篩選分子，對噬菌體隨機 12肽庫進行生物淘選。 3 輪淘選后，隨機挑取 8 個噬菌體單克隆進行噬菌體 序列測定。測序結(jié)果表明有 5 個噬菌體克隆 展示的一致 序列 基酸序列中 772列有較高的同源性。其余 3 個噬菌體克隆展示的序列與 基酸序列未發(fā)現(xiàn)一致序列 ，可能為模擬表位 。初步推測 克隆抗體 針對 白 772一個線性 B 細胞 表位。為了驗證此表位，人工合成這段表位編碼序列 并進行原核表達， 單克隆抗體 此 融合 表位蛋白 性 檢測 結(jié)果 表明 772 白的一個線性 B 細胞表位 ，此表位的鑒定對豬瘟病毒診斷研究具有一定的參考價值。 關(guān)鍵詞 豬瘟病毒 ； 膜糖蛋白 ； 噬菌體 展示 肽庫 ； 抗原表位 抗原表位（ 又稱抗原決定簇（ ，在蛋白質(zhì)抗原大分子的結(jié)構(gòu)和功能的研究中具有重要的作用。 目前用于 研究抗原表位的方法有多種，如利用表達的蛋白結(jié)合單抗鑒定表位（ et 2001） ，肽探針掃描技術(shù) （ et 2000； 白雪帆等， 2000）， 噬菌體展示技術(shù)及 析等。其中噬菌體展示技術(shù)研究抗原表位是近年來新興的研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有力工具，已經(jīng)利用該技術(shù)成功地鑒定了多種病原微生物的抗原表位，如 et 1993； 杜勇等， 2000） 、 以及 寄生蟲的抗原表位 （ et 2003）等。 豬瘟是由豬瘟病毒（ 起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的毀滅性傳染病。該病死亡率高達 8090%，世界動物衛(wèi)生組織將其列為 須申報 動物 傳染病，我國也將其列為一類傳染病。 于黃病毒科瘟病毒屬，含有一大的開放讀碼框架（ 由其編碼一個約 3 898 個氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白被加工形成 12 種成熟的病毒蛋白 （ et 1999） 。 膜糖蛋白是 要保護性抗原，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生 中和抗體，保護機體免受強毒的攻擊 （ et 1991； et 1995） 。本研究利用噬菌體 展示 技術(shù)，鑒定了豬瘟病毒一個 保守的 線性 B 細胞表位 ，為 研究 豬瘟病毒抗原 結(jié)構(gòu) 以及豬瘟病毒的診斷提供了一定的參考材料。 料與方法 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 利用噬菌體展示隨機肽庫鑒定豬瘟病毒 蛋白 細胞抗原表位 - 13 - 庫、菌株與單克隆抗體 噬菌體 展示 隨機肽庫 于 公司，09； 宿主菌為 E. 基因型為 F15 + ( ( (； 樹脂和 辣根過氧化物酶 標記羊抗鼠 購于 司。 體由本實驗室保存。 限制性內(nèi)切酶 及 接酶購自 司。 門（ 株 白單克隆抗體 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所碩士生侯強提供（侯強 ， 2006）。 抗的純化 參照免疫學(xué)實驗技術(shù)，利用 采用 親和層析 純化腹水中的單克隆抗體 紫外分光度計測定其濃度。 菌體展示 肽庫的生物淘選 參照 菌體展示隨機 12 肽庫生物淘選操作手冊，進行 3 輪淘選。包被用 96 孔微 量反應(yīng) 板，包被量為 100g/150L /孔。三輪淘選所用吐溫 濃度分別用 菌體夾心 純化后的 克隆抗體 照 10g/100L/孔的包被量加入 96 孔 酶標板， 4包被過夜 后 ；加入封閉液 （ 300L/孔 ） ， 4 封閉 2h， 用 濃度為 洗滌6 次；將純化的噬菌體稀釋成 1012 100L 加入到每孔中，每個樣品重復(fù)三個孔，室溫作用 2h； 然后按上述同樣的方法 洗滌 6 次