北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 化學(xué)學(xué)院 2000 級 目錄 第一章 緒論 、 背景知識 、 關(guān)于 1 第二章 試驗內(nèi)容及方法 .、 表達 、 分離與純化 、 度的測定 、丙稀酰胺對 熒光淬滅 .三章 結(jié)果討論 . 致謝 15 參考文獻 16 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 1 第一章 緒論 一 、 背景知識 熱休克蛋白 是在從細菌到哺乳動物中廣泛存在一類熱應(yīng)急蛋白質(zhì)。 當(dāng)有機體暴露于高溫的時候，就會由熱激發(fā)合成此種蛋白，來保護有機體自身。許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白的大小，熱休克蛋白共分為五類，分別為及小分子熱休克蛋白 et 1998)。 小分子熱休克蛋白分子量為 12的分布極為廣泛，從細菌到人的基因組里都有小分子熱休克蛋白的基因。 與其他大分子 的熱休克蛋白不同的是，小分子熱休克蛋白似乎對于細胞的功能并不是必不可少的。但是， 有多種功能，包括賦予細胞以耐熱性以抵抗高溫，作為分子伴侶以防止蛋白聚集，對坑正常的細胞死亡，從而調(diào)節(jié)細胞的生存和死亡的平衡。能避免底物變性的 少量與底物和熱休克蛋白都有關(guān) (et 1998)。 許多小分子熱休克蛋白基因一般并不表達，顯著表達小分子熱休克蛋白一般是細胞受到外部刺激的時候，比如高溫刺激?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，除了熱刺激之外還有許多物理、化學(xué)刺激可以激活小分子熱休克蛋白的表達，例如紫 外線、射線、機械損傷、酸、氧化劑等等?？梢姡》肿訜嵝菘说鞍资堑钟饨绮涣即碳さ闹匾镔|(zhì)。 二、關(guān)于 蛋白的結(jié)構(gòu) 來自 一種甲烷球菌屬古細菌 ） 的熱休克蛋白 對分子量 16500 167 個氨基酸殘基， 是第一個有晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的小熱休克蛋白。它的序列中存在一段長 90 個殘基的 基 46 至 135），此結(jié)構(gòu)域與人的 相似性，與水稻的 相似性 (et 1998)。 圖 1. 單體結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)已經(jīng)解出。它是一個中空的球狀的 24 聚體，分子量約 16500合體的外徑約 120，內(nèi)徑約 65。球的內(nèi)部是空的，并沒有明顯的電荷密度。 它具有非常規(guī)則的結(jié)構(gòu)，對稱性包括 12 個二重軸， 3 個三重軸， 3 個四重軸， 8 個三重軸窗口， 6北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 2 個四重軸窗口，邊長分別為 30 和 17 。 聚合體中的每一個折疊單位是由組成兩個 片的結(jié)構(gòu)、兩個短的 310中一個結(jié)構(gòu)來自相鄰的折疊單位 。蛋白 氨基酸殘基高度無序的。從第 33 個殘基開始，是蛋白的 在蛋白的 2 個殘基的短小結(jié)構(gòu) (. et 2000)。每個蛋白的折疊單位大小為 25 28 75，最長的方向與折疊片的長軸平行。 24聚體中的每一個單位都與其他單位有很強的聯(lián)系。對應(yīng)于復(fù)合體中二重、三重、四重對稱軸，一共存在三種折疊單位間的相互作用。最強的相互作用存在于二重軸周圍：一個單位的 2單位間的折疊片，同時強烈的疏水相互作用和靜電力也使該結(jié)構(gòu)得到北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 3 穩(wěn)定。在四重軸周圍，由于氫鍵、靜電力和疏水相互作用，四個分子互相接觸。而在三重軸周圍，單位間的作用力最弱，只有離子間作用力是三個單位組成的三角形頂角處穩(wěn)定( et 1998)。 2 細胞和蛋白的熱保護 實驗表明，在表達了 大腸桿菌提取物中， 75%的蛋白在 80 高溫下因為被保護而沒有聚集沉淀，而提純得到的 大腸桿菌提取物有相同的作用，說明對大腸桿菌的熱保護主要是由 成的。另外，對于變性溫度為 80 的單鏈應(yīng)樂果甜蛋白（ 樣可以阻止其在變性溫度下發(fā)生聚集 (et 1998)。 一種可能機制是， 可能在體內(nèi)，在這個過程中，蛋白或?qū)毎匾?球狀體的空腔或表面。另一種可能性是， 聚體與他的功能和活性無關(guān)，而是一種蛋白的儲存狀態(tài)：當(dāng)?shù)鞍资艿酵饨鐗毫Φ臅r候，多聚體就會迅速分解。 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 4 第二章 實驗內(nèi)容及方法 一、 表達 1. 原理 蛋白質(zhì)表達是為獲得大量的目標(biāo)蛋白質(zhì)而進行的有目的性的蛋白質(zhì)合成。常用方法是將編碼所需產(chǎn)物的基因插入質(zhì)?；蚱渌d體，然后將該載體導(dǎo)入活細胞，進行大量合成。 大多數(shù)克隆載體都以大腸桿菌作為宿主。因為大腸桿菌具有兩個特征：操作簡易和能在廉價的培養(yǎng)基上迅速的生長。 在大腸桿菌里表達外源基因一般是始于將基因插入表達載體（一般是質(zhì)粒）。載體應(yīng)具有的幾種元件有： 選擇標(biāo)志的編碼序列，它可供篩選以確定載體是否進入了細胞； 可控轉(zhuǎn)錄啟 動子，經(jīng)誘導(dǎo)后從克隆化基因產(chǎn)生大量的 轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，如一個合適的核糖體結(jié)合位點和起始密碼子 一個多限制酶位點接頭，便于外源基因以正確方向插入載體中。 含有待表達基因的載體構(gòu)建好后，經(jīng)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌某一合適菌株中。 編碼 基因（ 經(jīng)從古細菌 得到克隆，利用 術(shù)擴增，并插入帶有氨芐（ 抗性的載體 粒（ 。將此載體轉(zhuǎn)化進入宿主 宿主體內(nèi)含有質(zhì)粒 質(zhì)粒含有可以編碼 有密碼子（精氨酸密碼子 異亮氨酸密碼子并帶有壯觀霉素 (性。我們用含 和 的 養(yǎng)基來篩選出可以表達 菌株。得到的菌株在適當(dāng)條件下大量培養(yǎng)，即得到表達出所需蛋白的細胞。 2 儀器和試劑 儀器 a) 蒸汽消毒器：山東新華醫(yī)療儀器廠； b) 式 圓 形 壓 力 蒸 汽 滅 菌 器 ： 張 家 港 市 華 菱 醫(yī) 療 設(shè) 備 制造有限公司； c) 級數(shù)顯恒溫器：重慶四達實驗儀器廠； d) 518 臺式恒溫培養(yǎng)搖床： e) C 22 分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司； . f) C 5C 凍離心機： 其他常規(guī)儀器：電子分析天平；漩渦混合器；一次性培養(yǎng)皿；燒杯；錐形瓶；接種環(huán)；酒精燈；微量 移液器；離心管（ 50050一次性小離心管（ 滴管；玻璃棒。 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 5 試劑 a) 體培養(yǎng)基： 每 1001g 1g 加水至 100用 7 b) 體培養(yǎng)基： 每 100體培養(yǎng)基中加入 脂 (c) 50mg/ 10500mg 10ml d) 50mg/ 10500mg 10ml e) 1M 5f) 液 每 100 100 注：配制 無菌環(huán)境中將配好的溶液過一次性濾器裝入無菌細口瓶，于 4 冰箱中保存。 3 實驗步驟 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 a) 配制 000 b) 待培養(yǎng)基冷卻而固體培養(yǎng)基未凝固時加入 50mg/和 各 50 l，搖勻，倒平板。向一瓶液體培養(yǎng)基中加入 和 各 50 l；另一瓶液體培養(yǎng)基中加入 50 l。 c) 在含 的液體培養(yǎng)基中加入 10 l 恒溫搖床上 37 ，150養(yǎng) 6 小時，至 右。 d) 取 1液，離心，棄上清液。 e) 加入 100 l 懸菌體沉淀，加入 3 l 粒，振蕩均勻。冰浴北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 6 30 分鐘左右，保持細菌處于感受態(tài)。 f) 于 42 恒溫水浴下熱休克 45 秒 （時間要精確） 。 g) 冰浴 1 2 分鐘。 h) 取 50 l 菌種于含 和 的固體培養(yǎng)基中，涂布均勻。在恒溫搖床上于37 ， 150培養(yǎng) 16 小 時左右。出現(xiàn)分布均勻的單菌落證明轉(zhuǎn)化成功。 菌種保藏 a) 單菌落接入含 和 的培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫搖床上 37 ， 150培養(yǎng) 8小時左右，至 。 b) 取 1液于 離心管中，加入 80無菌甘油至終濃度 8%于 20冰箱中保存。 大量培養(yǎng)： 取菌種 200 l 于 1L 已滅菌的 養(yǎng)液 (含 50 g/ 30 g/中，37 ， 150搖床培養(yǎng) 8 小時左右，至菌 體 600為 誘導(dǎo)： 加入 00 l（終濃度為 繼續(xù)在 37150培養(yǎng) 2 小時左右。誘導(dǎo)過程中，菌不再生長。 注：以上所有操作均在無菌條件下進行。 收獲菌體： 將菌液于 4 ， 5000g 下離心 10去上清液，用 液重懸菌體，再于 4 ， 5000g 下離心 10淀的菌體于 20 下保存。 二、 分離與純化： 1. 原理： 為了提高蛋白純度，我們借鑒文獻的純化方法（ im et 1998），摸索出了一套純化方法。使用分離純化生物大分子最高效液相色譜分離技術(shù)，連續(xù)使用三種色譜法：離子交換色譜，疏水作用色譜，凝膠過濾色譜。 子交換色譜 氨基酸是一種兼性離子，在生理條件下，羧基帶負電，氨基帶正電。由于不同的氨基酸側(cè)鏈不同，使其具有不同的酸堿性，從而在生理條件下又帶上了額外的電荷。自然，有大量氨基酸組合而成的蛋白質(zhì)，也有可能是帶電體。 離子交換色譜，是利用被分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同而達到 分離效果的一類液相色譜。色譜柱的固定相上帶有可解離的陽（陰）離子，當(dāng)帶有同種電荷的物質(zhì)流入柱內(nèi)，會將該種離子置換出來，從而停留在柱內(nèi)。逐漸加大洗脫液的離子強度，或者改變體系北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 7 的 ，都可能使新的離子取代被提純物質(zhì)的位置，從而是物質(zhì)被洗脫下來。電荷性質(zhì)不同的物質(zhì)，與固定相間的作用力不同，洗脫時間不同，從而達到分離提純的效果。 水層析 疏水層析是基于溶質(zhì)，極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應(yīng)建立的一種色譜模式。它利用分離的物質(zhì)的疏水性質(zhì)不同，而達到分離效果的。與疏水作用相對的是靜電作用力。在很高離子濃度 時，被分離物質(zhì)因為與柱內(nèi)固定相間的疏水相互作用而被停留在柱內(nèi)。根據(jù)相似相容原理，降低洗脫液的離子強度，增加了流動相與被分離物質(zhì)間的疏水作用，加大了物質(zhì)離開固定相的趨勢，直至被洗脫下來。 膠過濾色譜 凝膠過濾色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液以及小分子量蛋白質(zhì)通過，而大分子蛋白質(zhì)以及一些蛋白質(zhì)復(fù)合物被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質(zhì)在填料顆粒間隙中流動，比小分子量蛋白更早的被洗脫下來。最大的蛋白質(zhì)分子最早流出柱子，因為它們在到達柱底前經(jīng)過的體積最??；中等 的蛋白質(zhì)可以進入填料分子中較大的孔內(nèi)，有最大的通過體積，故最后到達柱底。 2. 儀器和試劑 儀器 a) 速（蛋白，多肽，核酸）液相層析儀 ： b) 陰離子交換柱 5 柱： c) 疏水柱 F d) 凝膠過濾柱為 200 e) C 5C 凍離心機： f) 聲細胞粉碎機：上海新芝生物技術(shù)研究所； g) 環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司； h) 米一次性無菌濾器。 其他常規(guī)儀器： 電子分析天平；電磁攪拌器；燒杯；微量移液器； 50心管；一次性使用無菌注射器滴管；玻璃棒。 試劑 a) 50 10095 至 ，室溫保存； b) 100劇毒 )： 每 15261京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 8 異丙醇： 15解后分裝 750 l/管， 20存； c) 1M 儲液）： 每 10010 20存； d) 200沖液（ 5 倍儲液） 1L 00 00 e) ： 40沖液 將儲液 d）稀釋 5 倍； m 濾膜過濾； f) ： 每 1L 儲液 d）： 200 1M）； 配至總體積為 1L； m 濾膜過濾； g) ： 每 1L 儲液 d）： 200 ( 配至總體積 1L； m 濾膜過濾； h) ： 每 1L 儲液 d） 200 配至總體積 1L； m 濾膜過濾； i) 蔗糖；固體，分析純； j) (體，分析純； 3實驗步驟 破壁（機械 法）： 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 9 1） 配制破壁用緩沖液： 每 3g 菌 5015 100150 l； 蔗糖： 3g； 1M 60 l； 2）破壁： 將收獲的菌體用破壁緩沖液重懸，冰水浴中，以 3 秒脈沖（ 3 秒開， 3 秒關(guān)）超聲破壁 120 次，超聲功率為 400W，至混合液呈半透明。 注：破壁后的溶液要馬上進行下一步提純，因為破壁后的溶液里含有蛋白酶會降解蛋白。 3）離心： 將破壁后的液體于 4 ， 24000g 下離心 20清液 膜過濾。 譜法分離 （均以 1L 培養(yǎng)液所得約 3g 菌體為例）： 1） 離子交換色譜： a） 將蛋白樣品用 m 濾膜過濾； b） 以 為 A 泵溶液， 為 B 泵溶液，采用 5 柱，取蛋白溶液每次 5行分離。用 A 泵上樣，用 沖平。洗脫為 30%，在 30% 收集。收集樣品后加入 ( 2） 疏水層析 疏水柱 F，依次以 1M ， 充分 平衡；上一步樣品 m 濾膜過濾后用 B 泵上樣，在用 沖平。洗脫為 100%，在 60% 收集，洗脫峰約為 47%C。收集溶液超濾濃縮小于 2 3） 凝膠過濾色譜 凝膠過濾柱為 200。用 2ml 次上樣 2集方式為峰收集，50停止收集。一次收集 后收集的樣品應(yīng)舍棄第一管。 保存 用 5 超濾管濃縮， 1： 1 加入已經(jīng)滅菌的 80%甘油， 存。 三、 度的測定 1. 原理 蛋白質(zhì)通常在波長 280，有最大吸收峰，因此可以利用紫外可見分光光度計，測出一定濃度蛋白溶液在該波長下的吸收。再根據(jù)蛋白濃度和吸收強度成正比的定理，利用該蛋白的吸光系數(shù)，求出溶液中蛋白的濃度。 據(jù)文獻報道 280的吸光系數(shù)為 mg/1用光程 1可利用公式計算蛋白濃度。 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 10 蛋白濃度 =280紫外吸收值 /（吸光系數(shù) 光程長） =280紫外吸收值 / . 儀器和試劑 儀器 a) 5 b) 微量光吸收池（光程 1品量 50 l）： 試劑 視情況而定，應(yīng)與蛋白溶液除去蛋白后的組成完全相同 3. 實驗步驟： a) 將兩吸收池洗凈吹干，分別用作樣品池和參比池，在 280長下自動調(diào)零； b) 估計蛋白溶液濃度，取少量將其用 吸光度約 c) 取蛋白溶液 100 l 于樣品池， 00 l 于參比池，測定蛋白溶液在 280 d) 計算蛋白濃度。 四、丙稀酰胺對 熒光淬滅 1 原理 熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象稱為熒光淬滅。能引起熒光強度降低的物質(zhì)稱為淬滅劑。一種研究蛋白構(gòu)象非常有用的試驗方法是將淬滅劑加入溶劑中。有三種常用的 淬滅劑：丙稀酰胺，s+。其中丙稀酰胺是中性分子，而后兩種分別帶負電和正電。淬滅劑的濃度變化從 于蛋白來講，丙稀酰胺被廣泛的應(yīng)用到確定 基的暴露度。此 試驗是在每一溫度下用丙稀酰胺進行滴定，記錄熒光信號以獲得淬滅數(shù)據(jù)。 這一過程可以描述如下： M(+ Q M(+ Q (1) 無淬滅劑時， 00 kk (2) 其中0有淬滅劑存在時， Q k ) 所以， 000 (4) 因為無淬滅時單重態(tài)壽命為 )/(10s 所以， (4)式可以簡化為： 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 11 10 （ 5） 以上就是著名的 式。 令 基在溶劑中的暴露程度，高的的 2 儀器和試劑 ： a) 色譜純丙稀酰胺溶液（ 5M）； b) 純化后的小熱休克蛋白溶液； c) 1 3 步驟與方法 ： a) 白溶液樣品，使其濃度大約為紫外吸收在 X 。 b) 記錄蛋白和空白的熒光光 譜：熒光的激發(fā)波長為 295錄發(fā)射光譜從310 450 c) 分別加入丙稀酰胺溶液 5， 5， 10， 20， 20， 20， 20， 20， 40， 40 l 使最后丙稀酰胺的濃度大約在 d) 按照上述步驟測量空白的熒光光譜。 e) 重復(fù)上述步驟，控制溫度從 25到 95，每隔 5測量一次。 4. 數(shù)據(jù)處理 ： 將 b）中測得的熒光強度減掉相應(yīng)的 c）中的空白值，初始熒光強度為 熒光淬滅劑濃度 Q時熒光強度為 F。 對 Q作圖，數(shù)據(jù)用 性擬合，擬合直線強制過（ 0,1）點，獲得不同溫度下獲得的 a) 各個溫度下 式的線性擬合： 25 30 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 12 35 40 45 50 55 60 65 70 80 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 13 85 90 95 T/ 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 0 5 0 5 釋：以上圖中縱坐標(biāo) ()橫坐標(biāo)為丙稀酰胺濃度 Qb) 將 作圖，得到如下結(jié)果： 第三章 結(jié)果討論 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 14 從以上圖形可以看出，度變化有較為明顯的上升趨勢，由于基在溶劑中的暴露程度，所以基隨溫度的上升，其在溶劑中暴露的越多。 致謝 感謝來魯華老師和曹敖能老師在一年多的時間里給予我的指導(dǎo)和關(guān)心。從他們身上，我不僅學(xué)到了生物化學(xué)領(lǐng)域的知識，更重要的是作為一個科學(xué)工作者的研究方法和治學(xué)態(tài)度。這些注定將讓我受用終身。 感謝蔡利峰博士和王錚研究生給予我的幫助，是他們一開始將我領(lǐng)進這個我相對陌生的領(lǐng)域 。 感謝范可強、魏平兩位師兄平時對我學(xué)習(xí)上的幫助和支持。 感謝徐菲、楊銘兩位同學(xué)平時對我生活上的照顧與幫助。 最后，感謝我的家人在我實驗和學(xué)習(xí)期間給予我的支持和理解！ 謝謝大家！ 北京大學(xué)校長基金論文集（ 2003 年） 利用 丙稀酰胺研究小分子熱休克蛋白的構(gòu)象 15 參考文獻： 分子克隆試驗指南（第二版） 美 科學(xué)出版社（ 1996） 生物化學(xué)（第三版） 王靜巖、朱圣庚、徐長法主編 高等教育出版社（ 2002） 儀器分析教程 北京大學(xué)化學(xué)系 儀器分析教學(xué)組 北京大學(xué)出版社（ 1997） 變性條件及