第三章 食品的色譜法分析 第一節(jié) 色譜法概論 第二節(jié) 氣相色譜法 第三節(jié) 液相色譜法 第四節(jié) 色譜的定性和定量分析方法 第一節(jié) 色譜法概論 一、色譜法簡(jiǎn)介 二、色譜法分類 三、色譜圖及基本參數(shù) 四、分配系數(shù)與色譜分離 一、色譜法簡(jiǎn)介 色譜法 ( 是一種用以分離、分析多組分混合物質(zhì)的極有效的物理或物理化學(xué)方法。 以前學(xué)過(guò)的分離方法有： 1、沉淀法 2、蒸餾法 3、萃取法 色譜法的由來(lái)：色譜法是 1906年俄國(guó)植物學(xué)家 立的。 將 油醚洗脫，用于分離植物葉子中的葉綠素。植物葉子的提取液在通過(guò)柱子后，在柱床上出現(xiàn)了 不同顏色的譜帶 ，因此他將這種方法命名為色譜法。這就是最早使用的 柱色譜法 葉片的石油醚萃取液 石油醚 ( 流動(dòng)相 ) 葉綠素 色譜柱 葉綠素 葉黃素 碳酸鈣顆粒 （固定相） 胡蘿卜素 洗過(guò)程稱為： 洗脫 方法稱為： 色譜法 1906年， 現(xiàn)色譜分離現(xiàn)象。 基本原理 ：利用樣品中各種組分在固定相與流動(dòng)相中受到的作用力不同，而將待分析樣品中的各組分進(jìn)行分離，然后順序檢測(cè)出各組分含量。 在色譜分離中靜止不動(dòng)、對(duì)樣品產(chǎn)生保留的一相，稱為固定相 ； 色譜過(guò)程中攜帶待測(cè)組分向前移動(dòng)的物質(zhì)稱為 流動(dòng)相 。 裝有固定相的管子稱為 色譜柱 。 色譜過(guò)程： 當(dāng)流動(dòng)相中攜帶的混合物經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用。由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相發(fā)生作用力的大小、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短，從而按先后次序從固定相中流出 （差速遷移） 。流出的物質(zhì)進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行分析。 色譜分離特點(diǎn)： 1、不同組分通過(guò)色譜柱時(shí)的遷移速度不等 提供了分離的可能性 2、各組分沿柱子擴(kuò)散分布 峰寬 色譜法的應(yīng)用： 1) 色譜分析廣泛應(yīng)用于極為復(fù)雜的混合物成分分析； 2) 液相色譜法，在糖類、氨基酸、農(nóng)藥、染料、有機(jī)金屬化合物等方面得到了廣泛的應(yīng)用。 3) 色譜分離是一種非常有效的提純物質(zhì)的技術(shù)，常用于制備分離，得到高純樣品。 4) 色譜 質(zhì)譜聯(lián)用儀已成為研究分子結(jié)構(gòu)的重要手段。 二、色譜法分類 1、按兩相狀態(tài)分類 氣相色譜（ 氣固色譜：流動(dòng)相為 氣體 ，固定相為 固體吸附劑 氣液色譜：流動(dòng)相為氣體，固定相為 液體 液相色譜（ 液固色譜：流動(dòng)相為 液體 ，固定相為 固體吸附劑 液液色譜：流動(dòng)相為液體，固定相為 液體 超臨界流體色譜法 柱色譜： 填充色譜 毛細(xì)管色譜 平板色譜 ： 紙色譜 薄層色譜 2、按固定相存在形式分類 3、按分離機(jī)制分類 1) 吸附色譜： 用固體吸附劑作固定相，利用不同組織在固定相和流動(dòng)相之間的物理吸附性能的差異來(lái)分離。 2) 分配色譜： 用液體作固定相，利用組分在固定相中分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離。 離子交換色譜、凝膠滲透色譜法、排阻色譜、毛細(xì)管電泳法等。 色譜法簡(jiǎn)單分類 毛細(xì)管電泳法 三、色譜圖及基本參數(shù) （一）色譜圖的展開 在柱色譜分離方法中最常用的是洗脫技術(shù)(在該法中，首先將樣品溶解在流動(dòng)相中，然后將其加入柱頂，最后用流動(dòng)相洗脫，直到各個(gè)組分被分離，并在柱后檢測(cè)。 圖 1， B， A+B+C C C B C B A C B A A B C 圖 1 色譜洗脫原理圖 流動(dòng)相 當(dāng)樣品被加入柱上，樣品就在兩相之間進(jìn)行分配，當(dāng)流動(dòng)相連續(xù)地加入柱頂，組分就在柱內(nèi)新的流動(dòng)相和固定相之間分配，與固定相的作用力強(qiáng)的組分比作用力弱的組分保留的時(shí)間長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的洗脫，它們即可被分離，并可在柱后以不A+B+C A B C C B A C B A C C B 圖 2 色譜洗脫過(guò)程與色譜圖 t， B C 信號(hào) （二）色譜圖的基本參數(shù) 1、色譜流出曲線 由柱流出物通過(guò)檢測(cè)器輸出的電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的大小作圖所得的曲線。 2、基線 無(wú)試樣通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)到的信號(hào)即為基線。反映儀器噪音的情況。穩(wěn)定的基線是一條直線。 基線漂移：指基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。 基線噪聲：指各種噪聲所引起的基線起伏（波動(dòng)）。 基線：流動(dòng)相基質(zhì)本身在檢測(cè)器中的吸收值。 噪聲：是指在工作中儀器本身所產(chǎn)生的電信號(hào)的波動(dòng)在工作站中的顯示 ; 漂移：一般是指在一定的時(shí)間段里基線向某一個(gè)方向趨于平衡的范圍 ; 3、色譜峰 當(dāng)流動(dòng)相中含有組分時(shí)，通過(guò)檢測(cè)器所得到的信號(hào)。 峰高 (H): 峰最高點(diǎn)與基線之間的垂直距離。 峰寬 ( 峰兩側(cè)曲線在拐點(diǎn)作切線而在基線上相交的線段。 半峰寬 (): 峰高的一半處峰的寬度。 色譜峰面積：色譜曲線與基線間所包圍的面積。 1）保留時(shí)間（ 從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所需時(shí)間。 2）死時(shí)間（ 不被固定相溶解或吸附的組分的保留時(shí)間。即分配系數(shù)為零的組分。 3）調(diào)整保留時(shí)間 (：指扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。 、保留值 際上是 組分在固定相中所滯留的時(shí)間 。 4）保留體積（ 從進(jìn)樣開始到組分出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所消耗的流動(dòng)相體積。 5）死體積（ 不與固定相作用的組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度最大值所需要的載氣體積。即死時(shí)間內(nèi)流經(jīng)色譜柱的流動(dòng)相體積。 6）調(diào)整保留體積 保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時(shí)所消耗流動(dòng)相的體積。 從色譜流出曲線中，可得許多重要信息： 1）根據(jù)色譜峰個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù)； 2）根據(jù)色譜峰的保留值，可以進(jìn)行定性分析； 3）根據(jù)色譜峰的面積或峰高，可進(jìn)行定量分析； 4）色譜峰的保留值及其寬度是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù)； 5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相（或流動(dòng)相）選擇是否合適的依據(jù)。 色譜學(xué)研究的重要問(wèn)題 色譜分析的目的是將樣品中各組分彼此分離。組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)，并且兩個(gè)峰必須足夠窄。兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。 峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過(guò)程的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。 要從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。 四、分配系數(shù)與色譜分離 1、分配系數(shù) K 指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即 K=溶質(zhì)在固定相中的濃度 /溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度=m 分配系數(shù)是由組分和固定相、流動(dòng)相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，它是 每一個(gè)溶質(zhì)的特征值 ，與 固定相、流動(dòng)相和溫度 有關(guān)。 2、分配比 k 分配比又稱 容量因子 ，指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即 k=組分在固定相中的質(zhì)量 /組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量 明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱容量因子。 動(dòng)相的熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還 與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān) 因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。 若要使 A、 須滿足以下三點(diǎn)： 第一，兩組分的分配系數(shù)必須有差異； 第二，峰擴(kuò)寬的速率應(yīng)小于峰分離的速度； 第三，在保證快速分離的前提下，提供足夠長(zhǎng)的色譜柱。 第一、二點(diǎn)是完全分離的必要條件。 k=ms/s/m=K m 式中 cs,似等于死體積。 各種不同類型的色譜中有不同的含義。 分配比越大，則停留在固定相中的分子數(shù)越多，組分移動(dòng)的越慢。分配比是衡量色譜柱對(duì)被分離組分保留能力的重要參數(shù)。 分配比 k 值可直接