密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 轉(zhuǎn) 因小麥后代的鑒定和遺傳分析 cl cl 摘 要 核糖體失活蛋白（ 高等植物中廣泛存在的一種毒蛋白。它具有損傷真核細(xì)胞核糖體，從而抑制蛋白質(zhì)合成的功能。由于植物產(chǎn)生的這類(lèi)毒蛋白對(duì)其他生物有毒害，因此認(rèn)為 它們的功能是對(duì)自身的保護(hù)作用。 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，名稱(chēng)來(lái)源于 B 細(xì)胞白血病 /淋巴瘤 它們通過(guò)調(diào)節(jié)跨膜的電化學(xué)梯度而對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，目前這種基因在動(dòng)物上研究的比較多，在植物上報(bào)道的很少，它控制生物細(xì)胞在受到真菌侵染后迅速產(chǎn)生過(guò)敏性壞死，抑制真菌的的繁殖和擴(kuò)展。把這兩種基因?qū)胄←?，可獲得抗病小麥新種質(zhì)，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要意義。 本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植株，然后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因進(jìn)行連續(xù)幾代的跟蹤檢測(cè)，選擇 出了遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因株系。并對(duì)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系做了抗病性鑒定。 在對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，小麥幼胚愈傷組織在受到農(nóng)桿菌侵染后，很難再進(jìn)一步分化，小麥植株再生率很低。所以我們認(rèn)為幼胚的難再分化和小麥再生率低是限制轉(zhuǎn)基因成功的瓶頸。 利用分子檢測(cè)技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株從 3代做了跟蹤檢測(cè)，最終獲得了轉(zhuǎn) 定遺傳株系 3 個(gè)，轉(zhuǎn) 定遺傳株系 2 個(gè)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因在 穩(wěn)定遺傳的 據(jù)分子檢測(cè)檢測(cè)，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了遺傳分析，發(fā) 現(xiàn)在 功能基因 分離符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律；功能基因 穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行嚴(yán)格的抗病性鑒定，鑒定結(jié)果顯示與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)白粉病和全蝕病具有一定的抗性 部分 植株的株高、分蘗、主穗長(zhǎng)、主穗小穗數(shù)、主穗粒數(shù)、穗型等方面進(jìn)行了調(diào)查。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株除了在株高方面有明顯變異外，其它方面均與對(duì)照表現(xiàn)一致。 關(guān)鍵詞： 傳分析；白粉??；全蝕病 ip( a of in to of of of to by is a of It by of is on on cl is to to be by ip cl,be of in In we by of of is on By of we at of ip s cl 1 be to in 1 by 2 by of to of in of 目錄 第一章 緒論 . 1 麥抗病育種 . 1 物抗病的機(jī)制 . 1 麥抗性育種研究的回顧與進(jìn)展 . 2 麥常見(jiàn)的病害 . 3 用于小 麥抗真菌基因的研究 . 5 麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展 . 7 麥常用的轉(zhuǎn)化方法 . 8 響轉(zhuǎn)化效率的因素及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選 . 10 麥轉(zhuǎn)基因植株的鑒定和后代的遺傳行為 . 11 研究的意義、主要內(nèi)容及技術(shù)路線(xiàn) . 12 題意義 . 12 究?jī)?nèi)容 . 12 術(shù)路線(xiàn) . 13 第二章 材料與方法 . 14 驗(yàn)材料 . 14 源基因及其質(zhì)粒載體 . 14 體小麥品種和農(nóng)桿菌菌系 . 14 劑及耗材 . 14 器設(shè)備 . 15 源基因 定的引物 . 15 究方法 . 15 桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥 . 15 用分子生物學(xué)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè) . 17 基因植株的抗病性鑒定 . 23 第三章 結(jié)果與分析 . 24 轉(zhuǎn)化結(jié)果和再生植株的獲得 . 24 轉(zhuǎn) 因小麥 2代的分子檢測(cè)與純合株系的 篩選 . 25 1代轉(zhuǎn)基因植株的 測(cè) . 25 1代轉(zhuǎn)基因植株的 測(cè) . 26 2代轉(zhuǎn)基因植株 的 測(cè)和穩(wěn)定遺傳株系的篩選 . 27 3代轉(zhuǎn)基因植株的 測(cè) . 29 基因植株的 測(cè)結(jié)果 . 29 轉(zhuǎn) 因小麥 2代的分子檢測(cè)與穩(wěn)定株系的篩選 . 30 測(cè) . 30 測(cè) . 31 測(cè) . 31 轉(zhuǎn)基因植株的 測(cè) . 31 轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定 . 32 轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定 . 32 轉(zhuǎn)基因植株的全蝕病抗性鑒定 . 34 轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀考察 . 36 第四章 結(jié)論和討論 . 38 論 . 38 因和 因?qū)胄←溒贩N獲得了抗病轉(zhuǎn)基因植株 . 38 過(guò)連續(xù)幾代的分子檢測(cè)獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系 . 38 過(guò)分子檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株后代的遺傳分離分析和外源基因拷貝數(shù)分析 . 38 穩(wěn)定遺傳株系的農(nóng)藝性狀考察和抗病性鑒定 . 38 論 . 38 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥存在的問(wèn)題 . 38 轉(zhuǎn)基因植株后代中的遺傳分離 . 39 外源基因的整合對(duì)轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀的影響 . 39 轉(zhuǎn)基因?qū)χ仓暧缘挠绊?. 39 參考文獻(xiàn) . 40 致 謝 . 44 作者簡(jiǎn)歷 . 45 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 1 第一章 緒論 植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動(dòng)物、植物或微生物中分離到的目的基因，通過(guò)各種方法轉(zhuǎn)移到植物的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的遺傳性狀，如抗蟲(chóng)、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)方興 未艾。自從 1983 年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物后，至今為止據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已有 35 個(gè)科 120 多種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。 1986 年首批轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)，至今國(guó)際上已有 30 個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)數(shù)千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)，涉及的植物種類(lèi)有 40 多種。 種植的轉(zhuǎn)基因植物種類(lèi)主要有大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯、西葫蘆和木瓜等。全球范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種植面積近年來(lái)逐年大幅度增長(zhǎng)， 1996 年為 170 萬(wàn)公頃，到 2001 年盡管受到國(guó)際關(guān)于 議的影響，轉(zhuǎn)基因植物的種植面積仍增長(zhǎng)到 5260 萬(wàn)公頃。到 2003 年全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植 面積達(dá)到了 6770 萬(wàn)公頃，比 2002 年增加了 美國(guó) 1/4 的耕地面積種植的是轉(zhuǎn)基因作物，種植面積占全球的 其中轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆占美國(guó)大豆面積的 55，轉(zhuǎn)基因玉米占玉米面積的 30。 我國(guó)植物基因工程研究始于 20 世紀(jì) 80 年代初期，并于 20 世紀(jì) 80 年代中期將生物技術(shù)列入國(guó)家“ 863”高科技發(fā)展計(jì)劃。據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)會(huì) 1999 年統(tǒng)計(jì)我國(guó)正在研究開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物種類(lèi)達(dá) 47 種，涉及各類(lèi)基因?qū)⒔?110 個(gè)，其中與病蟲(chóng)害防治有關(guān)的約 62 種。我國(guó)是世界上第一個(gè)商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家，開(kāi)創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因作 物商品化的先河。從 1997 年 3 月 2002年 2 月，我國(guó)農(nóng)業(yè)生物安全委員會(huì)共受理 693 項(xiàng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全評(píng)價(jià)申請(qǐng)，批準(zhǔn) 501 項(xiàng)中間實(shí)驗(yàn)或環(huán)境釋放。目前我國(guó)有 6 種轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)入商品化生產(chǎn)，分別為華中農(nóng)大的轉(zhuǎn)基因耐儲(chǔ)藏番茄，北京大學(xué)的轉(zhuǎn)查耳酮合成酶（ 因矮牽牛，抗病毒甜椒，中國(guó)農(nóng)科院的抗蟲(chóng)棉，美國(guó)孟山都公司的保鈴棉。其中 1996 年 2002 年抗蟲(chóng)棉的累計(jì)種植面積達(dá)到了 480 萬(wàn)公頃，國(guó)產(chǎn)抗蟲(chóng)棉的市場(chǎng)份額由 1998 年的 10%上升到 2002 年的 棉農(nóng)增加收益 20 多億圓。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)業(yè)化，尤其是轉(zhuǎn) 基因農(nóng)作物的產(chǎn)業(yè)化，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 麥抗病育種 物抗病的機(jī)制 植物抗病性及其機(jī)制的研究一直是植物病理學(xué)和抗病育種中的熱點(diǎn)問(wèn)題。植物受到病原物侵染后，最常見(jiàn)的表現(xiàn)方式是通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，進(jìn)而激發(fā)一系列防衛(wèi)反應(yīng)，產(chǎn)生組織或全株抗性。植物普遍存在的抗病機(jī)制有兩種，即過(guò)敏性反應(yīng)（ 系統(tǒng)獲得性抗性（ 這兩種抗病機(jī)制是直接作用于病原物，在不同的植物與病原 物互作系統(tǒng)中表達(dá)內(nèi)容是一致的。植物將 兩種抗病機(jī)制的內(nèi)容程序化并儲(chǔ)存在植物抗病體系中，當(dāng)接受來(lái)自病原物方面的信號(hào)，程序開(kāi)啟，內(nèi)容表達(dá)。 過(guò)敏性壞死是指在植物與病原物的非親和互作系統(tǒng)中，受病原物侵染的植物快速死亡而形中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 2 成枯斑反應(yīng)。不同的植物與病原物互作系統(tǒng)中發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)時(shí)，在細(xì)胞、生化及分子水平上的變化基本相同。首先，病原物侵染點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)入程序死亡（ 程序死亡是細(xì)胞的一種保護(hù)性自殺行為，是動(dòng)物、植物和微生物在個(gè)體發(fā)育、群體進(jìn)化或抗逆反應(yīng)中的一種普遍機(jī)制。動(dòng) 物細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞骨架離散，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞器功能喪失，核解。與動(dòng)物細(xì)胞一樣，植物細(xì)胞死亡時(shí)，可能也存在著細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變和遺傳物質(zhì)的降解。其次，病原物侵染點(diǎn)和周?chē)?xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞壁中結(jié)構(gòu)蛋白氧化交聯(lián)，木質(zhì)素沉積，即在侵染點(diǎn)和周?chē)募?xì)胞中防衛(wèi)反應(yīng)的基因依次得到系統(tǒng)表達(dá)。 交分析表明：首先表達(dá)的是植保素合成酶基因，其次是病程相關(guān)（ 白基因，其次是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白和木質(zhì)素合成酶基因。這些發(fā)生在細(xì)胞、生化及分子水平 的復(fù)雜變化，共同構(gòu)成了植物的過(guò)敏反應(yīng)，它的直接結(jié)果是病原物被限制在侵染點(diǎn)的壞死組織中，不能向周?chē)鷶U(kuò)展獲得充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以致死亡。 植物過(guò)敏反應(yīng)受植物中一類(lèi)被稱(chēng)為 基因調(diào)節(jié)，且這種調(diào)節(jié)是負(fù)向的。 突變體能自發(fā)形成枯斑，從細(xì)胞、生化到分子水平都與非親和病原物激發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)相同，說(shuō)明 因是控制細(xì)胞程序化死亡的開(kāi)關(guān)，參與形成過(guò)敏反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)。 系統(tǒng)性獲得抗性是指植物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)之后獲得的對(duì)病原物的廣譜抗性。在時(shí)間上落后于過(guò)敏性反應(yīng)，性質(zhì)類(lèi)似動(dòng)物免疫的一種機(jī)制。在用非親和性病原物接種后，數(shù)天內(nèi)形成 續(xù)數(shù)周到數(shù)月不等。 一種可以用化學(xué)或遺傳方法在生產(chǎn)上加以利用的抗病機(jī)制。 植物防衛(wèi)反應(yīng)基因被系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果，特別是 白類(lèi)基因。 白至少有類(lèi)。其中有降解病原物細(xì)胞壁的酶類(lèi)，如幾丁質(zhì)酶， 抑制病原物生長(zhǎng)的酶類(lèi)，如過(guò)氧化物酶，超氧化物歧化酶，脂氧化酶等；有 破壞取食性昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)的蛋白酶抑制劑。大多數(shù) 白的功能未知，形成 機(jī)制還不清楚。植物形成 ，通常有恒定的 白基因被高水平系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，這類(lèi)基因特稱(chēng)為 因。所以 因是否系統(tǒng)表達(dá)，成為判斷植物是否發(fā)生 分子標(biāo)準(zhǔn)。由于植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的系統(tǒng)表達(dá)，使得植物對(duì)該種病原物再次侵染，甚至對(duì)不相關(guān)的其它病原物的侵染，產(chǎn)生了廣譜的類(lèi)似于動(dòng)物免疫的特性。 麥抗性育種研究的回顧與進(jìn)展 提高小麥的抗性（其中包括引起小麥減產(chǎn)的生物和非生物因素的抗耐性能，如抗病害、抗蟲(chóng)害、抗寒性、抗旱 性等 ）歷來(lái)是育種工作的重要目標(biāo)之一。由于普通小麥種內(nèi)基因資源的貧乏和原有抗源抗性的喪失，育種家們已日漸重視借助異種、異屬甚至親源關(guān)系更遠(yuǎn)的基因資源。向小麥轉(zhuǎn)移外源抗性的研究工作早在本世紀(jì)初就已開(kāi)始。經(jīng)過(guò)世界各國(guó)科學(xué)家的努力，這方面的研究工作大致經(jīng)歷了遠(yuǎn)源雜交階段、染色體操作階段以及基因操作的階段。 在早期，育種家主要通過(guò)小麥與表現(xiàn)抗性的異種或異屬植物進(jìn)行種間或?qū)匍g雜交，并繼以隨后的回交程序，亦即通過(guò)遠(yuǎn)源雜交的方法轉(zhuǎn)移外源抗性。然而，此法成功的先決條件是被轉(zhuǎn)移的抗性基因來(lái)自同源染色體，因?yàn)槿魏位虻?組合和重組都是以染色體配對(duì)為基礎(chǔ)的。在同屬內(nèi)，種間基因資源無(wú)法或者難以滿(mǎn)足育種目標(biāo)時(shí)，勢(shì)必將這種“外引”（ 大到異中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 3 屬物種，于是人們?cè)O(shè)想同樣通過(guò)屬間雜交后的回交程序去實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)移。然而，實(shí)踐表明，屬間的基因轉(zhuǎn)移較種間要復(fù) 雜的多，因?yàn)閿y帶抗性基因的異屬染色體大都和小麥的 3 個(gè)染色體組并不同源，因而難以通過(guò)正常配對(duì)實(shí)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)移。所幸的是，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)近源屬的染色體組的染色體大都和小麥染色體間多少殘留著程度不同的部分同源關(guān)系，從而使它們?cè)谝欢l件下，有可能和小麥的特定染色體發(fā)生配 對(duì)并提供基因轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。染色體轉(zhuǎn)移階段的一個(gè)重要的特征就是在追蹤被轉(zhuǎn)移基因的同時(shí)追蹤其載體 染色體或其片段。為此目的，研究者所要完成的雜交、回交和按標(biāo)記性狀進(jìn)行選擇的工作外，還有大量的細(xì)胞學(xué)鑒定和分析工作，其中特別是攜帶外源基因的染色體或其片段的辨認(rèn)與驗(yàn)證，并使此類(lèi) 研究進(jìn)入到外源基因的染色體標(biāo)定這一水平。這一階段大約持續(xù)了半個(gè)多世紀(jì)，這期間的許多技術(shù)進(jìn)步，其中包括組織培養(yǎng)（如胚拯救、花藥培養(yǎng)、愈傷組織繼代培養(yǎng)等），抗性鑒定技術(shù)，加速世代和染色體分帶技術(shù)，在提高轉(zhuǎn)移的效率和精確性方面發(fā)揮了重要的作用。 自從 1992 年獲得首例轉(zhuǎn)基因小麥以來(lái)，人們就在不斷的探索把抗性基因?qū)胄←湹膬?yōu)良品種，以期望得到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病蟲(chóng)害的小麥，這就是基因操作階段。隨著人們對(duì)抗病機(jī)制了解的不斷深入，以及許多抗病基因的不斷克隆，目前人們已經(jīng)利用各種轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了預(yù)期的轉(zhuǎn)基因小麥。所轉(zhuǎn)化的基因除了新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（ 、草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶（ 潮酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶（ 葡萄糖苷酶（ 標(biāo)記基因和報(bào)告基因外，還包括雪花蓮凝集素（ 高分子量谷蛋白亞基因（ 病毒外殼蛋白基因（ 病毒復(fù)制酶基因（ ，分別涉及到改良小麥品質(zhì)和提高小麥對(duì)蚜蟲(chóng)、病毒抗性等性狀。但由于人們對(duì)各種遺傳轉(zhuǎn)化體系的機(jī)理還不是十分清楚，而且各種轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率普遍較低，重復(fù)性差，所以還不能規(guī)?；@得抗病轉(zhuǎn)基因植株。小麥主要的病害是由真菌侵染引起的，但目前對(duì)小麥抗真菌病害轉(zhuǎn)基因育種的報(bào)道還很少，尤其關(guān)于赤霉病、紋枯病等。 麥常見(jiàn)的病害 麥常見(jiàn)的真菌病害 由于小麥在我國(guó)分布很廣，華北、西北、東北和長(zhǎng)江流域均有種植，各地病害種類(lèi)有所不同。全世界記載的小麥病害有 200 多種，我國(guó)發(fā)生較重的有 20 多種。病害的危害 不僅造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，而且大大影響小麥的品質(zhì)。 小麥銹?。?為小麥葉銹、小麥條銹和小麥稈銹，一直是小麥上的主要病害，歷史上曾經(jīng)幾度大流行，損失慘重。 1950 年小麥條銹病大流行，損失小麥 60 億 后的 10 幾年間，小麥葉銹病在華北，小麥稈銹病在東北、華南都曾有過(guò)流行，給小麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。由于抗病品種的培育和推廣，近 40 余年內(nèi)未發(fā)生過(guò)大面積的流行，但小麥條銹病在西北和華北局部地區(qū)的某些年份仍發(fā)生嚴(yán)重，葉銹病的發(fā)生面積也在不斷擴(kuò)大，稈銹病基本未發(fā)生過(guò)嚴(yán)重危害。小麥葉銹主要危害小麥葉 片，有時(shí)也危害葉鞘和莖；條銹病主要危害葉片，也可危害葉鞘、莖稈及穗部，小麥?zhǔn)芎?，葉片表面出現(xiàn)褪綠斑；主要危害莖稈和葉鞘，也可危害葉片和穗部。 小麥白粉病（ 一種世界性病害，在主要產(chǎn)麥國(guó)均有分布。我國(guó) 1927中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 4 年首先發(fā)現(xiàn)于江蘇省，后逐漸在西南各省和部分沿海地區(qū)發(fā)生， 20 世紀(jì) 70 年代隨著矮稈小麥品種的推廣和水肥條件的改善，發(fā)病面積和范圍不斷擴(kuò)大，并向北方麥區(qū)蔓延。目前全國(guó)已有 20個(gè)省市發(fā)生白粉病，以西南各省和河南、山東、湖北、江蘇、安徽等省發(fā)生較重，而且西北、東北麥區(qū)也 有日益嚴(yán)重的趨勢(shì)。 1981 年和 1989 年該病在我國(guó)大范圍流行，被害麥田一般減產(chǎn) 10%左右，嚴(yán)重地塊損失達(dá) 2030%，個(gè)別地塊甚至達(dá)到 50%以上。 1990 年河南省白粉病發(fā)病面積達(dá)260 多萬(wàn) 麥播面積的一半左右，估計(jì)產(chǎn)量損失近 4 億 麥白粉病在苗期至成株期均可危害。該病害主要危害葉片，嚴(yán)重時(shí)也可危害葉鞘、莖稈和穗部。病部初產(chǎn)生黃色小點(diǎn)，而后逐漸擴(kuò)大為圓形或橢圓形的病斑，表面生一層白粉狀霉層（分生孢子），霉層以后逐漸變?yōu)榛野咨?，最后變?yōu)楹稚?，其上生有許多小黑點(diǎn)（閉囊殼）。一般葉片正面病斑比反面多，下 部葉片多于上部葉片。病斑多時(shí)可愈合成片，并導(dǎo)致葉片發(fā)黃枯死。嚴(yán)重時(shí)植株矮小細(xì)弱，穗小粒少，千粒重明顯下降，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。 小麥赤霉病 (全世界普遍發(fā)生，主要分布在潮濕和半潮濕區(qū)域，尤其氣候濕潤(rùn)多雨的溫帶地區(qū)受害嚴(yán)重。在我國(guó)該病過(guò)去主要發(fā)生在小麥穗期濕潤(rùn)多雨的長(zhǎng)江流域和沿海地區(qū)，20 世紀(jì) 70 年代以后逐漸向北方麥區(qū)蔓延。 1985 年全國(guó)大爆發(fā)，僅河南省發(fā)病面積就達(dá) 150 多公頃，減產(chǎn) 病不僅造成產(chǎn)量損失，而且降低小麥品質(zhì)，使蛋白和面筋含量減少，出粉率降低，加工性能受到明顯的影響。 更為嚴(yán)重的是有赤霉菌所產(chǎn)生的毒素對(duì)人畜具有毒性，嚴(yán)重感染此病的小麥不能食用。目前世界各國(guó)都將檢測(cè)面粉中的毒素含量作為衡量小麥面粉品質(zhì)的指標(biāo)之一。赤霉病在小麥的各個(gè)生育期均能發(fā)生。苗期形成苗枯，成株期形成莖基部腐爛和穗枯，以穗枯危害最重。被害的小穗最初在基部變水漬狀，后漸失綠褪色而呈褐色病斑然后穎殼的合縫處生出一層明顯的粉紅色霉層（分生孢子）。一個(gè)小穗發(fā)病后，不但可以向上、下蔓延，危害相鄰的小穗，并可深入穗軸內(nèi)部，使穗軸變褐壞死，從而使上部沒(méi)發(fā)病的小穗因得不到水分而變黃枯死。后期病部出現(xiàn)紫黑色粗糙顆粒（子囊殼 ）。籽粒發(fā)病后皺縮干癟，變?yōu)樯n白色或紫紅色，有時(shí)籽粒表面有粉紅色霉層。 小麥全蝕病 (一種典型的根部病害，廣泛分布于世界各地。 1884 年英國(guó)最早記錄， 1931 年前后我國(guó)在浙江省發(fā)現(xiàn)，以后在部分省區(qū)零星發(fā)生。 20 世紀(jì) 70 年代初小麥全蝕病在煙臺(tái)嚴(yán)重發(fā)生，而今已擴(kuò)展到西北、華北、華東等 19 個(gè)省區(qū)，全蝕病是小麥的毀滅性病害，引起植株成簇或大片枯死，降低有效穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒重，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。 小麥苗期和成株期均可發(fā)病，已近成熟期時(shí)病株癥狀最為明顯。幼苗期病原菌主要侵染種子根、地下 莖，使之變黑腐爛，部分次生根也受害。病苗基部葉片黃化，心葉內(nèi)卷，分蘗減少，生長(zhǎng)衰弱，嚴(yán)重時(shí)死亡。病苗返青推遲，矮小稀疏，根部變黑加重。拔節(jié)后基部 12 節(jié)葉鞘內(nèi)側(cè)和莖稈表面在潮濕條件下形成肉眼可見(jiàn)的黑褐色菌絲層，稱(chēng)為“黑腳”，這是全蝕病區(qū)別與其它根腐病的典型癥狀。重病株地上部分明顯矮化，發(fā)病晚的植株矮化不明顯。由于莖基部發(fā)病，植株早枯形成“白穗”。田間病株成簇或點(diǎn)片狀分布，嚴(yán)重時(shí)全田植株枯死。 麥常見(jiàn)的病毒病害 小麥黃矮病是小麥重要病害之一，它是由蚜蟲(chóng)傳播大麥黃矮病毒（ 引起的。感病的小麥表現(xiàn)為代謝紊亂，葉片發(fā)黃，植株矮化，有效分蘗減少，穗中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 5 粒數(shù)和千粒重降低而嚴(yán)重減產(chǎn)，因而該病有“黃色瘟疫”之稱(chēng)。由于該病的傳播介體專(zhuān)化性強(qiáng)，僅局限于植物的韌皮部生長(zhǎng)且細(xì)胞內(nèi)病毒含量很低，目前還沒(méi)有理想的方法來(lái)防治該病毒。我國(guó)的 4 種株系即 國(guó)外報(bào)道的 較密切的血清學(xué)關(guān)系。幾乎所有種植小麥的國(guó)家均發(fā)生過(guò)此病， 1978 年美國(guó)小麥黃矮病大爆發(fā)使其減產(chǎn)60 80%， 1988 年德國(guó)發(fā)生小麥黃矮病使其冬 小麥減產(chǎn) 40%。我國(guó)在 1966、 1970、 1973、 1978、1980 等五年均發(fā)生過(guò)該病，平均每次產(chǎn)量損失達(dá) 20%以上，近年有加重趨勢(shì)。 用于小麥抗真菌基因的研究 幾丁質(zhì)酶和 幾丁質(zhì)是一種廣泛分布于多數(shù)真菌細(xì)胞壁上的主要成分。它是 最早在 1957 年被 體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中合成。幾丁質(zhì)酶能水解 4物中的 非線(xiàn)性同聚物，即植物中缺少該酶的有效底物。所以幾丁質(zhì)酶可以降解病原真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，破壞細(xì)胞新物質(zhì)的沉積致使病原體死亡，而且產(chǎn)生的細(xì)胞壁碎片具有誘導(dǎo)作用，從而刺激寄主植物的抗病反應(yīng)。 0 (1979)報(bào)道，從麥胚中提取的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶對(duì)真菌菌絲新形成的孢子具有更大的降解活性。 (1986)用試驗(yàn)證明植物幾丁質(zhì)酶是植物體中重要的抗真菌蛋白。杜良成 (1992)發(fā)現(xiàn)，水稻幾丁質(zhì)酶可抑制稻瘟菌 (子和芽管的伸展。 W. (1988)報(bào)道曼陀羅的幾丁質(zhì)酶能有效抑制木霉 (布拉克須霉 (孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。 (1986)報(bào)道純化的蠶豆幾丁質(zhì)酶能高度抑制綠色木霉的生長(zhǎng)，其有效濃度和病原菌感染或乙烯處理后的蠶豆葉片粗提液中的酶濃度相似。蠶豆葉片抽提液的抗真菌活力幾乎被蠶豆幾丁質(zhì)酶的抗血清完全抑制，充分說(shuō)明了幾丁質(zhì)酶是抽提液中抑制菌絲生長(zhǎng)的主要成分。最新試驗(yàn)表明，某些幾丁質(zhì)酶還能催化糖基反應(yīng)。 1989 年 從 分泌液中分離到一種幾丁質(zhì)酶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它還能抑制淀粉酶活性，從而有效抑制蝗蟲(chóng)等昆蟲(chóng)類(lèi)。王海波 (1994)等發(fā)現(xiàn)蠶豆幾丁質(zhì)酶可以抑制早期若蚜的存活和生殖發(fā)育。高等植物中普遍存在著幾丁質(zhì)酶，很多植物病原菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)，而植物本身至今未發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶底物 幾丁質(zhì)的存在，因此，幾丁質(zhì)酶在防御病原菌真菌侵害中具有重要的作用。平時(shí)健康植株幾丁質(zhì)酶的含量較低，但誘導(dǎo)后幾丁質(zhì)酶可在植物體內(nèi)大量積累。目前已克隆了二十多種植物中的各類(lèi)型幾丁質(zhì)酶基因三十多個(gè)。 是植物受到病原菌侵染后，細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，同時(shí)自身放出胞液中儲(chǔ)存的有害物質(zhì)中的一種， 在真菌的細(xì)胞壁中卻普遍存在，葡聚糖酶可單獨(dú)或與幾丁質(zhì)酶一起控制真菌的生長(zhǎng)，二者通過(guò)降解真菌細(xì)胞壁的主要成分 而導(dǎo)致菌絲體頂端膨脹破碎，最終死亡。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒 論 6 核糖體失活蛋白基因 高等植物中廣泛存在一種名為核糖體失活蛋白（ 毒蛋白。 它具有損傷真核細(xì)胞核糖體，從而抑制蛋白質(zhì)合成的功能。由于植物產(chǎn)生的這類(lèi)毒蛋白對(duì)其他生物毒害，因此認(rèn)為它們的功能是對(duì)自身的保護(hù)作用。它們可存在于植物的葉、根、種子等不同部位，或在不同的生理階段出現(xiàn)，濃度范圍從每 100g 植物組織中幾 幾百 根據(jù)肽鏈的組成和性質(zhì)，植物來(lái)源的核糖體失活蛋白通常被分為三類(lèi)：型為單鏈型，分子量通常為 25 32 有 水解真核細(xì)胞核糖體的 28S 4324 位腺苷上的 苷鍵，使核糖體失活；型為雙鏈型， 由一條 類(lèi)似型核糖體失活蛋白的肽鏈和一條具有凝集素活性的肽鏈通過(guò)二硫鍵連接形成，分子量約為 60 型核糖體失活蛋白也為雙鏈，但兩條肽鏈之間通過(guò)非共價(jià)相互作用結(jié)合在一起，且兩條鏈都參與形成 其分子量約為 25 于凝集素的存在，使型和型核糖體失活蛋白可以結(jié)合到細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂上，增強(qiáng)了它們進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的能力。據(jù)推測(cè)，這三核糖體失活蛋白可能起源于共同的祖先基因，在進(jìn)化過(guò)程中，有的毒蛋白基因與凝集素的基因融合，就逐漸形成了雙鏈的核糖體失活蛋白。 研究表明，核糖體失活蛋白的抑 制機(jī)制是：作用于真核生物 80s 核糖體的 60s 大亞基，使28守環(huán)中的一個(gè) N 糖苷鍵斷裂，失去了一個(gè)腺嘌呤，由于該保守環(huán)區(qū)是蛋白延伸因子的結(jié)合區(qū)域，從而導(dǎo)致核糖體不能再結(jié)合蛋白延伸因子，抑制了蛋白質(zhì)合成的循環(huán)。但 對(duì)親源關(guān)系較遠(yuǎn)種類(lèi)的核糖體具有不同程度的活性，離體研究表明純化的大麥 有效的抑制植物病原真菌的生長(zhǎng)，并且與幾丁質(zhì)酶和 葡聚糖苷酶有協(xié)同作用。 2000 人通過(guò)基因槍法將 因?qū)胄←溛闯墒炫撸@得了轉(zhuǎn)基因小麥植株。 近年來(lái)的研究發(fā) 現(xiàn)，核糖體失活蛋白除了具有 具有多種生