.,血液中葡萄糖的測(cè)定鄰甲苯胺法,.,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)了解血糖的概念。(2)掌握血糖的測(cè)定方法鄰甲苯胺法。,.,二、實(shí)驗(yàn)原理,血糖及正常血糖水平:,血糖：指血液中的葡萄糖.,正常血糖濃度：空腹波動(dòng)在3.896.7mmol/L（70110mg/dl）餐后2h內(nèi)應(yīng)7.8mmol/L（140mg/dl）。,.,糖的重要生理功能,.,血糖的來(lái)源、去路,.,.,.,高血糖癥與糖尿病,、高血糖癥:空腹血漿血糖（FPG）6.7mmol/L（130mg/dl）,生理性：包括飲食性（高糖飲食）或情感性（情緒緊張，腎上腺分泌增加）,病理性：見(jiàn)于糖尿病；內(nèi)分泌腺（甲狀腺、腎上腺皮質(zhì)或髓質(zhì)、胰島細(xì)胞功能亢進(jìn)）；顱內(nèi)壓升高刺激血糖中樞；嘔吐、腹瀉、高熱等引起的脫水。,尿糖：若血糖濃度高于腎糖閾值9.0mmol/L，出現(xiàn)尿糖。,.,糖尿?。╠iabetesmellitus,DM）定義：是一種慢性、復(fù)雜的代謝紊亂性疾病，系胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足，或利用缺陷引起。臨床特征：血糖持續(xù)升高，甚至出現(xiàn)糖尿。長(zhǎng)期患有糖尿病常有脂類(lèi)、蛋白質(zhì)代謝紊亂以及眼、腎的微血管病變及神經(jīng)病變等并發(fā)癥。嚴(yán)重者還可出現(xiàn)水、電解質(zhì)紊亂及酸堿平衡紊亂，表現(xiàn)為高脂血癥，酮癥酸中毒等，重者可致死亡。,.,糖尿病的分類(lèi),IDDM：也稱(chēng)型糖尿病，好發(fā)于青春期，對(duì)胰島素敏感。NIDDM：型，常見(jiàn)于中年肥胖病人，病變?cè)谟诎屑?xì)胞膜上的胰島素受體的數(shù)目減少或者缺陷，因而對(duì)胰對(duì)胰島素不敏感。繼發(fā)性糖尿?。喝缡茹t細(xì)胞瘤、庫(kù)欣病等，或其它因素。,.,兩類(lèi)原發(fā)性糖尿病的特征,特征1型2型基本病因遺傳+環(huán)境發(fā)病機(jī)制自身免疫性疾病生物活性降低占DM%15%85%（可發(fā)展為1型）發(fā)病年齡通常20歲40歲身體肥胖罕見(jiàn)多見(jiàn)血胰島素（絕對(duì)不足）或（相對(duì)不足）病情及酮癥較重、常見(jiàn)較輕、少見(jiàn)治療胰島素敏感控制飲食、減肥,.,無(wú)機(jī)化學(xué)法有機(jī)化學(xué)法酶法,血糖的測(cè)定,.,（一）無(wú)機(jī)化學(xué)法（氧化還原法）,方法類(lèi)型原理用途及備注班氏法半定量G+Cu+Cu2O尿糖測(cè)定（Benedict）磷鉬酸法定量G+Cu+Cu2O歷史意義（Folin-Wu）分光Cu+磷（砷）鉬酸鹽操作復(fù)雜、需制濾液、砷鉬酸法同上藍(lán)色絡(luò)合物特異性差、新銅試劑法（660nm）受還原物質(zhì)影響結(jié)果偏高10%堿性高鐵同上G+Fe(CN)6-3Fe(CN)6-4歷史意義氰化物法黃色無(wú)色Technicon曾用,.,（二）有機(jī)化學(xué)法（縮合法）,方法類(lèi)型原理用途及備注鄰甲苯胺定量G+鄰甲苯胺G基胺操作簡(jiǎn)便、法（630nm）無(wú)需濾液、特異性較高，中小醫(yī)院使用普遍，很少用于自動(dòng),.,鄰甲苯胺法,.,（三）酶法,方法類(lèi)型原理用途及備注己糖激酶定量G+ATPG-6-P+ADP血清尿液腦脊液、（HK）法分光G-6-P+NADP+公認(rèn)參考方法動(dòng)態(tài)GA-6-P+NADPH操作簡(jiǎn)便，特異終點(diǎn)（340nm）性和靈敏性均高手工、自動(dòng)化分析葡萄糖氧同上G+O2GA+H2O2推薦常規(guī)方法化酶（POD）H2O2+染料有色染料偶聯(lián)法（還原型）（氧化型）可制試紙片定量（Trinder）（4-氨基安替比林+酚半定量篩選試驗(yàn)紅色琨類(lèi)化合物505nm）,.,方法類(lèi)型原理用途及備注葡萄糖氧定量G+O2GA+H2O2與HK法有最佳化酶氧消電化學(xué)用O2電極作極譜測(cè)定，相關(guān)性耗法動(dòng)態(tài)求O2的消耗量（CX3生化儀）終點(diǎn)葡萄糖脫定量G+NAD+GA+NADH偶有使用氫酶（GDH）分光（340nm）可自動(dòng)化分析法動(dòng)態(tài),.,刺血針,.,血糖儀,.,二、實(shí)驗(yàn)原理葡萄糖在熱的醋酸溶液中，與鄰甲苯胺縮合成雪夫氏堿(Schiffbase)。雪夫氏堿呈蘭綠色，其最高吸收峰為630nm波長(zhǎng)，顏色深淺與葡萄糖含量成正比。反應(yīng)式如下:,.,.,三、實(shí)驗(yàn)器材分光光度計(jì)（630nm），比色皿計(jì)算紙（9cm9cm）3.水浴鍋4.10ml容量瓶四、實(shí)驗(yàn)試劑1.鄰甲苯胺溶液2.5g硫脲溶于冰醋酸，加入鄰甲苯胺150ml及2.4%硼酸100ml，用冰醋酸定容至1升2.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液（10mg/ml，用飽和苯甲酸溶液配制）3.血清（100ml）,.,血液經(jīng)抗凝處理后的全部血液為全血；離心除去血細(xì)胞后所得到的淡黃色液體為血漿。如血液不經(jīng)抗凝處理，讓他自行凝固，則在抽血后的一段時(shí)間內(nèi)，血液會(huì)自動(dòng)在一系列凝血因子的作用下發(fā)生凝集，血液首先凝固成一個(gè)整體，再經(jīng)過(guò)一段時(shí)間或用離心機(jī)離心，血液中凝固的部分會(huì)與一些清澈淡黃色的液體分離開(kāi)，這些液體稱(chēng)為血清。血清與血漿從表面上看似乎沒(méi)有什么不同，但其內(nèi)在的主要區(qū)別是血清中不含纖維蛋白原，是未經(jīng)抗凝處理過(guò)的血液凝固后得到的。血清多用于血液生化、免疫等方面的測(cè)定；血漿多用于凝血等方面的測(cè)定；全血?jiǎng)t多用在血細(xì)胞、血常規(guī)、血沉等方面的測(cè)定。,.,五、實(shí)驗(yàn)步驟取5支10ml容量瓶，標(biāo)號(hào)，依次加入葡萄糖母液0.25，0.5，1.0，2.0，3.0ml，用飽和苯甲酸稀釋至10ml，混勻（則上述溶液100ml葡萄糖含量為25，50，100，200，300mg）；混勻后，置沸水中15分鐘，立即移入冷水浴中冷卻；以0號(hào)管調(diào)零，在630nm處比色（見(jiàn)下表），以各管的吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)管中葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)測(cè)定管吸光度查找含量。,.,.,標(biāo)準(zhǔn)曲線（standardcurve）是指通過(guò)測(cè)定一系列已知組分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的某理化性質(zhì)，而得到的性質(zhì)的數(shù)值曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的目的是推導(dǎo)待測(cè)物質(zhì)的理化屬性。常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，通常情況下的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是一條直線。,.,六、注意事項(xiàng)1.本法不需要除去蛋白質(zhì)，鄰甲苯胺試劑只與醛糖顯色，血液中其他還原性物質(zhì)基本上無(wú)影響。2.鄰甲苯胺試劑與葡萄糖顯色的深淺及其穩(wěn)定性與試劑中鄰甲苯胺濃度、冰醋酸濃度、加熱時(shí)間有關(guān)。此法顯色穩(wěn)定，2