1、貞眉內(nèi)容實驗基本步驟提取細(xì)胞蛋白BCA定量制備蛋白膠(SDS-PAGE膠)蛋白樣品變性電泳轉(zhuǎn)膜封閉抗TBST洗滌二抗TBST洗滌顯影頁腳內(nèi)彳9貞眉內(nèi)容結(jié)果分析頁腳內(nèi)容9貞眉內(nèi)容試劑配制1 .PBS磷酸鹽緩沖溶液1L頁腳內(nèi)彳9磷酸二氫鉀0. 24g磷酸氫二鈉1.44g氯化鈉8g氯化鉀0. 2g加入500ml純水，調(diào)PH=7. 2定容至1L.高壓蒸汽滅菌2.PBST (PBS+0.05%Rt溫JO)500mlPBS+0. 25ml 吐溫-203電轉(zhuǎn)液500mlTris1. 5g甘氨酸7.2g400ml水溶解加入loom甲醇，置于4°C冰箱預(yù)冷4電泳液(IX)lOx稀釋，SOmllOx電泳

2、液T50inl純水5.TBS6.TBST (TBS+0.05%吐溫20)50mlTBS+450ml 純水+025ml 吐溫207封閉液TBST1X+5% 奶粉 40ml封閉液=40mlTBST+2g奶粉，40°C預(yù)熱WB實驗.蛋白樣品制備準(zhǔn)備:一管細(xì)胞，PBS (4匸預(yù)冷)r PMSF (lOOmM),移液槍(lOOOuL lOul) , l.SmIEP管2個，高速冷凍 離心機(jī)"C預(yù)冷 1于jcrc冰箱中取出一管細(xì)胞樣品，吸去培養(yǎng)液 2加入1ml 4r預(yù)冷的PBS (O.OIM pH7.2-73) o用移液槍輕輕吹成懸浮液后4C, 8000r離心5min,然后 棄去上淸。重

3、復(fù)以上操作一次，共洗細(xì)胞兩次以洗去培養(yǎng)液。3按1ml裂解液加10 U I PMSF (100 mM),搖勻置于冰上。(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。) 4在樣品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹勻，于冰上裂解30 min.為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回5裂解完后，于4°C b 12000 rpm離心5 miru 7將離心后的上消分裝轉(zhuǎn)務(wù)倒0,5 ml的離心管中放于一20C保存。蛋白含量的測定（BCA定量）準(zhǔn)備：96 孔板，移液槍(lOOOuL lOul. 200ul) r BCA 工作液(A+B) , 50mlEP 管，IxPBS, BSA 標(biāo)準(zhǔn)液 1將96孔板分好

4、區(qū)域，若不夠分則只做兩個重復(fù)（外用一圈的孔最好不用） 2算好孔數(shù)（總的每孔加200UIBCA工作液（A+B） > （A液：B液=50:1 r 般配多些，如60孑L，A液12000ubB 液 240ul) 3將樣品稀釋到一泄倍數(shù)才能泄量，（W倍，20倍，30倍），每孔需要20ul樣品（2ul樣品+18ulPBS,即稀 釋10倍），做三個重復(fù)則需要60ul, 般配80ul 4配蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品，將2mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.5mg/mh若配200ul的0.5mg/ml 白標(biāo)準(zhǔn)溶液則 需要50ul的2rng/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和150ul PBS溶液 5將稀釋好的樣品加入孔板中（標(biāo)記的區(qū)域

5、），接著標(biāo)準(zhǔn)品按0, l,2A8,12.16.20ul加到標(biāo)號的區(qū)域，之后 在加標(biāo)準(zhǔn)樣品的孔內(nèi)，將孔內(nèi)溶液用PBS補(bǔ)足到20ul 6每孔加200UI配好的工作液，平行加，不能上下加，以減少誤差 7將加好的96孔板放在37“C下孵育30分鐘 8孵育完后,放在酶標(biāo)儀輕微農(nóng)蕩310勺中速，吸光值595nE進(jìn)行比色測定，記錄標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品吸光值數(shù)據(jù)后/ 以蛋白含量（ml為橫坐標(biāo)吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（r2>C）98才有用酶標(biāo)儀操作:兩個箭頭圖標(biāo),1是 結(jié)果,2是保存） 9訃算蛋白含量（注意企量樣品已經(jīng)稀釋了 10倍蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣量序號標(biāo)準(zhǔn)蛋白*/ul(0. Smg/ml)121620

6、背最液(PBS) /ul 20191816120.0250.050. 10.20.30.40.5三.SDS-PAGE電泳1.配膠（12%,可以提前配好）準(zhǔn)備：玻璃板，梳子，AP （解凍，現(xiàn)拿現(xiàn)用），聚丙烯酰胺（4C冰箱冷藏）(1)玻璃板驗漏5min(2)按表配置分離膠(3)灌膠，加酒精封壓，凝30min （注意不要有氣泡）(4)按表配濃縮膠，倒掉酒精，用吸水紙吸去酒精，灌膠，插梳子（注意不要有氣泡），凝30nMn(5)取膠，用水沖洗一下濃縮膠，加少量水放入一次性手套中4乜冰箱保存?zhèn)溆?樣品處理準(zhǔn)備：PBS.移液槍，rSmiEP管（1）稀釋樣品：一般每孔上樣5ul,即Img/ml濃度的樣品，測完

7、蛋白含量后，將樣品用PBS稀釋至Img/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）（2）取出上樣樣品15ul至i5 ml離心管中，加入6XSDS上樣緩沖液3ul至終濃度為IX ° （上樣總體積一般不超過15 Uh加樣孔的最大限度可加20 Al樣品。）（3）將樣品在100°C煮5min蕩使蛋白完全變性（注意儀器操作）3.電泳準(zhǔn)備：電泳液500rnl （現(xiàn)配），蛋白膠，lOul移液槍（槍頭），樣品，Marker,冰盒，電泳裝程（1）將SDS-PAGE膠放入電泳槽中，加足夠的電泳液。（短玻璃板而向內(nèi)，長玻礙板而向外.若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一而面向

8、外。電泳液至少要漫過內(nèi)測的短玻璃板。注意先檢漏。）（2）上樣。用移液槍貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。貞眉內(nèi)容（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳 緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。）（3）先設(shè)置80V.開始電泳，樣品祺酚藍(lán)跑至分離膠后增至120V電壓，電泳至浪酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。（此時準(zhǔn)備好電轉(zhuǎn)液準(zhǔn)備：電轉(zhuǎn)液（現(xiàn)配4C冰箱冷藏），檢子,濾紙，PVDF膜（045um）,電轉(zhuǎn)裝程，冰盒注意：拿濾紙和膜時一泄要戴手套或用檢子,因為手上的蛋白會污染膜。1.在加有轉(zhuǎn)移液的盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子

9、、兩塊海綿墊2濾紙浸入電轉(zhuǎn)液中，PVDF膜在甲醇中潤濕成半透明，小心將膜放入4°C電轉(zhuǎn)液中平衡至少5mim3. 將夾子打開使黑的一而保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里而的氣泡。（一 手搟另一手要壓住墊子使尖不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上）， 一手固窪濾紙一手用玻棒搟去瓦中的氣泡。4, 先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松 動，直到撬去玻板。（撬時一泄要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影 響操作），要避免把分離膠刮破0小心剝下分離膠蓋于濾紙上（做好標(biāo)

10、記），用手調(diào)整使其與濾紙對齊, 輕輕用玻棒搟去氣泡.將膜蓋于膠上，要遙滿整個膠（膜孟下后不可再移動）并除氣泡。在膜上溢3張濾 紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去 氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路0 （轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開 門以使空氣流通0）5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中（電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，漿槽放入冰中），要使夾的黑面對槽的黑面夾的白而對槽的 紅面。一般用lOOmA轉(zhuǎn)移90miru6. 轉(zhuǎn)完后將膜用IX麗春紅染液染5 min （于脫色搖床上搖）°然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上 的蛋白0將膜晾干

11、備用。（準(zhǔn)備封閉液）六、免疫反應(yīng)準(zhǔn)備：封閉液，一抗，二抗，TBST 1.將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉2h。2. TBST洗4次Q每次5分鐘。3將膜按照目的蛋白所處位置剪切并做好標(biāo)記，加入相對應(yīng)的一抗，室溫孵育2h或者4匸過夜 4室溫下孵療12h后用TBST在室溫下脫色搖床上洗四次，每次5niin 5.同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育l2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗4次，每 次 5 min準(zhǔn)備：樣品膠片移液槍（200UI）,中槍頭，吸水紙，顯影液（A+B）,薄檢子抗二抗兔二抗目的蛋白78kdBip 1:1000目的蛋白34kdGAPDH 內(nèi)參 1:5000鼠