1、冷凍保存同種異體血管研究進(jìn)展    隨著現(xiàn)代免疫學(xué)、冷凍生物學(xué)、分子生物學(xué)的發(fā)展， 冷凍保護劑、 免疫抑制劑的應(yīng)用以及注重移植結(jié)構(gòu)及功能的完整。冷凍保存同種異體靜脈無論是基礎(chǔ)研究 還是臨床實踐都獲得相當(dāng)經(jīng)驗，但存在移植物再狹窄及替代小口徑動脈(2 mm)失敗率高的 缺點。近年來，有關(guān)動脈作為血管替代物逐漸被重視，取得一些進(jìn)展，但尚需繼續(xù)長期地探 索和實踐。1血管移植免疫進(jìn)展大量的實驗和臨床結(jié)果不但證實血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)是移植排斥重要的靶器官，而且通過其抗 原遞呈作用、表型變化和細(xì)胞因

2、子合成等，主動參與移植排斥過程。EC表達(dá)多種抗原，如： ABO血型抗原，MHC抗原和血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原系統(tǒng)。在排斥過程中，EC上的抗原與其相應(yīng)的抗 體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，激活補體釋放趨化因子，白細(xì)胞在補體參與下溶解EC，使基底 膜暴露，激活凝血系統(tǒng)，形成血栓，激活的巨噬細(xì)胞釋放白介素-1、腫瘤壞死因子等可提 高EC表面組織因子活性，增加纖溶酶激活物抑制因子和減少血栓調(diào)理蛋白，EC在細(xì)胞因子刺 激下可合成和分泌單核細(xì)胞趨化因子MCP-1/JE，吸引單核巨噬細(xì)胞遷移至移植物局部。同 時表達(dá)Class 抗原，提供所有激活CD4+

3、 T細(xì)胞所必需的信號，并可產(chǎn)生各種細(xì)胞因子， 引 起表型的變化。另外內(nèi)皮細(xì)胞膜還可作為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶場所，以使血管緊張素轉(zhuǎn)化成 血管緊張素，使血管收縮。近來，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞也表達(dá)Class 和Class 抗原系統(tǒng)，參與排斥反應(yīng)全過程1。2同種異體血管移植的基礎(chǔ)研究進(jìn)展2.1移植前血管處理及冷凍復(fù)溫技術(shù)    2.1.1制備(1)供體選擇來源于新鮮尸體及創(chuàng)傷性截肢患者，采用美國組織庫協(xié)會(AATB) 制 定的標(biāo)準(zhǔn)2。取血管應(yīng)在死后4 h完成，所有操作均在

4、無菌條件下進(jìn)行。(2)制備 技術(shù)的基本原則：從供體獲取血管應(yīng)嚴(yán)格遵循無創(chuàng)傷技術(shù)；獲取血管前1530 min，供體給 予平滑肌松弛劑(罌粟堿)及抗凝藥物(肝素)，以防止血管痙攣和血栓形成；保持制備液和室 溫37；灌注壓100 mg。(3)理論上以37自身含罌粟堿肝素化血液低壓灌注可最好保持 血管的生物活性，但通常從供體獲取血液是困難的。目前常采用37的生物培養(yǎng)液(如DMEM ，1640)，Brocdbank等獲得保存24 h后80%內(nèi)皮細(xì)胞存活率和平滑肌收縮度最大限度的保持 3。  &#

5、160; 2.1.2冷凍復(fù)溫隨著冷凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)和甘油的應(yīng)用及控溫冷凍技術(shù)的成熟 ，血管活性得以很好的保持。DMSO因穿透力強，研究較多，其濃度以15%為最佳。控溫冷凍 第二步溫值在-60-80之間，冷凍速率為0.51/min，復(fù)溫采用37水浴快速復(fù)溫。經(jīng) 過這樣處理的靜脈獲得80%的內(nèi)皮細(xì)胞存活率。Banbang等證實這些內(nèi)皮細(xì)胞具有與正常內(nèi)皮 細(xì)胞相似的增值和抗凝血功能4。Salomon等也從冷凍保存靜脈上獲得表達(dá)HLA抗 原的平滑肌細(xì)胞1。    2.2實驗性同種異體移植與

6、自體移植的比較性研究同種異體血管移植的 主要障礙是受體 的免疫排斥反應(yīng)。因此，研究在免疫缺陷的情況下在體冷凍保存血管移植的變化是必需的。 這樣自體冷凍血管不僅檢驗血管制備及宿主對移植物產(chǎn)生排斥反應(yīng)的冷凍保存技術(shù)的效果， 而且通過與同種異體移植物移植后組織結(jié)構(gòu)與功能的對比，了解同種異體移植物在整個過程 中的變化。自體移植物在移植過程中，可因離體缺血、牽拉、切割、吻合及在受體動脈高壓沖 擊下，內(nèi)皮細(xì)胞可有不同程度的壞死，從而使位于內(nèi)皮細(xì)胞下的結(jié)締組織裸露于血流，使附 壁血栓形成。1周后殘留的附壁血栓向致密而平滑的纖維被膜演變，同

7、時內(nèi)皮細(xì)胞再生開始 。內(nèi)膜增生和動脈粥樣硬化是發(fā)生在內(nèi)皮下層兩個相關(guān)聯(lián)的病理現(xiàn)象，或許是不可避免的創(chuàng) 傷適應(yīng)性改變。移植血管中膜可見平滑肌細(xì)胞壞死和纖維替代，外膜因部分膠原纖維束斷裂 和血管滋養(yǎng)管栓塞，形成纖維瘢痕，移植后72 h，新的滋養(yǎng)血管出現(xiàn)，2個月后基本恢復(fù)正 常，神經(jīng)再生于24周后開始。上述這些改變實質(zhì)上是導(dǎo)致自體靜脈移植后失敗的病理基礎(chǔ) 。相對于自體靜脈移植的內(nèi)膜增生，同種異體移植物動脈化主要是中膜增生5 。當(dāng)在同種異體移植物中又觀察到的內(nèi)膜增生是由于局部血栓沉積后成纖維細(xì)胞的重新排 列，移植后10&#

8、160;d內(nèi)皮細(xì)胞因免疫反應(yīng)而脫落，在隨后的6個月內(nèi)，裸露的內(nèi)膜上纖維蛋白 堆積減少并出現(xiàn)重新內(nèi)皮化，36個月移植物外膜的血管周圍組織可見游離淋巴細(xì)胞并在9 個月后消失。移植后5個月前列環(huán)素(PGI2)生成量與受體動脈PGI2生成量相比有顯著性 差異(P0.001)6。新鮮靜脈的順應(yīng)性明顯低于正常動脈灌注壓下動脈順應(yīng) 性(P0.001)5，可以看出，盡管移植段靜脈結(jié)構(gòu)發(fā)生動脈化，但其內(nèi) 膜 功能和生物力學(xué)特性并未發(fā)生動脈化。自體移植物與異體移植物短期的不同在于異體移植物 經(jīng)歷一個免疫反應(yīng)及內(nèi)皮細(xì)胞脫落的過程，因此，減少或阻止

9、受體免疫排斥反應(yīng)的實驗被 嘗試。    2.3免疫抑制劑對同種異體移植物的影響移植物免疫反應(yīng)特點已見前述 ，可以肯定免疫 排斥反應(yīng)在移植過程中扮演極其重要的角色。Augelli分別用倒置異體靜脈作為動脈橋接物 ，結(jié)果顯示經(jīng)免疫抑制劑處理組與未用免疫抑制劑處理組通暢率之比為7/110/10，有顯著 性差異(P0.001)，但長期通暢率依賴于免疫抑制劑的應(yīng)用7。Miller等移 植術(shù)后受體行免疫抑制治療及抗血小板治療1月后，血管平滑肌喪失功能8?？梢钥闯霰M管免疫抑制劑可能增加移植物通暢率，并且不損害

10、內(nèi)皮細(xì)胞的可能性也存在，但免疫抑制劑增加血小板聚集及血栓素(TxA2)的釋放，減少前列環(huán)素(PGI2)的產(chǎn)生，同時潛在的免疫抑制特性可能導(dǎo)致感染、神經(jīng)、腎毒、肝臟、血液、內(nèi)分泌等并發(fā)癥9。因此，移植物的治療代替受體的治療能避免免疫抑制劑的并發(fā)癥，這建立在冷凍保存移植物免疫抑制劑術(shù)前治療可能會減低免疫反應(yīng)和提高通暢率這個假設(shè)上，靜脈移植物術(shù)前治療能顯著提高通暢率已作為一種方法被肯定。    2.4血管移植受體的抗凝血治療在藥物實驗中抗血小板治療能減少移植物血栓形成的觀點已被接受。動物實驗證明，經(jīng)抗血小板治療的異體移植物與未經(jīng)治療移植物早期通暢率之比為83%

11、58%10。近年來，對阿司匹林等抗凝藥物的作用機制有新的看法，認(rèn)為其在抑制血小板釋放效應(yīng)的同時，也抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞PGI2的合成11。因此，抗凝藥物使用與否，有待于進(jìn)一步的對比研究和臨床長期觀察。3臨床應(yīng)用的初步結(jié)果初期一些學(xué)者通過戊二醛、酒精浸泡、冷凍、射線照射等來降低移植物的抗原性，以提高移植物的通暢率，這些研究結(jié)果從術(shù)后612個月15%至1342個月78%的不等通暢率。1971年D用改良的臍帶靜脈行下肢血管重建術(shù)后3年獲得76.4%(股?)39.8%(股腓)的通暢率。Shan等列出了38個患者43條硫酸軟骨素保存的靜脈得到917個月至1218個月累積67.8%的通暢率。1994年Mest

12、res報道用大口徑冷凍保存動脈得到8個月92.9%的通暢率12。另外，一些回顧性的隨機的臨床報告正著手調(diào)查，這些研究包括失敗的機制以及猜測治療干涉手段或改善移植術(shù)的外科技術(shù)，更多的臨床經(jīng)驗和移植物的長期觀察和積累，將決定是否在無合適的自體血管下有限制的使用問題。4同種異體血管移植失敗的影響因素影響移植段通暢率的因素，分為內(nèi)源性和外源性兩類，影響移植段遠(yuǎn)期通暢率的主要因素是內(nèi)源性因素。外源性因素包括：(1)手術(shù)技術(shù)缺陷：未遵循無創(chuàng)傷原則，吻合技術(shù)所致吻合口狹窄、扭曲等；(2)流出道受阻：Mcnally報道在膝關(guān)節(jié)以下動脈旁路移植術(shù)后1年通暢率的結(jié)果，當(dāng)移植物處于01個流出道情況下得到44%的通暢

13、率，而在23個流出道時則獲得73%的通暢率13；(3)靜脈移植瓣膜；(4)其他：如內(nèi)毒素、感染等。內(nèi)源性因素包括：(1)免疫排斥反應(yīng)；(2)管壁結(jié)構(gòu)的病理性改變，如動脈粥樣硬化；(3)生物力學(xué)的不匹配，如順應(yīng)性的改變；(4)移植段功能的改變，如PGI2的釋放減少，TxA2的釋放增加。另外，血管內(nèi)膜釋放的內(nèi)皮細(xì)胞血管舒張因子(EDRF)、內(nèi)皮素(ET)、抗凝血酶(AT)和肝素分子復(fù)合物、血栓調(diào)理蛋白(TM)、蛋白激酶C(PC)以及纖溶酶原激活物(PA)也參與整個過程14。近來一些生長因子，如血小板衍生因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)移生長因子的作用也得到重視15。這些物質(zhì)如何相互作用，影響移植物

14、通暢率，是今后值得進(jìn)一步研究的課題。5展望盡管冷凍小血管異體移植已經(jīng)取得很大成績，并展示出令人激動的前景，但仍有許多尚未解決的問題和難點，如移植段新生內(nèi)皮細(xì)胞的來源，冷凍保存能否降低抗原性，冷凍保存動脈移植能否成為合適的移植物應(yīng)用于臨床。大部分血管移植的最終目的是保存完整肢體的成活，特別在創(chuàng)傷外科中，當(dāng)合并有其他嚴(yán)重創(chuàng)傷不能耐受手術(shù)時，如果肢體能被冷凍保存直至能耐受手術(shù)時再植，肢體就能挽救。依靠現(xiàn)代冷凍保存技術(shù)，肢體延遲重建將由夢想變?yōu)楝F(xiàn)實。而改進(jìn)HLA配型技術(shù)、提高供體質(zhì)量、新的免疫抑制劑和生物制品的開發(fā)和應(yīng)用以及移植后準(zhǔn)確靈敏的免疫檢測等，仍是移植免疫學(xué)研究的重要課題。作者簡介：孫煒(19

15、70-)，男，安徽黃山人，主治醫(yī)師，現(xiàn)為第一軍醫(yī)大學(xué)博士生 ，主要從事骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)外科研究.參考文獻(xiàn)1Salomon RN,Friedman GB,Callow AD,et al.Cryopresetved aortic homografts contain viable smooth muscle cells capable of expressing transplantation antigensJ.J Th

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