1、一、提取組織RNA1 準(zhǔn)備好冰盒、1.5mlEP管優(yōu)RNA酶）、剪刀及鑷子（需消毒，再用滅菌純水和DEPC 水洗凈）、鉆頭、滅菌純水等。2. 取出凍存管，剪取約0.5cm放于EP管。3. 即刻加1ml trizol，剪碎至無可見微粒，靜置 5-10min4. 加0.2ml氯仿，蓋緊EP管，上下傾倒，混勻15s, 15-30C靜置2-3min5. 離心 12,000g*15min, 2-8 C6. EP管內(nèi)分三層，取上層液相置于新 EP管7. 加0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，15-30 C靜置10mi n8. 離心 12,000g*10mim, 2-8 C9. 棄上清（不用吸凈殘液），加1ml

2、 75%乙醇清洗沉淀（乙醇用前需4C預(yù)冷）10. 離心 10000/7500g*5min, 2-8 C11. 去上清（需吸凈殘液），干燥RNA（超凈臺內(nèi)風(fēng)干至白色變透明狀，約1h以上）,加10 12ul DEPC水解（約1h以上），測濃度，-80C保存。PS:1. 所用槍頭、EP管、DEPC水、純水、剪刀、鑷子均需滅菌。2.75%無水乙醇用前需4C預(yù)冷。3. 若最后提取出的RNA量多，可加30ulDEPC水溶解;若難以溶解，可置于55C水浴 加熱。4. 破碎：取組織勿過多，否則難以破碎，亦難以提取 RNA ;一個(gè)樣品破碎過后需清 洗，順序?yàn)椋壕凭耷虿料?f DEPC水洗拆分清理純水洗棉球吸去

3、鉆頭殘液。5. 破碎儀的使用：打開前先保證已調(diào)于低檔，將鉆頭浸沒于樣品中，切忌在空氣中 空轉(zhuǎn)，從低到高慢調(diào)，同時(shí)上下輕移樣品，注意力度控制，避免液體飛濺誤傷；同 時(shí)注意聽破碎時(shí)的聲音，若有尖銳聲音發(fā)出，說明有異物卡住鉆頭，需停止查看。二、提取細(xì)胞RNA1. 細(xì)胞加 1ml trizol 裂解 5min, 15-30 C2. 加0.2ml氯仿，蓋緊EP管，上下傾倒，混勻15s, 15-30C靜置2-3min其余步驟參見提取組織RNA的第5步開始PS:1. 新EP管需用無RNA酶EP管。2. 操作過程需時(shí)刻注意避免污染，EP管取放時(shí)勿碰到內(nèi)壁及管口，每步操作前需適時(shí)擦拭雙手及槍管。3. RNA勿照

4、紫外。4. DEPC水量較關(guān)鍵，需保證RNA充分均勻融解，若可用肉眼看到白點(diǎn)，可多加至 20ul。三、測RNA濃度：準(zhǔn)備96孔板f開蓋，蓋子朝天放 f加98ulEDPG預(yù)讀（setting： 0D值260;選 中區(qū)域；選 預(yù)讀” f “Read'結(jié)果復(fù)制f拿出孔板，再加2ulRNAf 直接“READ-復(fù)制結(jié)果（復(fù)制后的結(jié)果與軟件上的不同，此為已經(jīng)相減后的數(shù)據(jù)）-重設(shè)條件（setting： OD值 260 280;選中區(qū)域；“Normal； “Delete;” “OK）READ 復(fù)制結(jié)果-數(shù)據(jù)處理：CRNA（ug/ml）= “ Norm值預(yù)讀值CRNA（ug/ul）=50（稀釋倍數(shù)）*4

5、0 （OD值）*1/1000* C RNA（ug/ml）=2* C RNA（ug/ml）VRNA=1ug （可變） / C RNAVH2O=V （總體積由說明書得）V RNAPS：1. C260/ C280的比值意義范圍為1.8- 2.0,小于1.8可能是蛋白含量較多，大于2.0可能是 DNA 含量較多2往孔板加液時(shí)，勿使槍頭頂端碰觸孔板內(nèi)壁，以防損傷內(nèi)壁包被液3. 樣品多的話，不用分別加入，可先配總量，再分裝四反轉(zhuǎn)錄 PCRoligo(dT)總RNA10mMdNTP 混合物加至 11ul (12-1)1 加： 1ul1ng-5ug1ul滅菌水( DEPC)2. 混合物：放入PCR儀65C,

6、5min結(jié)束后迅速移至冰上 3加： 4ul 5*buffer2ul 0.1M DTT輕混勻PC37 C, 2min4. 室溫下加入 1ul M- MLV 輕混勻（防氣泡）5. PCR儀：37C, 50min + 70 C ,15min + 4 C , 5minPS:1冰上操作，嚴(yán)格遵守?zé)o RNA酶操作2. 加液時(shí)，槍頭貼近液面快速打出液體，提離液面后放松五. Q-PCR1. 加液： SYBR ( ROXPrimer5ul0.2ul (eppendorf AG PCR無需加此物)0.2+ 0.2ulcDNA0.5ulH2O4.1ul2. 離心：A、8聯(lián)管：樣品對稱離心打開離心機(jī)總開關(guān)打開蓋子對稱

7、放入樣品蓋面上 的白點(diǎn)對準(zhǔn)機(jī)孔邊的標(biāo)簽蓋好 按“啟動） 轉(zhuǎn)速升到 “1100左）右 按“停止） 等 轉(zhuǎn)速降至 “ 6 0左）右開蓋取出 儀器復(fù)位B、96孔板：水平離心， 3000rpm,3-5minPS:加液或轉(zhuǎn)運(yùn)樣品時(shí)均需用到冰盒。3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的使用（eppe ndorf AG PCR）：A .儀器結(jié)構(gòu)：上部為熒光檢測儀，下部為熱循環(huán)儀；銀質(zhì)模塊，光源為 LED ；2個(gè)光電倍增管（CPM檢測器）；4通道檢測： 520nm,550nm,580nm,608nm；B.備注：運(yùn)行前需預(yù)熱15mi n,PCR儀可過夜運(yùn)行。 此儀器需3個(gè)月校正一次，用DDwater （去離子水）20ul，默

8、認(rèn)校正溫度 為 60 C。 默認(rèn)熱啟動，每分鐘升溫8 C,可1次自檢/15min。 關(guān)于指示燈： 閃爍表明在運(yùn)行； 亮綠燈表明在保溫； 亮桔燈表明在自檢。 軟件登錄密碼為E/e;連續(xù)開啟軟件，間隔時(shí)間為1-2s;此儀器無需用 ROX作為校正熒光。 此程序可根據(jù)已完成循環(huán)的熒光信號 （原始數(shù)據(jù)） 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 在反 應(yīng)結(jié)束前即可觀察結(jié)果。 設(shè)置條件時(shí)一般選擇相對定量， 即藍(lán)色桶狀圖標(biāo)； 紅色桶狀圖標(biāo)為絕對C. 軟件操作：SYBR”開啟電腦開PCR儀-雙擊軟件圖標(biāo)口令“E/e”點(diǎn)擊軟件界面上端菜單左2 進(jìn)入操作界面-建立用戶：點(diǎn)擊上左6,選第一個(gè)，點(diǎn)擊進(jìn)入設(shè)置（選擇管理員用戶） 等待指示燈由黃變

9、綠 進(jìn)入界面“plate layout®行設(shè)置，“ Filter 520nm ”：“ Sample Vol 上”樣:體積； “ background ” : “ Ax-ysgtreipns8 ”管（8）0-放入樣品（記住安放順序，蓋緊蓋子且勿污染蓋面，輕放樣品以防產(chǎn)生氣泡或產(chǎn)生內(nèi)壁殘液）點(diǎn)住鼠標(biāo)左鍵，選定樣品區(qū)域，點(diǎn)擊右鍵，選擇“unkowr”（相對定量），標(biāo)記引物名稱選定內(nèi)參區(qū)域，點(diǎn)擊右鍵，選擇“Sta ndard（相對定量），標(biāo)記內(nèi)參名稱 轉(zhuǎn)換界面進(jìn)入“PCR Program，設(shè)置反應(yīng)體系（鼠標(biāo)移至目標(biāo)區(qū)域，點(diǎn)擊右鍵，選“Insert插入所需項(xiàng)）；選中下方的“TSP Heated Lid及 “Impulse； “Temp.Mode：“ standard 設(shè)置完后需保存，在點(diǎn)擊 “運(yùn)行 ”反應(yīng)體系：95C2min94 C15s 40*（熒）60 C25s/溶解曲線 （點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵 “Insert ” l “tinMg e”：）95C /94