1、lFormic acid induces Yca1p-independent apoptosis-like cell death in the yeast Saccharomyces cerevisiae甲酸甲酸在在釀酒酵母中誘發(fā)不依賴于釀酒酵母中誘發(fā)不依賴于Yca1p的細(xì)胞凋的細(xì)胞凋亡亡制作者：劉慧敏制作者：劉慧敏 、 褚立婷褚立婷 班級：班級：132學(xué)號：學(xué)號：06、072123 凋亡是一種活躍的細(xì)胞死亡過程，發(fā)揮維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要作用。過去的研究已經(jīng)凋亡是一種活躍的細(xì)胞死亡過程，發(fā)揮維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要作用。過去的研究已經(jīng)為細(xì)胞凋亡可以發(fā)生在單細(xì)胞生物以及后生動物中提供了大量的證據(jù)。為細(xì)胞

2、凋亡可以發(fā)生在單細(xì)胞生物以及后生動物中提供了大量的證據(jù)。 因?yàn)樵谝驗(yàn)樵贑DC48突變體中發(fā)現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡表型，突變體中發(fā)現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡表型，出芽的釀酒酵母已經(jīng)出芽的釀酒酵母已經(jīng)成為研究細(xì)胞程序性死亡的典型模型系統(tǒng)。成為研究細(xì)胞程序性死亡的典型模型系統(tǒng)。 蟻酸（甲酸）是一種弱酸，能引起氧化應(yīng)激。低濃度甲酸廣泛用作防腐劑的主要蟻酸（甲酸）是一種弱酸，能引起氧化應(yīng)激。低濃度甲酸廣泛用作防腐劑的主要成分。在另一方面，甲酸已被證明是一種有毒的甲醇代謝產(chǎn)物，它是一種常用的有機(jī)成分。在另一方面，甲酸已被證明是一種有毒的甲醇代謝產(chǎn)物，它是一種常用的有機(jī)溶劑。甲酸能引起代謝酸中毒影響視網(wǎng)膜和視神經(jīng)細(xì)胞，

3、最終導(dǎo)致失明。溶劑。甲酸能引起代謝酸中毒影響視網(wǎng)膜和視神經(jīng)細(xì)胞，最終導(dǎo)致失明。 低濃度的甲酸在出芽低濃度的甲酸在出芽釀酒酵母中能釀酒酵母中能誘發(fā)類似細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡，這一活躍過程誘發(fā)類似細(xì)胞凋亡的細(xì)胞死亡，這一活躍過程中伴隨著活性氧的爆發(fā)。中伴隨著活性氧的爆發(fā)。我們的研究將是我們的研究將是第一個第一個闡明闡明酵母中酵母中甲酸誘導(dǎo)甲酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用方式的研究細(xì)胞凋亡的作用方式的研究。此外，此外，我們的研究將建立一個在酵母我們的研究將建立一個在酵母中獨(dú)立中獨(dú)立Yca1p細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生 ROS的調(diào)控級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控級聯(lián)反應(yīng)的的模型模型系統(tǒng)。系統(tǒng)。材料：材料： 酵母菌株酵母菌

4、株W303-1A和它的同基因敲除突變體和它的同基因敲除突變體W303-1A、生長酵母細(xì)胞的、生長酵母細(xì)胞的YPD培養(yǎng)基（培養(yǎng)基（1酵母生長提取物，酵母生長提取物，2細(xì)菌蛋白胨和細(xì)菌蛋白胨和2葡萄糖）或選擇性合葡萄糖）或選擇性合成培養(yǎng)基。成培養(yǎng)基。方法：方法：甲酸處理與細(xì)胞死亡評估：甲酸處理與細(xì)胞死亡評估：甲酸處理：將中期指數(shù)生長期或穩(wěn)定生長期的酵母細(xì)胞懸浮在含甲酸處理：將中期指數(shù)生長期或穩(wěn)定生長期的酵母細(xì)胞懸浮在含0，20，40，50，60、70、80或或120微升甲酸的微升甲酸的YPD培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中。細(xì)胞死亡評估：通過細(xì)胞死亡評估：通過CFU計數(shù)檢測細(xì)胞存活率計數(shù)檢測細(xì)胞存活率透射電子顯

5、微鏡分析：透射電子顯微鏡分析： 觀察不同處理的酵母細(xì)胞。觀察不同處理的酵母細(xì)胞。膜聯(lián)蛋白膜聯(lián)蛋白-V-熒光素?zé)晒馑?- 異硫氰酸酯（異硫氰酸酯（FITC）和碘化丙啶（）和碘化丙啶（PI）染色：）染色：用于細(xì)胞用于細(xì)胞染色染色4,6-二氨基二氨基-2-苯基吲哚（苯基吲哚（DAPI）染色：）染色：評估染色質(zhì)凝聚和分散評估染色質(zhì)凝聚和分散若丹明若丹明123（Rh123）染色：）染色：評估評估線粒體膜電位的動作評估線粒體膜電位的動作評估末端標(biāo)記法分析：末端標(biāo)記法分析：鑒定鑒定DNA鏈的斷裂鏈的斷裂ROS產(chǎn)生的檢測：產(chǎn)生的檢測：將將5 mg mL-1DHR123加入到酵母細(xì)胞加入到酵母細(xì)胞YPD培養(yǎng)基中

6、，并在黑暗中培養(yǎng)基中，并在黑暗中（37）培養(yǎng)培養(yǎng)15分鐘。然后將細(xì)胞沖洗一次并重新懸浮于分鐘。然后將細(xì)胞沖洗一次并重新懸浮于1毫升含毫升含不同甲酸的濃度的不同甲酸的濃度的YPD培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)基中。在30中培養(yǎng)中培養(yǎng)40分鐘后，細(xì)胞用分鐘后，細(xì)胞用PBS洗一次。處理細(xì)胞中洗一次。處理細(xì)胞中ROS的生成的生成通過共通過共聚焦顯微鏡監(jiān)測。聚焦顯微鏡監(jiān)測。 ROS產(chǎn)生的過程還可以通過流式細(xì)胞儀（產(chǎn)生的過程還可以通過流式細(xì)胞儀（FACS）在不同時間點(diǎn)確定。）在不同時間點(diǎn)確定。1、低濃度甲酸誘導(dǎo)釀酒酵母中的凋亡細(xì)胞死亡、低濃度甲酸誘導(dǎo)釀酒酵母中的凋亡細(xì)胞死亡從左圖可以看出從左圖可以看出隨著甲酸濃度的增加

7、細(xì)胞存活率隨著甲酸濃度的增加細(xì)胞存活率下降。下降。比起指數(shù)生長期的細(xì)胞，穩(wěn)定生比起指數(shù)生長期的細(xì)胞，穩(wěn)定生長期的細(xì)胞更耐甲酸。由此說明細(xì)長期的細(xì)胞更耐甲酸。由此說明細(xì)胞的存活率取決于胞的存活率取決于甲酸處理的時甲酸處理的時期期。指數(shù)生長期指數(shù)生長期穩(wěn)定生長期穩(wěn)定生長期甲酸濃度甲酸濃度細(xì)胞存活率細(xì)胞存活率DNA鏈斷裂鏈斷裂DNA鏈被完全摧毀鏈被完全摧毀DNA鏈完好鏈完好細(xì)胞核是圓的細(xì)胞核是圓的細(xì)胞核是環(huán)狀的細(xì)胞核是環(huán)狀的細(xì)胞豐富細(xì)胞豐富細(xì)胞少細(xì)胞少2、甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是伴隨質(zhì)膜完整性的改變的過程、甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是伴隨質(zhì)膜完整性的改變的過程3、在甲酸誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生了活性氧、在甲酸

8、誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生了活性氧綠色熒光（圖綠色熒光（圖4A，左面，左面板）生產(chǎn)綠色用甲酸處板）生產(chǎn)綠色用甲酸處理過的細(xì)胞理過的細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖（圖4a，左圖），左圖）信號信號ROS的產(chǎn)生，熒光的產(chǎn)生，熒光（圖（圖4A，左面板）生產(chǎn)，左面板）生產(chǎn)ROS信號信號ROS信號信號用甲酸處理過的細(xì)用甲酸處理過的細(xì)胞發(fā)出強(qiáng)烈的胞發(fā)出強(qiáng)烈的綠色綠色熒光熒光表示產(chǎn)生了表示產(chǎn)生了ROS。4、甲酸誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡減少了線粒體膜電勢，并且最、甲酸誘導(dǎo)的酵母細(xì)胞死亡減少了線粒體膜電勢，并且最終導(dǎo)致線粒體分解終導(dǎo)致線粒體分解線粒體分解線粒體分解線粒體膜電線粒體膜電勢減小了勢減小了5、低濃度甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是不依賴低濃度甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是不依賴Yca1p基因的