1、1. 信號肽切割位點和目的基因核苷酸序列 5'端的設計酶切位點問題1.1 目的蛋白 N 端不要增加氨基酸： a-信號肽在 kex2 和 ste13 處進行切割， 若要目的蛋白不增加額外氨基酸， 則需要在 kex2對應核苷酸序列前的 XhoI 作為酶切位點， 并補齊信號肽切割所需的序列 （酶切位點下游的信號肽對 應的核苷酸序列）1.2 目的蛋白 N 端可增加氨基酸。則可以選用其他的酶切穩(wěn)點，保證下游不 出現(xiàn)移碼突變就行了。 （具體參考具體酶切位點切割點，及其上游核苷酸 數(shù)有否保證剛好是 3 的倍數(shù)）。2. 目的基因核苷酸序列 3'端的設計酶切位點設計、終止密碼子設計2.1 如果不

2、希望有 c-myc 和 His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；3. 載體構(gòu)建問題3.1 pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗 Zeocin 篩選，對于大小 合適（ 3050KD）的蛋白 在產(chǎn)量上是 pPIC9K無法比擬的3.2 pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表。 PIC9K操作麻煩一點，大腸用 amp 抗性，而畢赤酵母先用 His缺陷篩選陽性克隆，在利用 G418篩選多拷貝），3.3 位點不能出現(xiàn)在目的 DNA 片段中如果片段長無法避免，可以采用平 末端連接；3.4 雖然 -factor 可以自動切除， 但是在設計表達的時候， 如果在 N 端不能出 現(xiàn)任何多余的

3、 aa（比如藥物蛋白表達） ，需要特別留意（ 說明書上有詳細說 明： P13）；3.5 有三種不同的讀碼框 （對于 pPICZ系列來說就是對上 -factor 序列），在 設計克隆的時候要反復確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；3.6 無論 pPICZ還是 pPICZ都有 TG（A 終止密碼子），但是 pPICZ系列沒有 ATG（起始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的 ATG之間的距離越短對于 表達的該基因越有利；3.7 如果 不希望有 c-myc和 His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子 ；3.8 Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達偏好密碼子的問題有人

4、 認為沒有必要更換，有人認為一定要換， 個人認為以產(chǎn)量為主要目的的可以 考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋 白其實是和酵母密碼子相似的 ；3.9 克隆菌株需要有 recA， endA，試劑盒帶有的 TOP10挺好用的（其它像是 DH5都行），但是要注意 帶有篩選抗生素 Zeocin 的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基 （ NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用 （Zeocin平板要避光保存）；3.10測序引物可以用 -factor 信號引物，也可以用 5'AOX1引物；3.11 如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯(lián)基因片段進行表達，另 外也可以在轉(zhuǎn)化酵

5、母的時候重復轉(zhuǎn)化。3.12目的基因中最好不要含有 pro-glu-ser-thr 這樣的序列，因為這個序列是激 活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln 和gln-arg-x-phe-x 這樣的序列（ x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體 的切割，而且目的蛋白末端最好是 ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許 多高 A+T 含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄， 也需要多加注意。4. 畢赤酵母類型選擇問題4.1 赤酵母類型其中 X-33 由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔心轉(zhuǎn)化 率的話可以考慮這種酵母菌 ，而 GS115

6、與 X33 一樣都是屬于 MUT表現(xiàn)型， 也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據(jù)說會對外源基因表達有 影響， KM71 是 MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯 后加工，比如形成二硫鍵， 糖基化等等， 另外 SMD1168則是基因組中的 Pep4 基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性 的喪失，可以保護表達產(chǎn)物免受降解， 促進表達量的提高。4.2 表達形式與畢赤酵母選擇胞內(nèi)表達，應盡量用 Mut 細胞，這樣得到的 蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多 （約占 Pp 總分泌蛋白 量的 30-90%。而對于分泌蛋白的表達， 無論是甲醇利用慢 （Mut-） 還是甲醇

7、利 用快 （Mut+）的細胞都可應用。 一般手冊都會建議同時在這幾種菌株中進行轉(zhuǎn) 化，這主要是因為不同的基因在不同的酵母菌中可能表達量截然不同 ，因此 在最開始的時候建議多用幾種酵母菌實驗。4.3 傳代對轉(zhuǎn)化率、 表達量等影響原始酵母菌一定要保存好， 傳代多次后會影 響其轉(zhuǎn)化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于 -80，另一方面如果出 現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取 出新菌液（ 每次都要涂平板挑菌 ）。5. 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒問題5.1 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒要求由于酵母菌轉(zhuǎn)化對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高， 量也較大（5-10ug）， 要準備好足夠量的質(zhì)粒，并且 不要忘記也要同時準備空載

8、體以做對照 。5.2 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提純要求在線性化之后的質(zhì)粒就可以進純化回收。 選擇合適的純 化回收試劑盒，優(yōu)化回收步驟，目的提高回收效率， 獲得更多的線性化質(zhì)粒， 同時減少回收質(zhì)粒中的其他殘留 ，例如 殘留的酒精對于轉(zhuǎn)化的影響頗大 。5.3 是否線性化問題在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進行線性化， 這主要是為了增加重組率 （EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理是將目的片段 整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達） 。5.4 線性化位點問題線性化位點個人認為也會影響到表達量， 對于基因片段不 大的蛋白 可以考慮用幾個線性化位點同時進行轉(zhuǎn)化篩 選，但是如果片段大， 就有可能供選擇的機會

9、少， 而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點的情況， 這個時候也不是說不能進行表達， 但是準備的質(zhì)粒就要增加 10 倍，另外也可 以進行部分酶切（即先進行預實驗，掐定時間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部 分是在線性化位點切開而基因片段保存完好） 。6. 電轉(zhuǎn)化問題6.1 轉(zhuǎn)化酵母最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時間不要 超過一個星期；6.2 酵母生長狀態(tài)按照電轉(zhuǎn)化說明書的 OD，盡量保證這個時候的酵母比較新 鮮，轉(zhuǎn)化率才比較高；6.3 冰上操作整個感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作， 離心最好也用冷凍離 心機，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混 合物，另外山梨醇和

10、電轉(zhuǎn)杯都要預冷；6.4 電轉(zhuǎn)儀需要預熱準備感受態(tài)的時候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開了， 電轉(zhuǎn)后山梨醇 的加入要快。這個過程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時間， 如果時間過短（比如4ms） 就可能說明雜質(zhì)較多，會影響轉(zhuǎn)化率；6.5 轉(zhuǎn)化后溫育目的是為了增加同源重組， 增加存活率。 需要注意不要感染了 大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基 30搖一段時間，可以取部分涂板或者也有人將菌 短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。7. 挑選單克隆問題7.1 在 protocol 中用了許多篇幅來指導這一步， 包括如何去通過平板篩選， 觀 測生長速率來確定 Mut 表現(xiàn)型等。這個過程需要 3到 5天，而我一般只用用 了 4 個小時進

11、行 PCR（ AOX引物）篩選。7.2 酵母細胞破壁一般通過培養(yǎng)菌然后進行沸水和 -20冷凍循環(huán)過程裂解細 胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時候 片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶（很便宜的酶來 的）來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已， 其次也有奢侈的用試劑盒的。7.3 破壁后 PCR 模板量個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul 我覺得還是多了， 而且建議總體積不用這么大， 當然加入模板的量也與自 己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關(guān)。7.4 假陽性和假陰性結(jié)果在 Mut-和 Mut+ 情況是不一樣的，

12、如果用的是 5'AOX 引物， KM71H會出現(xiàn) 3.6kb 的片段，而 Mut+則會出現(xiàn) AOX1基因原本長度的 片段大約長 2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議 PCR過程中使用多對引物進行反應， 包括目的基因的， -factor 的，5'AOX的， 都可以，反正各種對照多了有利于比較。8. 表達問題8.1 篩選問題一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，我個人建議如果 在篩選完 3 批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進行重新轉(zhuǎn)化8.2 培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換時間你的克隆在 YPD培養(yǎng)基中培育到 OD600 值達到 6.0，就可 以離心收菌。用表達培養(yǎng)基（

13、比如 BMMY）重懸沉淀，在 30oC 培育過夜。8.3小批量表達問題 5ml 體系。生長慢型，生長快型，陰性對照（空質(zhì)粒） ， 陽性對照（可以是曾經(jīng)表達成功的重組子）和沒有進行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克 隆。8.4轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基操作 BMGY中培養(yǎng)到 OD值 2-6，離心收菌（如果怕污染或者 麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為 20-30 分鐘，讓菌沉淀下來，小心 傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌） ，轉(zhuǎn)入 BMMY 中誘導表達，這些步驟都需要在超 凈工作臺里進行。8.5 是否染菌問題如果要區(qū)分是否染菌， 可以取一些到顯微鏡下觀察， 或者聞 氣味（酸甜的是酵母） ，觀顏色（乳白色的是酵母） 。有可能會在沒有達到

14、 4 天的時間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無 菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。8.6 誘導無甲醇添加問題誘導物甲醇注意要在超凈臺中打開， 可以分裝到滅過 菌的瓶子中（當然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口 的時候要小心， 如果真的引起爆炸那可就損失大了） 。另外如果覺得每天添加 甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成 染菌，慎選。8.7 誘導后通氧問題酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活， 但是在甲醇誘導 的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶， 自然氧氣量對于這基因的表達影響重大， 但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最

15、好專辟出一個搖床進 行三十度酵母表達， 這樣可以考慮將紗布減少到 35 層，同時需要注意的是 搖瓶內(nèi)菌液體積不要超過 10-30%。8.8 取樣 SDS-PAGE分析問題樣品不一定要 1 煮過凍存，但應避免反復凍融， 最好分裝保存。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分 子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說 明書講解得詳細），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護物質(zhì)，競爭性抑制蛋白水 解酶的活性來防止表達產(chǎn)物降解。8.9 樣品濃縮問題分泌型培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度低， PAGE膠一般 是檢測不出來的（除非你的表達蛋白量非常大） 。濃縮方法有 TC

16、A法，硫酸氨 鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等。 另外跑膠的時候同時對照酵母胞內(nèi)蛋白， 以防沒有分泌出來。如果小到 20kD 以下，可以考慮用 tricine 膠8.10 樣品純化問題如果選用的載體是帶有信號肽的，分泌表達好純化，但實 際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，最后表達 過程需要用 Western blot 或者 Elasa，通常都是用 WB。如果本身蛋白沒有合 適抗體（如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系 統(tǒng)表達出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用） ，可以選用 anti-myc 或者 anti-his 的， 前提當然是你的蛋白沒有提前終止。8.11 分泌表達問題蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出