1、第12章 分子育種 12.1 分子育種12.1 植物分子育種概述12.1.1 植物分子育種的含義 是以植物基因工程育種和分子標(biāo)記輔助選擇為主要技術(shù)，在經(jīng)典遺傳學(xué)和現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)理論的指導(dǎo)下，將現(xiàn)代生物技術(shù)手段整合于經(jīng)典遺傳育種方法中，結(jié)合表現(xiàn)型和基因型篩選，培育植物優(yōu)良新品種的方法。 植物基因工程育種：也稱為轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)，即利用DNA重組技術(shù)，把經(jīng)過分離或人工構(gòu)建的目的基因通過適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)基因方法插入到植物基因組中，使該基因得到表達(dá)并能遺傳至后代的技術(shù)體系。通過外源基因?qū)胧怪系街参锘蚪M上，可以使之最終表達(dá)為觀賞性狀從而創(chuàng)造植物新品種。12.1.2 分子育種特點：1 分子生物學(xué)

2、研究表明，所有生物都有共同的遺傳密碼，這使人類、動植物和微生物之間的基因交流成為可能，為創(chuàng)造新品種開拓了廣闊的前景。2 遺傳性的改變完全根據(jù)人類的目的和有計劃的控制之下，因而可定向地改造生物，甚至創(chuàng)造全新的生物類型。3 由于直接操作遺傳物質(zhì)，育種速度大大加快，避免雜交育種后代分離和多代自交、重復(fù)選擇等，在短時間內(nèi)可穩(wěn)定形成新品種新類型。4 能改變觀賞植物的單一性狀，而其它性狀保持不變。吊 蘭石 蒜石 斛 蘭 基因工程的作用（1）抗病基因工程(2) 抗蟲基因工程（3）抗除草劑基因工程（4）抗逆境基因工程（5）提高果實耐貯性和切花壽命基因工程12.2 園林植物基因工程育種：基本步驟基因工程的基本步

3、驟 第一步：分離和克隆目的基因 第二步：植物表達(dá)載體的構(gòu)建 第三步：植物的遺傳轉(zhuǎn)化 第四步：轉(zhuǎn)基因植株的檢測與鑒定12.2.1 DNA重組技術(shù)相關(guān)概念 NDA克隆：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外把外源DNA片段與載體DNA分子連接，形成具有自我復(fù)制能力的DNA分子，繼而使之轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有外源片段的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在進(jìn)行繁殖擴(kuò)增，獲得大量含有同樣序列的DNA分子，這一過程即為DNA分子克隆，也稱為DNA重組技術(shù)。 工具酶： 1 限制性核酸內(nèi)切酶 2 DNA連接酶 3 DNA多聚酶 4 DNA末端轉(zhuǎn)移酶 5 逆轉(zhuǎn)錄酶 目的基因：指能夠表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的DNA片段。 載體：指能和目的基因連接的DN

4、A分子。12.2.2 獲得目的基因的主要方法 利用探針在基因組文庫或cDNA文庫中獲得已知基因 利用基因的差異表達(dá)獲得未知功能的基因 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法及T-DNA插入突變法 圖譜克隆法金 魚 草香 石 竹矮 牽 牛薔 薇12.2.3 植物基因工程的質(zhì)粒分子及其構(gòu)建 質(zhì)粒：將外源目的基因?qū)胫参矬w的DNA分子。包括：載體、目的片段和報告基因。12.2.4 建立植物再生體系的途徑 愈傷組織再生系統(tǒng) 不定芽發(fā)育再生系統(tǒng) 直接分化再生系統(tǒng) 體細(xì)胞胚狀體再生系統(tǒng) 原生質(zhì)體再生系統(tǒng)12.2.5 植物遺傳轉(zhuǎn)化體系 生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法 其他載體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 DNA直接導(dǎo)入技術(shù)12.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 要有

5、嚴(yán)格的對照實驗結(jié)果。 要提供轉(zhuǎn)化當(dāng)代外源基因整合和表達(dá)的分子生物學(xué)證據(jù)，物理數(shù)據(jù)與表型分析。 提供外源基因控制的表型性狀證據(jù)。無性繁殖作物有繁殖一代穩(wěn)定遺傳的證據(jù)。 根據(jù)該植物的繁殖方式提供遺傳證據(jù)。 對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上的報告基因進(jìn)行檢測的證據(jù)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 1：DL2000 DNA ladder；2：陰性對照，其它為不同的轉(zhuǎn)基因品系：陰性對照，其它為不同的轉(zhuǎn)基因品系Note:1:DL2000 DNA ladder ;2:Negative control;3-13:others:Transformed Plants圖圖4-4轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)PutSOD基因擬南芥

6、基因擬南芥PCR部分鑒定結(jié)果部分鑒定結(jié)果Fig4-4 PCR results of SOD gene from transformed Arabidopsis thaliana 12.2.7 轉(zhuǎn)基因植物的田間釋放及其安全性12.2.7.1轉(zhuǎn)基因植物釋放的風(fēng)險性 它本身或者使其他雜草的生長變得難以控制； 通過基因在物種間的橫向漂移而破壞生態(tài)平衡。12.2.7.2 轉(zhuǎn)基因植物的安全性評價 轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性 轉(zhuǎn)基因食品的安全性 轉(zhuǎn)基因園林植物的安全性12.3 分子標(biāo)記及其在育種中的作用12.3.1 分子標(biāo)記的種類及其原理和方法分子標(biāo)記輔助育種：借助于目標(biāo)基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記的基因型分析，鑒定

7、分離群體中 含有目標(biāo)基因的個體，以提高選擇的效率，即采用標(biāo)記輔助選擇手段，減少育種過程中的盲目性，從而加速育種的進(jìn)程。1 RFLP標(biāo)記：用已知的限制性內(nèi)切酶消化目標(biāo)DNA，電泳印跡，再用DNA探針雜交并放射自顯影，從而得到與探針同源的DNA序列酶切后在長度上的差異。2 RAPD標(biāo)記：以PCR為基礎(chǔ)，利用9-10bp的隨機(jī)脫氧核糖核酸序列為引物，以所研究的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后用染色或放射性自顯影途徑來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性。3 AFLP標(biāo)記：AFLP標(biāo)記的基本原理是用兩種不同限制性內(nèi)切酶將生物體基因組進(jìn)行酶切，產(chǎn)生不同大小的酶切片段，在給這些酶切片段兩端連接上已知序列的接頭，然后用大約含20個堿基的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于不同材料的DNA酶切片段存在差異，因而產(chǎn)生了擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。4 SSR標(biāo)記：利用真核生物的基因組中普遍存在著二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸的簡單串聯(lián)重復(fù)特性作為分子標(biāo)記的，重復(fù)序列的兩側(cè)往往有一小段保守的序列，根據(jù)重復(fù)序列兩測保守序列設(shè)計特異引物進(jìn)行P