1、會計學(xué)1結(jié)核病細菌學(xué)檢驗的標(biāo)準(zhǔn)化與新技術(shù)進結(jié)核病細菌學(xué)檢驗的標(biāo)準(zhǔn)化與新技術(shù)進展海淀展海淀涂涂痰痰膜膜自自然然干干燥燥復(fù)復(fù)紅紅加加熱熱初初染染5 5分分鐘鐘自自然然干干燥燥鏡鏡檢檢流流水水沖沖洗洗美美蘭蘭復(fù)復(fù)染染3030秒秒鹽鹽酸酸酒酒精精脫脫色色流流水水沖沖洗洗流流水水沖沖洗洗（一）新載玻片必須經(jīng)（一）新載玻片必須經(jīng)95%95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后乙醇脫脂，檢查無劃痕后 方可使用。方可使用。（二）一張載玻片只能涂抹（二）一張載玻片只能涂抹1 1份痰標(biāo)本。份痰標(biāo)本。（三）載玻片只允許一次性使用，嚴禁清洗后重復(fù)用于（三）載玻片只允許一次性使用，嚴禁清洗后重復(fù)用于AFBAFB檢查。檢查。（四）載玻

2、片正面一側(cè)（四）載玻片正面一側(cè)1/31/3處標(biāo)注實驗室序號處標(biāo)注實驗室序號( (如使用的如使用的載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用編號；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B2B鉛筆在磨砂面上直接書寫鉛筆在磨砂面上直接書寫) )。（五）載玻片正面另一側(cè)（五）載玻片正面另一側(cè)2/32/3中央處均勻涂抹成面積為中央處均勻涂抹成面積為101020 mm20 mm的卵圓形痰膜。的卵圓形痰膜。 （一）嚴格按照操作規(guī)范完成染色程序。（一）嚴格按照操作規(guī)范完成染色程序。（二）染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍色，無紅（二）染色后的痰

3、膜應(yīng)呈均勻亮藍色，無紅色斑塊。色斑塊。（三）將染色后的玻片放置在報紙上，如果（三）將染色后的玻片放置在報紙上，如果透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。（四）染色后的痰膜脫落部分應(yīng)小于整個涂（四）染色后的痰膜脫落部分應(yīng)小于整個涂抹面積的抹面積的10%10%。 （一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡（一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。頭直接接觸玻片上的痰膜。（二）仔細觀察（二）仔細觀察300300以上的視野。以上的視野。（三）每個工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀（三）每個

4、工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應(yīng)超過量一般不應(yīng)超過2525張。張。（四）連續(xù)閱讀（四）連續(xù)閱讀10101212張玻片后，應(yīng)休息張玻片后，應(yīng)休息2020分分鐘左右。鐘左右。鏡檢讀片鏡檢讀片上一年陰性上一年陰性玻片的總數(shù)玻片的總數(shù) 玻片陽性率玻片陽性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%300185 129 101 80 67 59 50 400217 143 108 86 70 61 51 500243 154 114 89 71 62 52 700281 167 121 92 75 65 54 1000318 180 128 96 76 66 55 2000

5、376 197 135 100 79 68 56 5000423 208 141 103 80 69 57 10000441 213 142 104 80 69 5720000450 215 143 104 82 69 57誤差類型誤差類型 可能原因可能原因 建議建議 假陽性假陽性（FPFP） 1)1)例如染料沉渣或結(jié)晶等被誤識為抗酸例如染料沉渣或結(jié)晶等被誤識為抗酸桿菌桿菌2)2)原始報告后著色的抗酸桿菌退色原始報告后著色的抗酸桿菌退色1 1）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)。）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)。2 2）對假陽性玻片重新染）對假陽性玻片重新染色并復(fù)檢。色并復(fù)檢。 假陰性假陰性（FNFN） 1 1）觀察玻片的視野數(shù)

6、量不足）觀察玻片的視野數(shù)量不足2 2）鏡檢技術(shù)能力差）鏡檢技術(shù)能力差3 3）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、背景對比不足或過高）背景對比不足或過高）4 4）顯微鏡存在問題）顯微鏡存在問題5 5）染液質(zhì)量差）染液質(zhì)量差 1 1、2 2、3 3）對技術(shù)人員復(fù)）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)訓(xùn)4 4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)狀態(tài)5 5）重新購置質(zhì)量合格的）重新購置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液染料并重新配制染液 量化誤差量化誤差（QEQE） 1 1）觀察玻片視野數(shù)量不足）觀察玻片視野數(shù)量不足2 2）陽性玻片的分級報告標(biāo)準(zhǔn)掌握差）陽性玻片的分級報告標(biāo)準(zhǔn)掌握差3 3

7、）鏡檢技術(shù)能力差）鏡檢技術(shù)能力差4 4）顯微鏡存在問題）顯微鏡存在問題 1.2.31.2.3）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)）對技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4 4）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作）現(xiàn)場檢查顯微鏡工作狀態(tài)狀態(tài) LAMP 方法方法PURE 方法方法等溫反應(yīng)高擴增效率高特異性實驗周期短(幾乎一個小時)簡單去除核酸擴增抑制因子縮短處理時間Pre-treatment kitLAMP testSampleLysisMixtureFilterDNA陰性陽性不需要離心, 等溫, 快速 (整個過程只需一個小時)；DNA與SYBR Green結(jié)合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個小時內(nèi)可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500-1

8、00拷貝/毫升）的DNA 或RNA擴增到10微克左右。 101001000NCcopies/reaction模板: 純化的 TB 基因組DNA反應(yīng)條件: 67, 40min儀器特點：1.LAMP檢測專用，每隔6秒測定反應(yīng)產(chǎn)物的濁度2.可以設(shè)定相應(yīng)的反應(yīng)條件與檢測要求3.測定結(jié)果可直接輸入電腦進行實時分析 4.檢測結(jié)果（圖像等）可以打印5.可同時檢測32個樣本，聯(lián)管適用TwinCubator 手工雜交儀GT-Blot48 或 GT-Blot 20GenoType MTBDRplus結(jié)果結(jié)果MTBC及其對利福平和/或異煙肼的耐藥性 適用于培養(yǎng)物和痰液。 檢測快速，對于直接采集的樣本或陽性培養(yǎng)物在數(shù)

9、小時后內(nèi)即可完成檢測； 檢測INH單耐藥型TB、MDR和XDR； 符合WHO推薦的線性探針分析標(biāo)準(zhǔn)。GenoType MTBDRplus/sl 優(yōu)點優(yōu)點產(chǎn)品產(chǎn)品目的目的材料材料靶點靶點敏感性敏感性 專屬性專屬性 對照方法對照方法 *GenoTypeGenoType Mycobacterium Mycobacterium CMCM普通分支桿菌的鑒定普通分支桿菌的鑒定陽性的固體陽性的固體/液體培養(yǎng)物液體培養(yǎng)物DNA97 %93,5 %測序；測序；生化技術(shù)生化技術(shù)GenoTypeGenoType Mycobacterium Mycobacterium ASAS其他菌種的鑒定其他菌種的鑒定陽性的固體陽

10、性的固體/液體培養(yǎng)物液體培養(yǎng)物DNA96 %94 %測序；測序；生化技術(shù)生化技術(shù)GenoTypeGenoType MTBCMTBC結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的菌種區(qū)分菌種區(qū)分陽性的固體陽性的固體/液體培養(yǎng)物液體培養(yǎng)物DNA100 %100 % 生化技術(shù)；生化技術(shù)；分子遺傳學(xué)方分子遺傳學(xué)方法法GenoTypeGenoType MTBDRMTBDRplusplus結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對利福平和鑒定及其對利福平和/或或異煙肼的耐藥性異煙肼的耐藥性直接采集的直接采集的標(biāo)本（顯微標(biāo)本（顯微鏡檢查陽性，鏡檢查陽性，經(jīng)過純化）；經(jīng)過純化）；陽性的陽性的固體固體/液體培

11、養(yǎng)物液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標(biāo)直接采集的標(biāo)本本RMP: 96,8 %INH: 90,2 %固體固體/液體培液體培養(yǎng)物養(yǎng)物RMP: 98,7 %INH: 92 %直接采集的標(biāo)直接采集的標(biāo)本本RMP: 95%INH: 100 %固體固體/液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)物物RMP: 100 %INH: 100 %傳統(tǒng)的藥敏試傳統(tǒng)的藥敏試驗驗 (DST)DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復(fù)合群的區(qū)分和藥敏試驗。所有檢測都采用通用試劑盒和相同的方案進行擴增和雜交。 所有檢測均可在4-5小時內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測（每天檢測數(shù)百份樣品）。1、痰液加入處理瓶， 放置15分鐘。2、取處理后的

12、痰液 2mL加入Xpert反應(yīng) 試劑盒3、將反應(yīng)試劑盒放入 GeneXpert儀器， 點擊“開始”（手工操作至此結(jié)束！手工操作至此結(jié)束！）4、自動過濾洗滌樣品5、自動超聲破碎，純化 樣品6、熒光定量PCR擴增7、巢氏PCR擴增8、自動結(jié)果判讀 （MTB/RIF）無需專業(yè)技術(shù)人員和特殊實驗室研究人數(shù)研究人數(shù) 1,700 Patients 秘秘魯魯、南非、阿塞拜疆、印度、南非、阿塞拜疆、印度 涂片陽性樣品：涂片陽性樣品： 靈敏性靈敏性98.2%,特異性特異性99.2% 涂片陰性涂片陰性, 培養(yǎng)陽性樣品：培養(yǎng)陽性樣品： 三次檢測靈敏性三次檢測靈敏性 90.2% 一次檢測靈敏性一次檢測靈敏性72.5%

13、 對利福平耐藥性檢測：對利福平耐藥性檢測： 靈敏性靈敏性97.6%,特異性特異性98.1%在在MTBMTB潛伏感染診斷中的應(yīng)用潛伏感染診斷中的應(yīng)用 早期診斷MTB潛伏感染對控制結(jié)核病意義重大。目前診斷MTB潛伏感染仍沿用100年來使用的 TST，但 TST不能區(qū)分MTB感染患者和接種BCG的健康人以及感染環(huán)境中的分枝桿菌患者。 Lalvani在土耳其檢查了暴露于肺結(jié)核家庭環(huán)境中的908名健康兒童。皮試結(jié)果表明580名兒童患有潛伏性肺結(jié)核,需要進行藥物治療,以免轉(zhuǎn)化為活動性肺結(jié)核;而ELISPOT結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有380名兒童患有潛伏性肺結(jié)核。通過ELISPOT檢測,只需要治療380名兒童,而不是58

14、0名,但卻能夠預(yù)防同樣數(shù)量的活動性肺結(jié)核病例發(fā)生。因此，ELISPOT 比TST篩選結(jié)核潛伏感染更有效,而且ELISPOT檢測結(jié)果與MTB的接觸程度相關(guān)性更強。 (1)靈敏、特異，能從100萬個細胞中測出1個分泌INF細胞；只有MTB和少數(shù)非結(jié)核分枝桿菌才會出現(xiàn)陽性反應(yīng)，而BCG及多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌因不分泌ESAT-6和CFP-10蛋白，因此本法能區(qū)別BCG接種出現(xiàn)的陽性反應(yīng)。 (2)快速：能早期診斷結(jié)核感染，檢測全過程2天。 (3)應(yīng)用面廣：在肺結(jié)核、肺外結(jié)核及免疫抑制的結(jié)核患者均能檢測。 (4)療效評估：當(dāng)結(jié)核菌被消滅后，效應(yīng)T淋巴細胞即消失，測定效應(yīng)T淋巴細胞也可檢測機體是否清除了結(jié)核菌，進行臨床療效評估 。 細胞培養(yǎng)及抗原刺激時,有發(fā)生細菌污染的可能,以致實驗失敗; 實驗過程步驟較多,實驗人員需有一定的理論基礎(chǔ)并經(jīng)多次操作的培訓(xùn)方能勝任; 目前試劑價格比較昂