1、第三章第三章 植植 物物 組組 織織 培培 養(yǎng)養(yǎng) 基基 本本 技技 術(shù)術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分組織培養(yǎng)所需的環(huán)境條件及營養(yǎng)成分第三節(jié)第三節(jié) 培養(yǎng)基的配制與滅菌培養(yǎng)基的配制與滅菌第四節(jié)第四節(jié) 外植體的種類外植體的種類第五節(jié)第五節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng)外植體的接種和培養(yǎng)第六節(jié)第六節(jié)試管苗的馴化和移栽試管苗的馴化和移栽 組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局的總體要求u便于隔離u便于操作u便于滅菌u便于觀察第一節(jié)第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及基本技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室輔助實(shí)驗(yàn)室一、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)室組成室組成準(zhǔn)備室準(zhǔn)備室緩沖室

2、緩沖室無菌操作室無菌操作室培養(yǎng)室培養(yǎng)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室溫溫 室室生化分析實(shí)驗(yàn)室生化分析實(shí)驗(yàn)室基本實(shí)驗(yàn)室布局平面圖實(shí)驗(yàn)臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準(zhǔn)備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室組織培養(yǎng)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室緩沖室培養(yǎng)室無菌室（一）無菌室（二）二、儀器設(shè)備1、基本儀器設(shè)備 冰箱、電（磁）爐、冰箱、電（磁）爐、酸度計(jì)酸度計(jì)、純、純水器、水器、天平天平、移液器、解剖鏡、光照、移液器、解剖鏡、光照培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基培養(yǎng)箱、搖床、生化培養(yǎng)箱、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。分裝器、攪拌器等。冰箱酸度計(jì)電爐天平純水器培

3、養(yǎng)基分裝器攪拌器2、滅菌設(shè)備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋干熱消毒柜無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器3、無菌操作設(shè)備 超凈工作臺無菌接種箱4、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備 搖 床培養(yǎng)架HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱 150C 250D 光照培養(yǎng)箱 5、細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備 光學(xué)顯微鏡、體視顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學(xué)顯微鏡1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實(shí)驗(yàn)用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶2、金屬材質(zhì)用具、金屬材質(zhì)用具鑷子 解剖刀接種針?biāo)摹⑾礈旒夹g(shù)1、玻璃器皿洗滌、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開即

4、用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用3、金屬用品洗滌熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干五、滅菌技術(shù)五、滅菌技術(shù)u物理方法：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、過濾除菌等u化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌1、滅菌方法、滅菌方法2、滅菌、滅菌（1）培養(yǎng)基滅菌：）培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法高溫高壓濕熱滅菌法 壓力在壓力在9.810410.8104Pa 溫度在溫度在121 滅菌滅菌2030min（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌 干熱消毒滅菌干熱消毒滅菌飽和蒸汽壓力與其對應(yīng)的溫度飽和蒸汽壓力飽和蒸汽壓力溫度（溫度（）飽和蒸

5、汽壓力飽和蒸汽壓力溫度（溫度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.6（3）塑料器皿滅菌：塑料器皿滅菌： 多采用多采用高壓蒸汽消毒滅菌高壓蒸汽消毒滅菌（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌）金屬用具滅菌：灼燒滅菌 浸入浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷

6、酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用卻后使用（5）接種室滅菌）接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射（6）外植體滅菌流水沖洗流水沖洗1020min或更長時(shí)間或更長時(shí)間70%75%酒精中浸泡酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞氯化汞液中浸泡液中浸泡10min左右左右蒸餾水沖洗蒸餾水沖洗4-5次次在在10%的次氯酸鈉的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡、飽和漂白粉浸泡30min左右左右備用備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑消毒劑使用濃度使用濃度（%）去除難易去除難易消毒時(shí)間消毒時(shí)間（min）效果效果次氯酸鈣次氯酸鈣次氯酸鈉次氯酸鈉漂白粉漂白粉溴水溴

7、水過氧化氫過氧化氫升汞升汞酒精酒精抗生素抗生素硝酸銀硝酸銀9102飽和溶液飽和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易易易易易最易最易較難較難易易中中較難較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好很好很好很好很好好好最好最好好好較好較好好好六、無菌操作六、無菌操作實(shí)驗(yàn)員消毒實(shí)驗(yàn)室、無菌臺滅菌實(shí)驗(yàn)器材的滅菌無菌接種消 毒實(shí)驗(yàn)臺衛(wèi)生培養(yǎng)室培養(yǎng)1、消毒，更換實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接、消毒，更換實(shí)驗(yàn)服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。種室。2、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，、打開超凈工作臺和無菌操作室的紫外燈，照射照射40min左右，后關(guān)閉。左右，后

8、關(guān)閉。3、開啟過濾室風(fēng)機(jī)，使無菌風(fēng)吹拂工作臺面、開啟過濾室風(fēng)機(jī)，使無菌風(fēng)吹拂工作臺面和四周的臺壁。和四周的臺壁。4、用、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手。的酒精擦拭工作臺和雙手。5、用沾有、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進(jìn)工作臺?；呐囵B(yǎng)器皿，放進(jìn)工作臺。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。、在酒精燈火焰附近切割備用的接種材料。8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶、打開瓶口，用火焰燒瓶

9、口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各部分都燒到。口各部分都燒到。9、取下接種器械，在火焰上消毒。、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。11、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺。注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%70%75%75%的酒精擦拭工的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%95%的酒精中浸泡的酒精中浸泡和在火焰上消毒。和在火焰上消毒。第二節(jié)第二節(jié)培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù)培養(yǎng)基的成分與配制技術(shù) 一、環(huán)境條件一、環(huán)境條件 與自然條件一樣，組織培養(yǎng)中的外植體的生與自然

10、條件一樣，組織培養(yǎng)中的外植體的生長要受到長要受到溫度、光照、濕度溫度、光照、濕度等各種物理?xiàng)l件，不同等各種物理?xiàng)l件，不同氣體、培養(yǎng)基氣體、培養(yǎng)基的組成、的組成、pHpH值值和和滲透壓滲透壓等各種化學(xué)條等各種化學(xué)條件，以及件，以及外植體部位、大小、細(xì)胞密度外植體部位、大小、細(xì)胞密度等各種生物等各種生物條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件等環(huán)境條件的影響。如何根據(jù)需要來控制培養(yǎng)條件是組織培養(yǎng)中的一個(gè)重要問題。條件是組織培養(yǎng)中的一個(gè)重要問題。溫度溫度光照光照濕度濕度氣體氣體滲透壓滲透壓pH值值一般最適溫度在一般最適溫度在252之間之間環(huán)境條件環(huán)境條件最常用的是最常用的是光照光照16h，黑

11、暗，黑暗8h 一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應(yīng)達(dá)一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應(yīng)達(dá)100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%80% 氧氣氧氣是愈傷組織生長所必需的是愈傷組織生長所必需的 調(diào)節(jié)滲透壓常常從調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖糖入手入手 培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的pHpH值大多在值大多在5.06.55.06.5，5.85.8二、營養(yǎng)成分二、營養(yǎng)成分 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：u組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；質(zhì)；

12、u構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；代謝；u元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡點(diǎn)等化學(xué)方面的作用；穩(wěn)定、電荷平衡點(diǎn)等化學(xué)方面的作用；u發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成?？?、器官建成。Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn):阿隆和斯托德 A A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史生活史; ;B B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，

13、且這種缺、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補(bǔ)充該元素來預(yù)防和恢復(fù)素癥可以用補(bǔ)充該元素來預(yù)防和恢復(fù); ;C C、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而、該元素在植物營養(yǎng)生理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果產(chǎn)生的間接效果。 國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有1616（1717）種：）種： C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S、FeFe、B B、MnMn、CuCu、ZnZn、MoMo、ClCl、（、（NiNi）

14、在植物中含量差別很大，同一元素在植在植物中含量差別很大，同一元素在植物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。物不同時(shí)期、不同條件下含量也不同。根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%0.1%以上；以上； C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等等9 9種種微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%0.1%以下以下有的只含有的只含0.1mg/kg0.1mg/kg Fe Fe、B B、MnMn、CuCu、ZnZn、MoMo、ClCl等等7 7種種按

15、照國際植物生理協(xié)會的建議：按照國際植物生理協(xié)會的建議： 所需濃度所需濃度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素為大量元素的元素為大量元素 所需濃度所需濃度 0.5mmol/L 0.5mmol/L的元素為微量元素的元素為微量元素uN N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。動中占有重要的位置。 uP P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KHKH2 2POPO4 4 NaHNaH2 2POPO4 4等。等。 uK K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)

16、移，以及氮素代謝對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。等有密切關(guān)系。1、大量元素、大量元素uMgMg、S S、CaCa是葉綠素的組成成分，又是激酶是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；uS S是含是含S S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。uCaCa是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對細(xì)胞分裂，穩(wěn)定是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，CaCa及鈣調(diào)素在細(xì)及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。2、微量元素、微量元素 在微量元素中，在微量元素中

17、，鐵鐵的使用最大：的使用最大： 一些氧化酶的組成成分一些氧化酶的組成成分 葉綠素形成的必要條件葉綠素形成的必要條件 使用乙二胺四乙酸鐵（使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-FeEDTA-Fe）鰲合）鰲合物防止鐵的沉淀物防止鐵的沉淀u 硼硼與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著密切的關(guān)系。與蛋白質(zhì)合成、糖類運(yùn)輸有著密切的關(guān)系。u 銅銅是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生是某些氧化酶的成分，能夠促進(jìn)離體根的生長。長。u 錳錳參與植物的光合、呼吸代謝。參與植物的光合、呼吸代謝。u 鉬鉬參與氮素的代謝。參與氮素的代謝。u 氯氯是光合作用水光解的活化劑。是光合作用水光解的活化劑。u 微量元素的主要作用是作為微量元素的主

18、要作用是作為酶的輔助因子或酶的輔助因子或激活劑激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。參與代謝的調(diào)節(jié)。 缺鐵癥狀缺鐵癥狀：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉：葉面呈綠色網(wǎng)紋狀失綠。隨病勢發(fā)展，葉片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引片失綠程度加重，出現(xiàn)整葉變?yōu)榘咨?，葉緣枯焦，引起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。起落葉。嚴(yán)重缺鐵時(shí)，新梢頂端枯死。 桃樹缺銅癥狀：缺銅癥狀：u 新梢頂端葉片的葉尖失綠變新梢頂端葉片的葉尖失綠變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變黃，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)至擴(kuò)大變成深褐色，引起落葉。成深褐色，引起落葉。u枝頂端生長不良，其下部的芽枝頂端生長不良，其下部的芽開始生長，形成叢生的細(xì)枝。開始生長

19、，形成叢生的細(xì)枝。 菊花缺錳癥狀：缺錳癥狀： 葉脈間失綠褪色，但葉脈間失綠褪色，但葉脈仍保持綠色，脈間葉脈仍保持綠色，脈間出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀出現(xiàn)壞死斑，缺素癥狀由幼葉開始。由幼葉開始。 菜豆梨缺錳癥梨缺錳癥缺鉬癥狀：缺鉬癥狀：葉較小，葉脈間失綠葉較小，葉脈間失綠,有壞死斑點(diǎn)，且葉邊有壞死斑點(diǎn)，且葉邊緣焦枯，向內(nèi)卷曲。緣焦枯，向內(nèi)卷曲。十字花科植物缺鉬時(shí)十字花科植物缺鉬時(shí)葉片卷曲畸形，老葉葉片卷曲畸形，老葉變厚且枯焦。變厚且枯焦。 白菜缺硼癥狀：缺硼癥狀：u受精不良，籽粒減少受精不良，籽粒減少 ，“花而不實(shí)花而不實(shí)”， “ “蕾而不蕾而不花花”；u根尖、莖尖的生長點(diǎn)停止根尖、莖尖的生長點(diǎn)停止生

20、長，而形成簇生狀；生長，而形成簇生狀；u常引起各種腐爛病。常引起各種腐爛病。 馬鈴薯缺鋅癥狀：缺鋅癥狀： 小葉病，葉片變小葉病，葉片變小，兩節(jié)之間縮小，兩節(jié)之間縮短。葉脈間失去短。葉脈間失去綠色或者變白。綠色或者變白。植物缺素癥植物缺素癥u缺氮缺氮：首先表現(xiàn)在老葉上均一的缺綠現(xiàn)象；：首先表現(xiàn)在老葉上均一的缺綠現(xiàn)象；u缺磷缺磷：老葉片發(fā)藍(lán)稍帶紫色，葉緣變?yōu)樽霞t色，：老葉片發(fā)藍(lán)稍帶紫色，葉緣變?yōu)樽霞t色，葉尖枯死；葉尖枯死；u缺鉀：缺鉀：先表現(xiàn)在老葉斑駁的缺綠癥狀葉緣枯黃，先表現(xiàn)在老葉斑駁的缺綠癥狀葉緣枯黃，卷曲皺縮，莖的節(jié)間變短；卷曲皺縮，莖的節(jié)間變短；u缺鈣缺鈣：新葉葉片變小、枯死，即干燒心；：

21、新葉葉片變小、枯死，即干燒心；u缺硫缺硫：首先表現(xiàn)為新葉葉片缺綠或發(fā)紫；：首先表現(xiàn)為新葉葉片缺綠或發(fā)紫；u缺錳缺錳：新葉脈間失綠；：新葉脈間失綠；u缺鐵缺鐵：葉片黃，葉脈綠；：葉片黃，葉脈綠；u缺硼缺硼：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，：頂呀和附近的嫩葉變黑壞死，生長矮化，叢枝；叢枝；u缺鋅缺鋅：老葉脈間缺綠，出現(xiàn)白色壞死斑；：老葉脈間缺綠，出現(xiàn)白色壞死斑；u缺銅缺銅：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴(yán)重整葉：新葉上由葉尖沿葉緣逐漸壞死，嚴(yán)重整葉萎蔫過早脫落；萎蔫過早脫落；u缺鉬缺鉬：不能形成花器或花早落。：不能形成花器或花早落。 青島農(nóng)業(yè)青島農(nóng)業(yè)大大學(xué)學(xué)海洋科海洋科學(xué)與學(xué)與工程工程學(xué)學(xué)院院3

22、、碳源、碳源 碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機(jī)酸，以酸，以糖類糖類物質(zhì)最重要。物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點(diǎn)：糖類物質(zhì)特點(diǎn)： 具有遇熱易變具有遇熱易變 利于吸收和利用利于吸收和利用 使用濃度一般在使用濃度一般在2%-5%2%-5% 提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓 4、維生素類、維生素類 以各種以各種輔酶輔酶的形式存在的形式存在 參與多種代謝活動參與多種代謝活動 對生長，分化等有很好的促進(jìn)作用對生長，分化等有很好的促進(jìn)作用 主要分為主要分為脂溶性維生素脂溶性維生素和和水溶性維生素水溶性維生素 常用維生素有常用維生素有V VB1B1和和V VB6B6

23、5、肌醇、肌醇 環(huán)己六醇環(huán)己六醇 細(xì)胞壁的構(gòu)建材料細(xì)胞壁的構(gòu)建材料 參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動生理活動 促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用蛋白質(zhì)的組成成分蛋白質(zhì)的組成成分 有機(jī)氮源有機(jī)氮源 可直接被細(xì)胞吸收利用可直接被細(xì)胞吸收利用培養(yǎng)基中常用的是培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸甘氨酸6、氨基酸、氨基酸促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長促進(jìn)某些愈傷組織和器官的生長 化學(xué)成分不明、復(fù)雜化學(xué)成分不明、復(fù)雜 天然營養(yǎng)混合物天然營養(yǎng)混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物7、天然復(fù)合物、天然復(fù)合物8、瓊脂、瓊脂 是使用最普

24、遍的凝固劑是使用最普遍的凝固劑用量一般在用量一般在6-10g/L6-10g/L之間之間顏色以淺、透明度高的好，潔凈為上品顏色以淺、透明度高的好，潔凈為上品 除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使除了瓊脂外，在組織培養(yǎng)中還可以使用卡拉膠、瓊脂糖、結(jié)冷膠等。用卡拉膠、瓊脂糖、結(jié)冷膠等。9、活性炭、活性炭 吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分吸附培養(yǎng)基及培養(yǎng)物分泌物中的抑制物質(zhì)泌物中的抑制物質(zhì) 抑制外植體褐變抑制外植體褐變 防止玻璃苗的產(chǎn)生防止玻璃苗的產(chǎn)生 促進(jìn)培養(yǎng)物生長和分化促進(jìn)培養(yǎng)物生長和分化 促進(jìn)生根促進(jìn)生根10、抗生素、抗生素 防止外植體內(nèi)生菌造成防止外植體內(nèi)生菌造成的污染的污染活性炭促進(jìn)細(xì)胞伸長和分裂促進(jìn)細(xì)胞伸

25、長和分裂 促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、促進(jìn)生根、抑制器官脫落、性別控制、延長休眠、頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實(shí)頂端優(yōu)勢、單性結(jié)實(shí) 誘導(dǎo)愈傷組織形成誘導(dǎo)愈傷組織形成 溶于溶于95%95%酒精或酒精或0.1mol/L0.1mol/L的的NaOHNaOH中，后者的溶解效中，后者的溶解效果更好果更好 常用的生長素：常用的生長素： IAA(IAA(吲哆乙酸吲哆乙酸) ) NAA ( NAA (奈乙酸奈乙酸 ) ) 2,4-D( 2,4-D(二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸) ) IBA( IBA(吲哆丁酸吲哆丁酸) )1111、生長素類、生長素類 促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化 誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的

26、形成誘導(dǎo)胚狀體和不定芽的形成 延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成延緩組織的衰老并增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成 用于離體成花的調(diào)控用于離體成花的調(diào)控 溶于溶于0.5-1.0mol/L0.5-1.0mol/L的鹽酸或稀薄的的鹽酸或稀薄的NaOHNaOH中中 常用的細(xì)胞分裂素：常用的細(xì)胞分裂素： KT (KT (激動素激動素) ) BA(6- BA(6-卞基腺嘌呤卞基腺嘌呤) ) 2-ip( 2-ip(異戊烯氨基嘌呤異戊烯氨基嘌呤) )玉米素玉米素12、細(xì)胞分裂素類 A、赤霉素類、赤霉素類 組織培養(yǎng)中不常使用組織培養(yǎng)中不常使用 加速細(xì)胞的伸長生長加速細(xì)胞的伸長生長 促進(jìn)細(xì)胞的分裂促進(jìn)細(xì)胞的分裂 主要是主要是GAG

27、A3 3 B B、 抑制細(xì)胞分裂和伸長抑制細(xì)胞分裂和伸長 促進(jìn)脫落和衰老促進(jìn)脫落和衰老 促進(jìn)休眠和提高抗逆能力促進(jìn)休眠和提高抗逆能力13、赤霉素類和脫落酸培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基形態(tài)不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)過程不同：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基其作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基營養(yǎng)水平不同：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基一、培養(yǎng)基的種類一、培養(yǎng)基的種類第三節(jié) 培養(yǎng)基滅菌技術(shù)及培養(yǎng)條件1 1、MSMS培養(yǎng)基培養(yǎng)基 無機(jī)鹽濃度高無機(jī)鹽濃度高 高含量的氮、

28、鉀，尤其是硝酸鹽高含量的氮、鉀，尤其是硝酸鹽 含有一定數(shù)量的銨鹽含有一定數(shù)量的銨鹽 營養(yǎng)豐富營養(yǎng)豐富 不需要添加更多的有機(jī)附加物不需要添加更多的有機(jī)附加物二、幾種常見培養(yǎng)基的特點(diǎn)二、幾種常見培養(yǎng)基的特點(diǎn)2 2、WhiteWhite培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19431943年由年由WhiteWhite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)。為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)。 19631963年作了改良，提高年作了改良，提高M(jìn)gSOMgSO4 4的濃度和增的濃度和增加硼元素加硼元素 無機(jī)鹽濃度較低無機(jī)鹽濃度較低 使用廣泛使用廣泛 在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果。在生根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)中有良好的效果。大量元素大量元素含含量量微量元素微量元

29、素含含量量鐵鹽鐵鹽含量含量有機(jī)物有機(jī)物含含量量其他其他含量含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇肌醇100蔗糖蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0煙酸煙酸0.3瓊脂瓊脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0鹽酸硫鹽酸硫胺素胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001鹽酸吡鹽酸吡哆辛哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸甘氨酸3Na2SO4200附表：附表：White培養(yǎng)基培養(yǎng)基3 3、B5B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19681968年由年由GamborgGamborg等為培養(yǎng)大豆根等為培養(yǎng)

30、大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)細(xì)胞而設(shè)計(jì) 含有較低的銨鹽含有較低的銨鹽 較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素組成成分組成成分 數(shù)量數(shù)量(mg/l）組成成分組成成分 數(shù)量數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇肌醇100 H3BO4 3.0 煙酸煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動素激動素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11

31、.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨素鹽酸硫銨素 10 Na2-EDTA37.3 B5培養(yǎng)基的組成和配方培養(yǎng)基的組成和配方4 4、N6N6培養(yǎng)基培養(yǎng)基 19741974年朱至清等為水稻等禾谷類作物年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì) KNOKNO3 3和（和（NH4NH4）SOSO4 4含量高，不含鉬含量高，不含鉬組成成分組成成分 數(shù)量數(shù)量(mg/l) 組成成分組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)

32、2SO4 463 煙酸煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培養(yǎng)基組成及配方培養(yǎng)基組成及配方配制培養(yǎng)基應(yīng)做好幾點(diǎn)工作：配制培養(yǎng)基應(yīng)做好幾點(diǎn)工作：1 1、實(shí)驗(yàn)用具的準(zhǔn)備。包括配制過程中所需電爐、酸、實(shí)驗(yàn)用具的準(zhǔn)備。包括配制過程中所需電爐、酸度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和準(zhǔn)度計(jì)、高壓滅菌鍋等設(shè)備及其他玻璃器皿的清洗和準(zhǔn)備。備。2 2、試劑、藥品的準(zhǔn)備、試劑、藥品的準(zhǔn)備3 3、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液擴(kuò)大倍數(shù)及需要配制的、根據(jù)培養(yǎng)基的配方、母液

33、擴(kuò)大倍數(shù)及需要配制的培養(yǎng)基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量。培養(yǎng)基體積計(jì)算所需各種母液及其他附加物的量。三、培養(yǎng)基的配制三、培養(yǎng)基的配制具體操作如下：具體操作如下：1 1、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷、取規(guī)定數(shù)量的糖源和凝固劑置于燒杯或搪瓷鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；鍋內(nèi)，加蒸餾水加熱使之溶解，并不斷攪拌；2 2、根據(jù)計(jì)算所需量依次加入大量元素、微量元、根據(jù)計(jì)算所需量依次加入大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特素、鐵鹽、有機(jī)物、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)母液及其他特殊的附加物，攪拌均勻；殊的附加物，攪拌均勻；3 3、加水定容至規(guī)定體積，攪拌均勻；、加水定容至規(guī)

34、定體積，攪拌均勻；4 4、調(diào)整培養(yǎng)基的、調(diào)整培養(yǎng)基的pHpH值；值；5 5、分裝（倒）；、分裝（倒）；6 6、封口（擰蓋）。、封口（擰蓋）。 培養(yǎng)基分裝封口后立刻進(jìn)行滅菌，至少在培養(yǎng)基分裝封口后立刻進(jìn)行滅菌，至少在24h24h內(nèi)完成滅菌程序。內(nèi)完成滅菌程序。 一般采用的是一般采用的是高壓蒸汽滅菌。高壓蒸汽滅菌。四、培養(yǎng)基的滅菌 滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸滅菌鍋有很多種，實(shí)驗(yàn)室中常用手提式高壓蒸汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：汽滅菌鍋，使用時(shí)要注意一下幾點(diǎn)：1、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；、鍋中應(yīng)放足量的水，以免造成空燒或干燒；2、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空

35、、裝鍋時(shí)不要過度傾斜，可保持內(nèi)部有一定的空 間，利于蒸汽流動；間，利于蒸汽流動；3、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響、增壓前高壓鍋內(nèi)的空氣必須排凈，否則易影響 滅菌效果；滅菌效果；4、滅菌過程中，應(yīng)盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵、滅菌過程中，應(yīng)盡量保持壓力恒定，嚴(yán)格遵守滅菌時(shí)間；守滅菌時(shí)間；5、排氣降壓時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)行；、排氣降壓時(shí)應(yīng)緩慢進(jìn)行；6、只有待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，才、只有待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，才能開啟壓力鍋；能開啟壓力鍋；7、高壓鍋工作時(shí)，應(yīng)有專人看守。、高壓鍋工作時(shí)，應(yīng)有專人看守。高壓滅菌的原理高壓滅菌的原理 在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力在密閉的蒸鍋內(nèi)

36、，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在也隨之增加。在0.1MPa0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121121。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。及其高度耐熱的芽孢。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證

37、滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到力上升到0.05MPa0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到壓力表上升達(dá)到0.1MPa0.1MPa時(shí)時(shí), ,開始計(jì)時(shí)，維持壓力開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.10.10.15MPa 200.15MPa 20分鐘。分鐘。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：因有三：u一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，一是濕熱

38、中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低，u二是濕熱的穿透力比干熱大；二是濕熱的穿透力比干熱大；u三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1 1克水在克水在100100時(shí)，時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2 226kJ26kJ（千焦）的熱量。（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。加滅菌效力。 u在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬?/p>

39、大的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒羝呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸汽中含有空氣于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。蒸汽的溫度。 u如果壓力未降到如果壓力未降到0 0時(shí)，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓時(shí)，打開排氣閥，就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。基而發(fā)生污染。 青島農(nóng)業(yè)青島農(nóng)業(yè)大大學(xué)學(xué)海洋科海洋科學(xué)與學(xué)與工程工程學(xué)學(xué)院院 滅菌后的培

40、養(yǎng)基經(jīng)冷卻和凝固后即可使用檢驗(yàn)滅菌后的培養(yǎng)基經(jīng)冷卻和凝固后即可使用檢驗(yàn)滅菌效果。滅菌效果。 檢驗(yàn)方法：檢驗(yàn)方法： 將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)室中3 3天，若沒有污染現(xiàn)象，天，若沒有污染現(xiàn)象，說明滅菌可靠，可以使用。說明滅菌可靠，可以使用。 保存在低溫條件下。常溫下保存時(shí)要進(jìn)行防塵保存在低溫條件下。常溫下保存時(shí)要進(jìn)行防塵和避光處理。和避光處理。 保存時(shí)間不可過長。保存時(shí)間不可過長。五、培養(yǎng)基的保存五、培養(yǎng)基的保存第四節(jié)第四節(jié) 外植體的選擇和滅菌外植體的選擇和滅菌 一、一、 外植體的選擇外植體的選擇 二、二、 外植體的滅菌方法外植體的滅菌方法 三、三、 污染原因和預(yù)防措施污染原因和預(yù)防措

41、施 一、外植體的選擇 植物組織培養(yǎng)的主要過程大致包括：植物組織培養(yǎng)的主要過程大致包括：外植體的外植體的選擇選擇、培養(yǎng)基的制備、器具的消毒、無菌操作和環(huán)、培養(yǎng)基的制備、器具的消毒、無菌操作和環(huán)境條件的調(diào)控。境條件的調(diào)控。 1 1、選擇優(yōu)良的種質(zhì)、選擇優(yōu)良的種質(zhì) 無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技無論是離體培養(yǎng)繁殖種苗，或者是進(jìn)行生物技術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，術(shù)研究，培養(yǎng)材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，選取性狀優(yōu)良的種質(zhì)，或或特殊的基因型特殊的基因型。對材料的。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提高成選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，提

42、高成功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。功機(jī)率，增加其實(shí)用價(jià)值。 2 2、選擇健壯的植株、選擇健壯的植株 組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲組織培養(yǎng)用的材料，最好從生長健壯的無病蟲的植株上，的植株上，選取發(fā)育正常的器官或組織選取發(fā)育正常的器官或組織。因?yàn)檫@些。因?yàn)檫@些器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，比較容易培養(yǎng)器官或組織代謝旺盛，再生能力強(qiáng)，比較容易培養(yǎng)成功。成功。3 3、選擇最適的時(shí)期、選擇最適的時(shí)期 組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長季節(jié)組織培養(yǎng)選擇材料時(shí)，要注意植物的生長季節(jié)和植物的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生和植物的生長發(fā)育階段。如快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活

43、率高，而且生長長的最適時(shí)期取材，這樣不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。速度快，增殖率高。4 4、選取適宜的大小、選取適宜的大小 建立無菌材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植建立無菌材料時(shí)，取材的大小根據(jù)不同植物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材物材料而異。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活。一般選取培養(yǎng)材料的大小，在般選取培養(yǎng)材料的大小，在0.5cm-1.0cm0.5cm-1.0cm。如果。如果是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。是胚胎培養(yǎng)或脫毒培養(yǎng)的材料，則應(yīng)更小。二、外植體的滅菌方法二、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥

44、劑的使用和效果、常用滅菌藥劑的使用和效果2、外植體的滅菌方法、外植體的滅菌方法1、常用滅菌藥劑的使用和效果、常用滅菌藥劑的使用和效果滅菌劑滅菌劑使用濃度（使用濃度（% %）清除的難易清除的難易消毒時(shí)間消毒時(shí)間效效 果果次氯酸鈣次氯酸鈣9 91010易易5 53030很好很好次氯酸鈉次氯酸鈉2 2易易5 53030很好很好漂漂 白白 粉粉飽和濃度飽和濃度易易5 53030很好很好氯氯 化化 汞汞0.10.11 1較難較難2 21010最好最好酒酒 精精70707575易易0.20.22 2好好過氧化氫過氧化氫10101212最易最易5 51515好好溴溴 水水1 12 2易易2 21010很好很

45、好硝硝 酸酸 銀銀1 1較難較難5 53030好好抗抗 菌菌 素素4 450mg/L50mg/L中中30306060較好較好2、外植體的滅菌方法 外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又外植體在接種前先要滅菌，在滅菌前，又先要進(jìn)行先要進(jìn)行預(yù)處理預(yù)處理。植物材料一般采取的預(yù)處理。植物材料一般采取的預(yù)處理方法是：方法是：先對植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要先對植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很干凈。經(jīng)過預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多多細(xì)菌細(xì)菌和和真菌真菌，因此還需進(jìn)一步滅菌。，因此還需進(jìn)一步

46、滅菌。 常規(guī)的表面滅菌處理方法把材料放進(jìn)把材料放進(jìn)70%的酒精中約的酒精中約30s。用用0.1%的升汞（的升汞（HgCl2）浸泡）浸泡5 10min 。 或用或用10%的的次氯酸鈉溶液次氯酸鈉溶液浸浸泡泡10 15min。無菌蒸餾水沖洗無菌蒸餾水沖洗35次。次。滅菌時(shí)進(jìn)行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好滅菌時(shí)進(jìn)行攪動，使植物材料與滅菌劑有良好 的接觸。的接觸。在滅菌劑里滴入數(shù)滴在滅菌劑里滴入數(shù)滴0.1%的的Tween20（吐溫）（吐溫） 或或Tween80濕潤劑，則滅菌效果更好。濕潤劑，則滅菌效果更好。 三、污染原因和預(yù)防措施三、污染原因和預(yù)防措施1、污染的原因、污染的原因污染污染是指在組織培養(yǎng)

47、過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材是指在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。污染的原因：污染的原因：從病原菌方面來分析主要有細(xì)菌及從病原菌方面來分析主要有細(xì)菌及真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外真菌兩大類；從污染的途徑而言，主要是由于外植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員植體帶菌、培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底、操作人員未遵守操作規(guī)程等引起的。未遵守操作規(guī)程等引起的。細(xì)菌污染的特點(diǎn)細(xì)菌污染的特點(diǎn)：是在材料附近的培養(yǎng)基中是在材料附近的培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡。出現(xiàn)渾濁和云霧狀痕跡。一般在接種后一般在接種后12天即可發(fā)現(xiàn)。天即可發(fā)現(xiàn)。原因：材料帶

48、菌；原因：材料帶菌； 培養(yǎng)基滅菌不徹底；培養(yǎng)基滅菌不徹底； 操作人員未遵守操作規(guī)程。操作人員未遵守操作規(guī)程。因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70%酒精擦洗，酒精擦洗，鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上鑷子、剪刀、接種針在使用前必須在火焰上燒紅。燒紅。真菌污染的特點(diǎn)真菌污染的特點(diǎn)：培養(yǎng)瓶內(nèi)往往會出現(xiàn)白、培養(yǎng)瓶內(nèi)往往會出現(xiàn)白、黑或綠等不同顏色菌絲塊。黑或綠等不同顏色菌絲塊。在接種后在接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。天才能發(fā)現(xiàn)。原因：周圍環(huán)境不清潔；原因：周圍環(huán)境不清潔； 超凈工作臺的過濾裝置失效；超凈工作臺的過濾裝置失效； 培養(yǎng)瓶等器皿的口徑過大。培養(yǎng)瓶等器皿的口徑過大。為了減少損失，

49、提高工作效率，必須在每個(gè)為了減少損失，提高工作效率，必須在每個(gè)操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。操作環(huán)節(jié)注意防止污染的發(fā)生。 2 2、污染的預(yù)防措施、污染的預(yù)防措施發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)發(fā)現(xiàn)污染的材料應(yīng)及時(shí)處理，否則將導(dǎo)致培養(yǎng)室環(huán)境污染。境污染。對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)對一些特別寶貴的材料，可以取出再次進(jìn)行更為嚴(yán)格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。格的滅菌，然后接入新鮮的培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)。要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)要處理的污染培養(yǎng)瓶最好在打開瓶蓋前，先集中進(jìn)行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用。行高壓滅菌，再清除污染物，然后洗凈備用

50、?，F(xiàn)就根據(jù)污染途徑，闡述污染的幾個(gè)預(yù)防措施現(xiàn)就根據(jù)污染途徑，闡述污染的幾個(gè)預(yù)防措施: :1）防止材料帶菌的措施）防止材料帶菌的措施（1）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對）用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無菌條件下對 枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。u枝條枝條 水洗凈水洗凈 插入無糖的營養(yǎng)液或自來水插入無糖的營養(yǎng)液或自來水 抽枝抽枝 以這種新抽的嫩枝條作為外植體以這種新抽的嫩枝條作為外植體 接種。這樣便可大大減少材料的污染。接種。這樣便可大大減少材料的污染。u在無菌條件下對采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待在無菌條件下對采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng)，待 抽出徒長的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明

51、抽出徒長的黃化枝條時(shí)采枝，經(jīng)滅菌后接種也可明 顯減少污染。顯減少污染。 （2 2）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體）選擇合適的時(shí)間去田間采取外植體避免陰雨天去田間采取外植體。避免陰雨天去田間采取外植體。在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采在晴天采取外植體時(shí)，下午采取的外植體要比早晨采的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真的污染少，因材料經(jīng)過日曬后可殺死部分細(xì)菌或真菌菌。 但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法但目前對材料內(nèi)部污染還沒有令人滿意的滅菌方法。在菌類長入組織內(nèi)部時(shí)，不但要除去上年生的鱗在菌類長入組織內(nèi)部時(shí)，不但要除去上年生的鱗片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分

52、生組片，甚至要除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織，以收到一定的防污染效果。織，以收到一定的防污染效果。2）外植體的滅菌）外植體的滅菌（1 1）多次滅菌法：）多次滅菌法： 首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常首先除去主脈（因主脈與支脈交界處常有真菌休眠孢子存在）；有真菌休眠孢子存在）； 其次，將切好的外植體放入其次，將切好的外植體放入1.3%1.3%的次氯的次氯酸鹽溶液中，滅菌酸鹽溶液中，滅菌30min30min； 第三，在無菌蒸餾水中沖洗第三，在無菌蒸餾水中沖洗3-53-5次；次； 第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過第四，將材料封閉在無菌的培養(yǎng)皿中過夜，保持一定溫度；夜，保持一定溫度； 第五，次

53、日將葉片用第五，次日將葉片用2.6%2.6%次氯酸鈉滅菌次氯酸鈉滅菌30min30min，然后用蒸餾水洗，然后用蒸餾水洗3-53-5次。次。（2）多種藥液交替浸泡法）多種藥液交替浸泡法 對容易污染而難滅菌的材料：對容易污染而難滅菌的材料：首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，首先取莖尖、芽或器官外植體，用自來水及肥皂充分洗凈，表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的表面不可附著污垢、灰塵，用剪刀修剪掉外植體上無用的部分，剝?nèi)パ可削[片；部分，剝?nèi)パ可削[片；第第2 2，將材料放入，將材料放入70%70%酒精中滅菌數(shù)秒鐘；酒精中滅菌數(shù)秒鐘；第第3 3，在，在1 1：500Ro

54、ccal B500Roccal B（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸（一種商品滅菌劑名）稀釋液中浸5min5min；第第4 4，放入，放入5%5%10%10%次氯酸鈉溶液中并滴入次氯酸鈉溶液中并滴入“吐溫吐溫8080”數(shù)滴，滅數(shù)滴，滅菌菌151530min30min，或浸入，或浸入0.1%0.1%0.2%0.2%升汞溶液中并加入升汞溶液中并加入“吐溫吐溫8080”數(shù)滴，滅菌數(shù)滴，滅菌5 510min10min；第第5 5，用無菌水沖洗，用無菌水沖洗5 5次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再次。也可從次氯酸鈉溶液中取出后，再放入無菌的放入無菌的0.1M0.1M鹽酸中浸片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。鹽酸中浸

55、片刻，再用無菌水沖洗數(shù)次。 3 3）玻璃器皿的滅菌）玻璃器皿的滅菌濕熱滅菌法濕熱滅菌法即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長達(dá)菌鍋中進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌時(shí)間可延長達(dá)25min25min30min30min。干熱滅菌法干熱滅菌法即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)行滅菌。行滅菌。煮沸滅菌煮沸滅菌即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅即將玻璃器皿放入水中煮沸進(jìn)行滅菌。菌。4 4）金屬器械的滅菌）金屬器械的滅菌 u火焰滅菌法：火焰滅菌法：即把金屬器械放在即把金屬器械放在95%的酒精中的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟

56、應(yīng)浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。當(dāng)在無菌操作過程中反復(fù)進(jìn)行。u干熱滅菌法：干熱滅菌法：即將擦洗干凈或烘干的金屬器械即將擦洗干凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。 濕熱滅菌法：濕熱滅菌法：工作服、口罩、帽子等布工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的的布質(zhì)品，放入高壓鍋中，布質(zhì)品，放入高壓鍋中，121121 C C的溫度，的溫度，滅菌滅菌20 min20 min30min30min。5）布質(zhì)制品的滅菌）布質(zhì)制品的滅菌 6）無菌操作室的滅菌）無菌

57、操作室的滅菌 無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用菌可用2%的新潔爾滅或的新潔爾滅或70%的酒精擦洗，然的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約后用紫外燈照射約20-30min。使用前用。使用前用70%的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。7）操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程序進(jìn)行u在接種前要在接種前要剪除指甲剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，手，最好再在新潔爾滅溶液中浸泡最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10min10min，后用，后用

58、70%70%的酒精擦手，并用的酒精擦手，并用70%70%的酒精擦拭的酒精擦拭母種瓶表面母種瓶表面進(jìn)行消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈工作臺。進(jìn)行消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈工作臺。u工作人員在接種時(shí)，工作人員在接種時(shí)，最好不要感冒咳嗽和說話最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動作要熟練、動作快、規(guī)范，這樣操作人員操作動作要熟練、動作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時(shí)間，減少污染可以縮短操作時(shí)間，減少污染。如脫毒培養(yǎng)抽取如脫毒培養(yǎng)抽取莖尖很小，操作時(shí)間長了就會使莖尖失水變干，莖尖很小，操作時(shí)間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌?；虿簧鞲腥倦s菌。 小小 結(jié)結(jié)第一節(jié)第一節(jié) 外植體的選擇外植體的選擇 ：優(yōu)良種質(zhì)

59、、健壯植株：優(yōu)良種質(zhì)、健壯植株 、最適、最適的時(shí)期、適宜的大小。的時(shí)期、適宜的大小。 第二節(jié)第二節(jié) 外植體的滅菌方法：外植體的滅菌方法：9 9種常用滅菌藥劑的使用及種常用滅菌藥劑的使用及其效果其效果 、外植體的滅菌方法。、外植體的滅菌方法。第三節(jié)第三節(jié) 污染原因和預(yù)防措施：污染的原因、污染的預(yù)污染原因和預(yù)防措施：污染的原因、污染的預(yù)防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金防措施（防止材料帶菌、外植體的滅菌、器皿與金屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、無菌操作室的滅屬器械的滅菌、布質(zhì)制品的滅菌、無菌操作室的滅菌、操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的菌、操作人員在接種時(shí)一定要嚴(yán)格按照無菌操作的程

60、序進(jìn)行）。程序進(jìn)行）。 第五節(jié) 外植體的接種和培養(yǎng) 一、 外植體的接種 二、 培養(yǎng)條件 一、外植體的接種一、外植體的接種 外植體的接種外植體的接種是把經(jīng)過表面滅菌后的植物是把經(jīng)過表面滅菌后的植物材料在無菌環(huán)境中切割或分離出器官、組織、細(xì)胞材料在無菌環(huán)境中切割或分離出器官、組織、細(xì)胞并轉(zhuǎn)入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。并轉(zhuǎn)入到無菌培養(yǎng)基上的全部操作過程。 操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和操作過程中引起的污染，主要由空氣中的雜菌和工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，工作人員本身引起的。因此除接種室空氣消毒外，應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的污染。應(yīng)特別注意防止工作人員本身引起的污