1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)題目：膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件。熟悉培養(yǎng)基的種類。掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。了解理化因素對(duì)細(xì)菌的影響。掌握常用的消毒滅菌法和無菌操作技術(shù)。2、掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。了解并比較細(xì)菌在固體、半固體及液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征。3、掌握油鏡的正確使用、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備。掌握革蘭氏染色法。熟悉細(xì)菌的基本形態(tài)。了解細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)。熟悉幾種常用的細(xì)菌生化反應(yīng)的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途。掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的原理、方法及用途。掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果觀察與判斷。熟悉藥物敏感性試驗(yàn)方法的種類、原理及應(yīng)用。掌握

2、紙片擴(kuò)散法。三、實(shí)驗(yàn)器材接種環(huán)，接種針，酒精燈，膿汁標(biāo)本1支，糞便標(biāo)本1支，碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科鑷子2把，伊紅美蘭平板，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板；斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯，生理鹽水，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸水紙1本，載玻片4張，半固體瓊脂培養(yǎng)基，糖發(fā)酵管1套，抗菌素紙片1套，藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)物4個(gè)四、方法與步驟 4.1實(shí)驗(yàn)原理 （1）、培養(yǎng)基制備：用人工方法將微生物生長(zhǎng)繁殖所需要的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，按比例混合配制而成的營(yíng)養(yǎng)制品，其主要用途是分離培養(yǎng)純種微生物，傳代或保存微生物，鑒別微生物的種屬，研究微生物的生理及生化特性。 （2）、細(xì)菌的分離與培養(yǎng)：細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，特別是細(xì)菌培養(yǎng)必須是無菌操作。細(xì)菌的接種技

3、術(shù)主要有：平板劃線分離法，斜面、液體或半固體培養(yǎng)基接種法。為避免在接種過程中污染環(huán)境和空氣中的細(xì)菌污染培養(yǎng)物，要求在酒精燈旁進(jìn)行細(xì)菌接種。采用一般培養(yǎng)法即需氧培養(yǎng)法，將已接種好的培養(yǎng)基置于37恒溫箱中培養(yǎng)1824小時(shí)，一般細(xì)菌即可在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖。 （3）、半固體培養(yǎng)基接種法(穿刺接種法)：不同的細(xì)菌生長(zhǎng)在一定的培養(yǎng)基上往往有不同的特征，因此，培養(yǎng)特征可以作為細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù)。 （4）、細(xì)菌個(gè)體形態(tài)特征的觀察：細(xì)菌是一類具有細(xì)胞壁的單細(xì)胞微生物，在一定環(huán)境下有相對(duì)恒定的形態(tài)結(jié)構(gòu)。盡管細(xì)菌菌落肉眼可見，但要觀察單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，必須借助光學(xué)顯微鏡將其放大9001000倍在微生物學(xué)中主要使用的

4、是油鏡。油鏡是因?yàn)樵谑褂脮r(shí)需要香柏油作介質(zhì)而得名。細(xì)菌菌體在強(qiáng)光下呈透明或半透明，其折光系數(shù)與玻璃片相似，在光學(xué)顯微鏡下難以看清楚，所以，必須將細(xì)菌制成涂片，固定后，用化學(xué)染料使菌體著色，從而和周圍背景產(chǎn)生鮮明對(duì)比，才能觀察到細(xì)菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。復(fù)染法，即鑒別染色法，是用兩種或兩種以上染料，可將細(xì)菌染成不同的顏色，用于協(xié)助鑒別細(xì)菌。常用的復(fù)染法有革蘭氏染色法和抗酸染色法。革蘭氏染色法將細(xì)菌分成兩大類：革蘭陽性(G+)菌和革蘭陰性(G-)菌。 （5）、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定：血漿凝固酶試驗(yàn)：致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，能使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔等動(dòng)物血漿發(fā)生凝固，凝固的血漿沉積于菌體表面，

5、阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬，或即使被吞噬，血漿凝固酶是鑒別葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。糖發(fā)酵試驗(yàn)：?jiǎn)翁前l(fā)酵微量管是只含有一種糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并加入一定量的指示劑。接種細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后，若該菌具有分解該糖的酶，有酸產(chǎn)生時(shí)就能使指示劑變色。如指示劑為酸性復(fù)紅pH4.2(紅色)6.2(黃色)，則變成紅色；溴甲酚紫pH5.2(黃色)6.8(紫色)則呈黃色。若有氣體產(chǎn)生，則微量管內(nèi)集聚氣泡。 （6）、細(xì)菌血清學(xué)鑒定：血清學(xué)反應(yīng)是指抗原抗體在體外的特異性結(jié)合反應(yīng)，可用已知抗原檢測(cè)未知抗體或用已知抗體檢測(cè)未知抗原。常見的有凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)和中和反應(yīng)等。血清學(xué)反應(yīng)常用于傳染病

6、的診斷和微生物菌株的鑒定。將已知的抗體(診斷血清)直接與未知的顆粒性抗原物質(zhì)(如細(xì)菌)混合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在條件下，如兩者對(duì)應(yīng)便發(fā)生特異性結(jié)合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對(duì)應(yīng)便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性，稱為直接凝集反應(yīng)，屬定性試驗(yàn)，有玻片法和試管法兩種，主要用于檢測(cè)抗原，如菌種的鑒定與分型、ABO血型鑒定等。 （7）、細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)：紙片擴(kuò)散法：是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴(kuò)散滲透作用，將含已知濃度的藥物濾紙片貼于含有敏感性試驗(yàn)菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，抗生素就自紙片向平板四周擴(kuò)散滲透，在抑菌濃度所達(dá)范圍內(nèi)敏感菌的生長(zhǎng)被抑制而出現(xiàn)抑菌圈，通過比較抗生素濃度與抑菌圈的大小以測(cè)定抗生素的

7、抑菌濃度。 4.2實(shí)驗(yàn)步驟 （1）培養(yǎng)基制備的一般程序：調(diào)配溶化 矯正pH 分裝滅菌檢定保存。干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定保存。 （2）、細(xì)菌的分離與培養(yǎng)：細(xì)菌的分離：燒灼滅菌接種環(huán)分別取膿汁標(biāo)本與糞便標(biāo)本點(diǎn)在普通平板和依紅美藍(lán)平板上，各做兩份燒灼接種環(huán)上的多余的標(biāo)本在平板上劃曲線移動(dòng)平板依次劃五區(qū)：從原涂抹部分開始，連續(xù)平行劃線，每次只劃平板的1/41/5，劃畢后接種環(huán)再經(jīng)火焰滅菌，冷卻后用同樣方法在平板其余部分劃線，每次劃線要與前次劃線重疊13條，共計(jì)34次(區(qū))接種環(huán)燒灼滅菌平板倒置，做好標(biāo)記37培養(yǎng)18-24小時(shí)備用。細(xì)菌純培養(yǎng)：先觀察上述實(shí)驗(yàn)中平板分離出來的菌落接種環(huán)燒灼滅菌

8、挑選平板上典型的四種單菌落（白色、黃色、紫黑色、粉紅色）進(jìn)行斜面接種純培養(yǎng)，并做好標(biāo)記接種環(huán)燒灼滅菌培養(yǎng)不得超過18小時(shí)保存?zhèn)溆?。液體培養(yǎng)基接種：接種環(huán)燒灼滅菌分別取斜面培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)得到的四種菌苔適量接種到液體培養(yǎng)基中接種環(huán)燒灼滅菌35培養(yǎng)4-6小時(shí)，備用。半固體培養(yǎng)基接種法(穿刺接種法)：右手握接種針，滅菌冷卻后，挑取菌苔少許，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，可刺達(dá)近管底處，但不要達(dá)于管底，然后沿原路退出接種完畢，試管口迅速通過火焰23次滅菌，塞好棉塞。接種針燒灼后方可放下斜面培養(yǎng)基管置于37培養(yǎng)過夜。 （4）、細(xì)菌個(gè)體形態(tài)特征的觀察：觀察細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征平板菌落特征細(xì)菌在瓊脂平

9、板上培養(yǎng)一定時(shí)間后，形成菌落。各種細(xì)菌菌落都有一定的特點(diǎn)，表現(xiàn)在以下幾方面：1 大?。捍?直徑約3mm以上)，中(直徑約13mm)，小(直徑約1mm以下)。2 形狀：圓形，卵圓形、假根形、絲狀、不規(guī)則等。3 邊緣：整齊，鋸齒狀，波浪狀，羽毛狀。4 表面：隆起、平坦、中心凸起、臍形凹陷；光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥。5 溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周圍呈草綠色、不透明)，溶血(菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)) 色素：一般為無色或灰白色，特殊色素有兩類：脂溶性色素(菌落本身著色，培養(yǎng)基不著色)和水溶性色素(菌落及培養(yǎng)基均著色)。斜面菌苔的特征：不同的細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，往往也具有一定的特征，表現(xiàn)在生長(zhǎng)量、菌

10、苔形狀(如線狀、念珠狀、假根狀、薄膜狀等)、表面形狀、光澤、透明度、顏色等方面。細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)特征的觀察細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)可出現(xiàn)肉眼可見的各種特征，如培養(yǎng)液渾濁或澄清，出現(xiàn)形態(tài)不一(如絮狀、塊狀等)的沉淀，或在培養(yǎng)基表面形成菌膜(薄膜、厚膜或僅沿管壁產(chǎn)生一圈菌膜即菌環(huán)等)。細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特征的觀察不同的細(xì)菌經(jīng)半固體培養(yǎng)基穿刺接種后生長(zhǎng)情況不同。能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌，往往沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)(即有動(dòng)力)，而使穿刺線周圍出現(xiàn)模糊或混濁；不能運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌僅沿穿刺線生長(zhǎng)；嚴(yán)格好氧菌僅表面生長(zhǎng)，兼性厭氧菌沿整個(gè)穿刺線生長(zhǎng)。 （5）、細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定：細(xì)菌涂片制備：取潔凈的載玻片一張，用在火焰上燒

11、過的接種環(huán)取生理鹽水12環(huán)于玻片上。接種環(huán)滅菌后，挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕磨勻，涂抹成直徑1厘米大小的均勻薄膜。臨床標(biāo)本如膿汁、痰、分泌物等可直接涂片干燥：涂片最好在室溫中自然干燥，必要時(shí)可將涂片膜面向上，小心間斷地在弱火高處略烘，以助水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后難以檢查革蘭染色法步驟：固定：手持玻片的一端，標(biāo)本面朝上，在火焰外層快速地來回通過23次，共約23秒，使標(biāo)本固定，即可進(jìn)行染色初染：在已固定的細(xì)菌涂片上滴加結(jié)晶紫染液12滴，經(jīng)1分鐘后用細(xì)流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水媒染：加蘆戈氏碘液12滴，經(jīng)1分鐘后用細(xì)流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。媒染劑的作用是增加染料和

12、細(xì)胞之間的親和性或附著力，不易脫落脫色：滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色或稍淡紫色為止(約需2030秒)，立即用細(xì)流水將酒精沖掉，并傾去玻片上余水復(fù)染：加稀釋復(fù)紅12滴，經(jīng)30秒1分鐘后用細(xì)流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。標(biāo)本涼干后，滴加香柏油，用油鏡觀察，革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。糖酵解試驗(yàn)。用接種針分別挑少許紫黑和粉紅色的細(xì)菌接種到葡萄糖發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管中。將微量管平放在平皿蓋內(nèi)，在37下，培養(yǎng)24小時(shí)，觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。五血漿凝固酶試驗(yàn)：取干凈玻片一塊，用計(jì)號(hào)筆將玻片分為兩格，其

13、中一格加兔血漿12滴，另一格加生理鹽水1滴將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌冷卻后，取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，在生理鹽水中研磨混勻成細(xì)菌懸液用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌懸液1環(huán)，或挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許，在兔血漿中輕輕磨勻稍待片刻，觀察結(jié)果結(jié)果判斷：先觀察生理鹽水對(duì)照，應(yīng)呈均勻混濁現(xiàn)象。再觀察細(xì)菌與兔血漿混合物，若有凝塊出現(xiàn)，則為陽性；無凝塊出現(xiàn)為陰性。 （6）、細(xì)菌血清學(xué)鑒定：血漿凝固酶試驗(yàn)。：取二滴兔血漿置于潔凈的玻片上接種環(huán)燒灼滅菌分別用接種環(huán)取斜面純化培養(yǎng)所得到的白色和黃色菌苔與血漿研磨混合邊混勻邊觀察結(jié)果接種環(huán)燒灼滅菌觀察結(jié)果。玻片凝集實(shí)驗(yàn)：取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水15ul。

14、遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清15ul用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約12個(gè)小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻如上述混合懸液由均勻混濁變?yōu)槌吻逋该?，并出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者即為陽性；如混合物仍呈均勻混濁則為陰性者，可認(rèn)為陰性。（7）、細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)：接種環(huán)分別取菌液2環(huán)，各自在四個(gè)平板上，作平板密集劃線接種細(xì)菌（紗窗樣）。設(shè)計(jì)三點(diǎn)，三點(diǎn)之間等邊三角距離，點(diǎn)距離平皿邊緣約15mm。作標(biāo)記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應(yīng)的藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，最后鑷子火焰滅菌。371824小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。五、結(jié)果與討論（1）細(xì)菌分離培養(yǎng)特點(diǎn)： 圖一 膿汁標(biāo)本分離培養(yǎng)出

15、現(xiàn)黃色和白色兩種菌落 圖二 糞便標(biāo)本分離培養(yǎng)的紫黑色和粉紅色菌落（2）斜面培養(yǎng)基接種培養(yǎng)結(jié)果 圖三 粉紅色菌落斜面接種結(jié)果 圖四 紫黑色菌落斜面接種結(jié)果（3）、.革蘭氏染色后顯微鏡下的鏡檢結(jié)果： 圖五 糞便標(biāo)本革蘭染色法涂片鏡檢 圖六 膿汁標(biāo)本革蘭染色法涂片鏡檢 鏡檢結(jié)果：標(biāo)本膿汁標(biāo)本糞便標(biāo)本菌落顏色黃色白色紫黑色帶金屬光澤粉紅色半透明形態(tài)革蘭陽性球菌,排列不規(guī)則，呈葡萄串狀革蘭陰性桿菌，散在排列結(jié)果典型的葡萄球菌；結(jié)合菌落顏色，黃色的是金黃色葡萄球菌，白色的是白色葡萄球菌從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌表一 革蘭染色法鏡檢結(jié)果(4)、細(xì)菌生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定結(jié)果 圖七 血漿凝固酶試驗(yàn) 圖八 玻片凝

16、固劑試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)血漿凝固酶試驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)種類白色球菌（左）+兔血清黃色球菌（右）+兔血清粉紅色桿菌+生理鹽水（左）粉紅色桿菌+福氏志賀菌診斷血清（右）結(jié)果白色球菌與兔血清少量凝集（+）黃色球菌與兔血清凝集現(xiàn)象較明顯，有明顯白色凝集物（+）粉紅色菌落的桿菌與生理鹽水無反應(yīng)（-），但與福氏志賀菌診斷血清凝集（+）表二 血漿凝固酶和玻片凝集試驗(yàn)結(jié)果 圖九 糖酵解實(shí)驗(yàn)，從左至右依次：紫黑色菌苔葡萄糖發(fā)酵及乳糖發(fā)酵，粉紅色菌苔葡萄糖發(fā)酵及乳糖發(fā)酵圖十 紙片擴(kuò)散法 從左往右：金黃色、白色、紫黑色、粉紅色菌與青霉素、慶大霉素、頭孢曲松藥敏結(jié)果 圖十一 紫黑色菌落菌半固體穿刺實(shí)驗(yàn) 圖十二 粉紅色菌半固體穿刺實(shí)驗(yàn)

17、 標(biāo)本菌落形態(tài)血漿固酶葡萄糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵半固體福痢血清青霉素鏈霉素慶大霉素結(jié)論膿汁標(biāo)本黃色G+球菌+金黃色葡萄球菌白色G+球菌-+白色葡萄球菌糞便標(biāo)本紫黑G-桿菌+-+大腸埃希菌粉紅G-桿菌-+-+福氏志賀菌表三 結(jié)果匯總（5）、實(shí)驗(yàn)討論實(shí)驗(yàn)比較成功，結(jié)果符合客觀事實(shí)。但在平板劃線法涂布菌液時(shí)用力過猛劃破培養(yǎng)基，且一區(qū)所占面積較大影響了五區(qū)，導(dǎo)致最后培養(yǎng)出來的單菌落較少。以后實(shí)驗(yàn)要熟練平板劃線法。用油鏡（6）注意事項(xiàng)1、在革蘭染色的操作當(dāng)中，所取得菌量不能太多，如果取得太多的菌量會(huì)在鏡檢時(shí)看到細(xì)菌與細(xì)菌之間重疊，分布過于密集，常常會(huì)導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。另外，革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程

18、度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌：而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽性菌。因此應(yīng)該要操作迅速，控制在30秒以內(nèi)。此外，染色時(shí)通常會(huì)用新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物，因?yàn)榫g會(huì)影響染色結(jié)果，如陽性菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。2、在糖發(fā)酵試驗(yàn)當(dāng)中，存放的時(shí)間不應(yīng)過長(zhǎng)，否則會(huì)使產(chǎn)氣的微量發(fā)酵管的氣體排出，導(dǎo)致所看到的現(xiàn)象不準(zhǔn)確。3、在操作動(dòng)力實(shí)驗(yàn)的過程中，接種針應(yīng)該要順著原路退出，如果此過程中接種針左右擺動(dòng)了，會(huì)出現(xiàn)本沒有鞭毛的細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)呈現(xiàn)一片渾濁，難以判斷是操作有誤還是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)所致。4、實(shí)驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)都要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作如果無菌操作不嚴(yán)格，會(huì)產(chǎn)生雜菌影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每次取菌(或接種)前后，均須燒灼接種工具，接種完畢，不能直接將接種環(huán)在火焰中燒灼，以免環(huán)上的細(xì)菌或標(biāo)本因受高熱爆烈四濺，應(yīng)先將細(xì)菌或標(biāo)本烤干后再燒灼。不要?jiǎng)澠骗傊砻妗?、注意無菌操作，防止空氣中微生物掉入平板中造成污染。