1、儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法學(xué)習(xí)目標學(xué)習(xí)目標1、掌握、掌握HPLC的分離原理、高效液相色譜分析的樣品處的分離原理、高效液相色譜分析的樣品處理方法、分離方式的選擇和定量分析方法及理方法、分離方式的選擇和定量分析方法及HPLC實驗實驗技術(shù)。技術(shù)。2、了解高效液相色譜儀的構(gòu)造、儀器各部分的功用及儀、了解高效液相色譜儀的構(gòu)造、儀器各部分的功用及儀器的維護和保養(yǎng)，熟悉其工作過程及常用固定相及流動器的維護和保養(yǎng)，熟悉其工作過程及常用固定相及流動相的特性及選用原則。相的特性及選用原則。High Performance Liquid Chromatography高效液相色譜分析法

2、高效液相色譜分析法儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法一、液相色譜分離原理一、液相色譜分離原理 特指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。特指一種用液體為流動相的色譜分離分析方法。液體待檢測物被注入色譜柱，通過流動相推動，在固液體待檢測物被注入色譜柱，通過流動相推動，在固定相中移動，由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互定相中移動，由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)以不同的順序離開色譜柱，通作用不同，不同的物質(zhì)以不同的順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。

3、信號來判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。第一節(jié)第一節(jié) 高效液相色譜分離的原理高效液相色譜分離的原理1、液相色譜分析法、液相色譜分析法儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法2、液相色譜法分類、液相色譜法分類1）液）液-液分配色譜法（液分配色譜法（LLC）2）液）液-固吸附色譜法（固吸附色譜法（LSC）3）離子交換色譜法（）離子交換色譜法（IC）4）空間排阻（凝膠）色譜法）空間排阻（凝膠）色譜法儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法1）液）液-液分配色譜法（液分配色譜法（LLC）分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異實現(xiàn)分離。分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異實現(xiàn)

4、分離。固固 定定 相：相： 載體載體+固定液（物理或機械涂漬法）。固定液（物理或機械涂漬法）。缺缺 點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用。點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用。 極性固定液極性固定液NLLC，非極性固定液，非極性固定液RLLC正相色譜正相色譜固定液極性固定液極性 流動相極性（流動相極性（NLLC），極性），極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱，小的組分先出柱，極性大的組分后出柱， 適于分離極性適于分離極性組分。組分。 反相色譜反相色譜固定液極性固定液極性 流動相極性（流動相極性（RLLC），）， 極極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱，適于分離非極性大的組分先出柱，極性小的組分

5、后出柱，適于分離非極性組分。性組分。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法2）液）液-固吸附色譜法（固吸附色譜法（LSC）流動相為液體，固定相為固體吸附劑。流動相為液體，固定相為固體吸附劑。分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異實現(xiàn)分離。力的差異實現(xiàn)分離。3）離子交換色譜法（）離子交換色譜法（IC）分離機制：離子交換樹脂上可交換的離子基團與流動相中分離機制：離子交換樹脂上可交換的離子基團與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，依據(jù)其對離子交具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，依據(jù)其對離子交換樹脂上的

6、固定離子基團親和力的不同而將溶質(zhì)分子分離。換樹脂上的固定離子基團親和力的不同而將溶質(zhì)分子分離。離子對試劑：烷基磺酸鈉離子對試劑：烷基磺酸鈉分析堿；分析堿； 四丁基季胺鹽四丁基季胺鹽分析分析酸酸4）空間排阻（凝膠）色譜法）空間排阻（凝膠）色譜法以凝膠為固定相的色譜法。以凝膠為固定相的色譜法。分離機制：溶質(zhì)自身體積大小不同，透過凝膠的速率不等。分離機制：溶質(zhì)自身體積大小不同，透過凝膠的速率不等。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和差別

7、，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、高效微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。不同極性的有機化合物。 高效液相色譜也叫高壓液相色譜（高效液相色譜也叫高壓液相色譜（high pressure liquid chromatography）、高速液相色譜（）、高速液相色譜（high speed liquid chromatography）、高分離度液相色譜（）、高分離度液相色譜（high resolution liquid chromatography）等。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別）等。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別

8、是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。析速度快而稱為高速液相色譜。二、高效液相色譜分析法的特點二、高效液相色譜分析法的特點儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法1、高效液相色譜的特點、高效液相色譜的特點高壓高壓壓力可達壓力可達150300 kg/cm2。色譜柱每米。色譜柱每米降壓為降壓為75 kg/cm2以上。以上。高速高速流速為流速為0.110.0 mL/min。高效高效塔板數(shù)可達塔板

9、數(shù)可達5000/米。在一根柱中同時分米。在一根柱中同時分離成份可達離成份可達100種。種。高靈敏度高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時。同時消耗樣品少。消耗樣品少。 儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法2、HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點速度快速度快通常分析一個樣品在通常分析一個樣品在1530 min，有些樣，有些樣品甚至在品甚至在5 min內(nèi)即可完成。內(nèi)即可完成。分辨率高分辨率高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。效果。 靈敏度高靈敏度高紫外檢測器可達紫外檢測器可達0.0

10、1ng，熒光和電化學(xué)，熒光和電化學(xué)檢測器可達檢測器可達0.1pg。 色譜柱可反復(fù)使用色譜柱可反復(fù)使用用一根色譜柱可分離不同的化用一根色譜柱可分離不同的化合物。合物。樣品量少，容易回收樣品量少，容易回收樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備?？梢允占瘑我唤M分或做制備。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法三、三、HPLC的實際應(yīng)用的實際應(yīng)用未知物質(zhì)的鑒定與確認未知物質(zhì)的鑒定與確認多成分的同時定量多成分的同時定量混合物的精制和分離混合物的精制和分離測定物理化學(xué)常數(shù)測定物理化學(xué)常數(shù)HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。應(yīng)用非常

11、廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。 儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜儀的基本構(gòu)造高效液相色譜儀的基本構(gòu)造儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 高效液相色譜系統(tǒng)由流動相高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。很

12、多調(diào)整。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法一、高壓輸液系統(tǒng)一、高壓輸液系統(tǒng)1、貯液裝置、貯液裝置2、高壓泵（輸液泵）、高壓泵（輸液泵）3、過濾器、過濾器4、洗脫裝置、洗脫裝置5、阻尼器、阻尼器儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法馬達馬達往復(fù)式拉動往復(fù)式拉動密封密封溶劑溶劑球閥球閥脈動阻脈動阻尼器尼器到色譜柱到色譜柱機械往復(fù)柱塞泵示意圖機械往復(fù)柱塞泵示意圖儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法1、貯液裝置、貯液裝置-提供足夠數(shù)量、符合要求的流動相，以完提供足夠數(shù)量、符合要求的流動相，以完成分離分析任務(wù)。成分離分析任務(wù)。 流動相須經(jīng)

13、過脫氣處理（加熱、減壓、超聲波、惰性流動相須經(jīng)過脫氣處理（加熱、減壓、超聲波、惰性氣體置換）。氣體置換）。脫氣指驅(qū)除溶解在溶劑當(dāng)中的氣體脫氣指驅(qū)除溶解在溶劑當(dāng)中的氣體。（1）脫氣是為了防）脫氣是為了防止流動相從高壓柱內(nèi)流出時，釋放出氣泡。這些氣泡進入檢測器后會使噪聲止流動相從高壓柱內(nèi)流出時，釋放出氣泡。這些氣泡進入檢測器后會使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。（劇增，甚至不能正常檢測。（2）溶解氧會與某些流動相與固定相作用，破壞）溶解氧會與某些流動相與固定相作用，破壞它們的正常功能。對水及極性溶劑的脫氣尤為重要，因為氧在其中的溶解度它們的正常功能。對水及極性溶劑的脫氣尤為重要，因為氧在其中的溶解度較

14、大。較大。2、高壓泵、高壓泵-輸出流動相輸出流動相 要求較高的輸出壓力且壓力平穩(wěn)、流速恒定、流量可要求較高的輸出壓力且壓力平穩(wěn)、流速恒定、流量可調(diào)。當(dāng)高壓流動相通過分離柱時，可降低樣品在柱中的擴調(diào)。當(dāng)高壓流動相通過分離柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的?；厥諛悠?、保持樣品的生物活性等都是有利的。 恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒壓泵：流量精度不穩(wěn) 恒流泵：常用恒流泵：常用儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法3、過濾器、過濾器-對流動相進行過濾，以消除微

15、小的機械雜質(zhì)。對流動相進行過濾，以消除微小的機械雜質(zhì)。 4、洗脫裝置、洗脫裝置 梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個基團的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離?；鶊F的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。 低壓梯度洗脫低壓梯度洗脫 高壓梯度洗脫高壓梯度洗脫5、阻尼器、阻尼器-減少流動相流量的波動，亦稱緩沖器。減少流動相流量的波動，亦稱緩沖器。 儀

16、器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法二、進樣系統(tǒng)二、進樣系統(tǒng)1、注射器（隔膜）進樣、注射器（隔膜）進樣 微量注射器刺穿高分子有機硅膠墊微量注射器刺穿高分子有機硅膠墊進樣室進樣室 由于由于GC系統(tǒng)壓力較小，可以直接使用；系統(tǒng)壓力較小，可以直接使用； HPLC系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣（早期）。系統(tǒng)壓力太大，必須停泵進樣（早期）。2、六通閥進樣、六通閥進樣 進樣準確、方便，進樣過程不必停泵。進樣準確、方便，進樣過程不必停泵。3、自動進樣器、自動進樣器 智能軟件控制，自動操作。智能軟件控制，自動操作。 儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法 該系統(tǒng)包括色譜柱（

17、柱管、固定相填料、密封墊）、連該系統(tǒng)包括色譜柱（柱管、固定相填料、密封墊）、連接管和恒溫器等。接管和恒溫器等。 1、色譜柱、色譜柱 一般長度為一般長度為1550cm（需要兩根連用時，可在二者之間（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為加一連接管），內(nèi)徑為25mm，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃，由優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為管或鈦合金等材料制成，柱內(nèi)裝有直徑為510m粒度的固粒度的固定相柱效的理論值達定相柱效的理論值達5000-16000/m。 2、色譜柱恒溫裝置、色譜柱恒溫裝置 水浴式、電熱式、恒溫箱式水浴式、電熱式、恒溫箱式三、分離系統(tǒng)三、分離系統(tǒng)儀器分析儀器

18、分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法 高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。檢測器和熒光檢測器三種。 1、紫外檢測器（、紫外檢測器（UVD） 該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。品的檢測。 其特點：其特點：1）使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、）使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；激素等均可使用）；2）靈敏度高（檢測下限為）靈敏度高（檢測下限為10-10gml）；）；3）線性范圍寬；）線性范圍寬；4

19、）對溫度和流速變化不敏感；）對溫度和流速變化不敏感；5）可檢測梯度溶液洗脫的樣品。）可檢測梯度溶液洗脫的樣品。四、檢測系統(tǒng)四、檢測系統(tǒng)儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法2、示差折光檢測器（、示差折光檢測器（RID） 凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。糖類化合物的檢測常使用此檢測系統(tǒng)。折光檢測器檢測。糖類化合物的檢測常使用此檢測系統(tǒng)。 特點：特點：通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7gmL），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，），流動相

20、的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。 3、熒光檢測器（、熒光檢測器（FD） 凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強凡具有熒光的物質(zhì)，在一定條件下，其發(fā)射光的熒光強度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒度與物質(zhì)的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某光的有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定。些蛋白質(zhì)等）的測定。 特點：特點：其靈敏度很高（檢測下限為其靈敏度很高（檢測下限為10-1210-1

21、4gmL），），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)五、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 又稱工作站（專家系統(tǒng)），該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進又稱工作站（專家系統(tǒng)），該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。離、制備或鑒定工作能正確開展。 儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法一、溶劑萃取一、溶劑萃取第三節(jié)第三節(jié) 高效液相色譜分析的樣品處理方法高效液相色譜分析的樣品處理方法二、微波溶劑萃

22、取二、微波溶劑萃取三、衍生化技術(shù)三、衍生化技術(shù)儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法第四節(jié)第四節(jié) 固定相和流動相及分離方法的選擇固定相和流動相及分離方法的選擇極性固定相極性固定相-硅膠、氧化鋁等硅膠、氧化鋁等非極性固定相非極性固定相-活性炭、分子篩等活性炭、分子篩等固定相粒徑固定相粒徑2000 不溶不溶 排阻色譜排阻色譜 水水 分配色譜分配色譜(同系物同系物) 各種各種 吸附色譜吸附色譜(異構(gòu)物異構(gòu)物) 各種各種 不溶不溶 排阻色譜排阻色譜(分子大小分子大小) 各種各種 反相液液色譜反相液液色譜 各種各種 可溶但不解離可溶但不解離 排阻色譜排阻色譜 水水 陽離子交換色譜陽離

23、子交換色譜(堿堿) 緩沖液緩沖液 可溶且不解離可溶且不解離 陰離子交換色譜陰離子交換色譜(酸酸) 緩沖液緩沖液 2000 可溶離子或非離子可溶離子或非離子 反相離子色譜反相離子色譜 緩沖液緩沖液 儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法第六節(jié)第六節(jié) 高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)高效液相色譜儀的維護與保養(yǎng)一、高效液相色譜儀的日常維護一、高效液相色譜儀的日常維護日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要日常工作中，液相色譜儀的保養(yǎng)非常重要1、注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中；、注意不要讓空氣進入輸液系統(tǒng)和高壓泵中；2、儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶、儲液器內(nèi)的溶液如長

24、時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無液，每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈，防止無機鹽析出或沉積；機鹽析出或沉積；3、樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除、樣品的前處理也很重要，任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜雜質(zhì)，完全溶解，盡量減少對色譜柱的污染，以延長色譜柱的使用壽命；柱的使用壽命；4、同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥、同時避免注射過濃的樣品溶液，以免殘留液在進樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標記，用于不同分析目內(nèi)析出固體引起堵塞；色譜柱作好標記，用于不同分析目的的色譜柱不要混

25、用等。的的色譜柱不要混用等。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法三、常見故障判斷與排除方法三、常見故障判斷與排除方法故障故障1 流動相內(nèi)有氣泡無法清除流動相內(nèi)有氣泡無法清除原因原因-過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過濾器過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi)，過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團，阻塞了過濾器，內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖，形成菌團，阻塞了過濾器，緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下緩沖液難以流暢地通過過濾器，空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進入流動相。經(jīng)過濾器進入流動相。處理過濾器的方法：將其浸泡于處理過濾器的方法：將其浸泡于5 %硝酸溶液中，硝酸溶液中

26、，超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于超聲清洗幾分鐘即可；亦可將過濾器浸泡于5 %硝酸溶硝酸溶液中液中1236 小時小時, 輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清輕輕震蕩幾次，再將過濾器用純水清洗幾次，即可將過濾器清洗干凈。洗幾次，即可將過濾器清洗干凈。二、色譜柱的日常維護與保養(yǎng)二、色譜柱的日常維護與保養(yǎng)儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法故障故障2 柱壓高柱壓高原因（原因（1）緩沖液鹽分如）緩沖液鹽分如(乙酸銨等乙酸銨等) 沉積于柱內(nèi)沉積于柱內(nèi); （2） 樣品污染沉積。樣品污染沉積。處理對于第一種情況先用處理對于第一種情況先用4050 的純水，低速正向沖的純水，低速正向沖洗

27、柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速沖洗，柱壓大幅洗柱子，待柱壓逐漸下降后，相應(yīng)提高流速沖洗，柱壓大幅度下降后，用常溫純水沖洗，度下降后，用常溫純水沖洗， 之后用純甲醇沖洗柱子之后用純甲醇沖洗柱子30 分分鐘鐘; 對于第二種情況，用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇對于第二種情況，用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇沖洗，接著用甲醇+ 異丙醇異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子沖洗柱子(沖洗時間的長短沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定由樣品污染的情況而定) ，再用換成甲醇沖洗，然后用純水，再用換成甲醇沖洗，然后用純水沖洗，最后甲醇正向沖洗柱子沖洗，最后甲醇正向沖洗柱子30 分鐘以上。分鐘以上

28、。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法故障故障3 既無壓力指示，又無液體流過。既無壓力指示，又無液體流過。原因（原因（1）泵密封墊圈磨損）泵密封墊圈磨損 （2）大量氣泡進入泵體。）大量氣泡進入泵體。處理對于第一種情況，更換密封墊圈；處理對于第一種情況，更換密封墊圈； 對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個對于第二種情況，在泵作用的同時，用一個50mL的玻的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法故障故障4 壓力波動大，流量不穩(wěn)定。壓力波動大，流量不穩(wěn)定。原因原因-系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶

29、石球和閥座之間夾有系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物，使得兩者不能密封。異物，使得兩者不能密封。處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉處理工作中注意觀察流動相的量，保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分。如為單向入儲液器瓶底，避免吸入空氣，流動相要充分。如為單向閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒閥和閥座之間夾有異物，拆下單向閥，放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗。杯用超聲波清洗。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法故障故障5 出峰不佳，峰分叉。出峰不佳，峰分叉。原因（原因（1）色譜柱被污染）色譜柱被污染; （2） 柱頭填

30、料塌陷。柱頭填料塌陷。處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換處理對于第一種情況，先用純水反向沖洗柱子，然后換成甲醇沖洗，接著用甲醇成甲醇沖洗，接著用甲醇+ 異丙醇異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子沖洗柱子(沖洗時沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定間的長短由樣品污染的情況而定)， 再換成甲醇沖洗再換成甲醇沖洗, 然后然后用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子用純水沖洗，最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。如分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。沖洗后依然出峰不佳，則考慮第二種情況。 對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或塌對于第二種情況，擰開柱頭，檢查柱填料是否硬結(jié)或

31、塌陷。去除硬結(jié)部分陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料污染的填料)，裝入新填料，滴一滴甲醇，裝入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓填料下陷，再填，用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱緊，再填平，滴甲醇，再壓緊反復(fù)幾次，直至裝滿填平。柱頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲頭用甲醇沖洗干凈，擦凈柱外壁的填料，擰緊柱頭，用純甲醇沖洗醇沖洗30 分鐘以上。分鐘以上。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法故障故障6 峰面積重復(fù)性不佳。峰面積重復(fù)性不佳。原因（原因（1）進樣閥漏液（）進樣閥

32、漏液（2）加樣針不到位。）加樣針不到位。處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈；處理對于第一種情況更換進樣閥墊圈； 對于第二種對于第二種情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)情況保證加樣針插到底，注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從地從LOAD 狀態(tài)轉(zhuǎn)換到狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJ EC T 狀態(tài)，以保證進樣量的狀態(tài)，以保證進樣量的準確。準確。儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法第七節(jié)第七節(jié) 液相色譜法的發(fā)展史液相色譜法的發(fā)展史 1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣性，為了分離蛋

33、白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代年代末科克蘭（末科克蘭（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。 儀器分析儀器分析第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法1971年科克蘭等人出版了年科克蘭等人