1、組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù). 鄂征 主編.北京出版社, 1995年8月出版細(xì)胞培養(yǎng) 司徒鎮(zhèn)強(qiáng) 主編. 世界圖書出版公司, 1996年出版體外培養(yǎng)的原理和技術(shù). 薛慶善 主編. 科學(xué)出版社, 2001年1月出版動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)指南(中譯).章靜波 等譯. 科學(xué)出版社, 2004年10月出版.Human Cell Culture Protocols (2nd Ed). Joanna Picot. Humana Press, October 2004.Basic Cell Culture Protocols (3rd Ed). CD Helgason, CL Miller. Humana Pres

2、s, October 2004離心機(jī)櫥柜實(shí)驗(yàn)臺(tái)冰箱培養(yǎng)箱試劑柜實(shí)驗(yàn)儀器臺(tái)超凈工作臺(tái)實(shí)驗(yàn)臺(tái)實(shí)驗(yàn)臺(tái)實(shí)驗(yàn)臺(tái)實(shí)驗(yàn)臺(tái)水池冰箱衣柜實(shí)驗(yàn)臺(tái)顯微鏡遞物窗緩沖間無(wú)菌操作室準(zhǔn)備室1.細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)置下風(fēng)口下風(fēng)口上風(fēng)口上風(fēng)口無(wú)菌操作室超凈工作臺(tái)和CO2培養(yǎng)箱2.2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備n超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過(guò)工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。 nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ，5CO2 n使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒箱內(nèi)蒸

3、餾水槽中預(yù)留滅菌蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。解剖顯微鏡倒置顯微鏡2.2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備細(xì)胞培養(yǎng)的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備血清（天然成分）：基礎(chǔ)培養(yǎng)基（人工合成）：干粉培養(yǎng)基DMEM 、-MEM、RPMI1640水：高純度的去離子水3.細(xì)胞培養(yǎng)的主要試劑（培養(yǎng)基）抗菌素：通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，使用濃度為100U/mln 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。n 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體病毒污染。n 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘n 血清的消毒：過(guò)濾除菌n

4、血清的使用濃度為520消化液：常用0.25胰蛋白酶，使細(xì)胞脫離組織或容器壁， 用含血清培養(yǎng)液中止其活性4.細(xì)胞培養(yǎng)用器皿的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分為四個(gè)步驟：1、自來(lái)水浸泡2、洗滌劑刷洗(如有必要進(jìn)行超聲處理）3、泡酸（濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水）4、流水沖洗過(guò)夜，依次用蒸餾水、三蒸水漂洗，最后烘干備用 常用消毒方法：1、濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌），15磅，1520min2、過(guò)濾除菌(如：血清的除菌） 細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指細(xì)胞的離體培養(yǎng)，是在無(wú)菌條件下，把動(dòng)物或植物的細(xì)胞從機(jī)體中分離出來(lái)，置于培養(yǎng)皿中，并在一個(gè)合適的環(huán)境中，給以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使之繼續(xù)生存和繁殖的方法。 原

5、代培養(yǎng)(primary culture)，或稱為初代培養(yǎng)，就是從供體取下組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物。常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。 傳代培養(yǎng)(secondly culture)，在原代培養(yǎng)物鋪展為單細(xì)胞層后，將原代培養(yǎng)細(xì)胞分開接種到兩個(gè)或多個(gè)新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)增殖。v 貼附型 成纖維樣細(xì)胞型 上皮樣細(xì)胞型v 懸浮型培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)人口腔上皮細(xì)胞培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞v 細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)v 接觸抑制v 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線細(xì)胞貼壁延展過(guò)程細(xì)胞貼壁延展過(guò)程( (模式圖模式圖) )細(xì)胞的接觸抑制現(xiàn)象細(xì)胞的接觸抑制現(xiàn)象正常培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線正常培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線退化死

6、亡平臺(tái)期細(xì)胞數(shù)增大極限點(diǎn)，出現(xiàn)接觸抑制細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)極限點(diǎn)指數(shù)生長(zhǎng)期潛伏期細(xì)胞數(shù)量024487296120小時(shí)指數(shù)生長(zhǎng)期是最佳實(shí)驗(yàn)期指數(shù)生長(zhǎng)期是最佳實(shí)驗(yàn)期 ! ! 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 取材、分離細(xì)胞取材、分離細(xì)胞 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 維護(hù)培養(yǎng)維護(hù)培養(yǎng)著裝著裝操作者進(jìn)入無(wú)菌室前先用肥皂洗凈雙手，操作者進(jìn)入無(wú)菌室前先用肥皂洗凈雙手，然后用然后用1 1 新潔爾滅浸泡消毒新潔爾滅浸泡消毒5 5分鐘分鐘原代培養(yǎng)的一般流程原代培養(yǎng)的一般流程將小白鼠斷頸處死，然后用將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或酒精或1 新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無(wú)菌室。新潔爾滅浸泡消毒，迅速進(jìn)入無(wú)菌室。 用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并用眼

7、科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪剪碎組織 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 取材、分離細(xì)胞取材、分離細(xì)胞 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 維護(hù)培養(yǎng)維護(hù)培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 取材、分離細(xì)胞取材、分離細(xì)胞 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) 維護(hù)培養(yǎng)維護(hù)培養(yǎng)原代培養(yǎng)的一般流程組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)方法消化法單細(xì)胞法半消化法原代培養(yǎng)流程圖原代培養(yǎng)流程圖：組織塊法組織塊法取材漂洗剪碎沉降洗滌加液涂布接種接種組織塊接種組織塊原代培養(yǎng)流程圖原代培養(yǎng)流程圖：組織塊法組織塊法n移入培養(yǎng)箱中（注移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一意貼有組織塊的一面朝上），面朝上），n靜止靜止2 23 3小時(shí)，然小時(shí)，然后將細(xì)胞培

8、養(yǎng)瓶輕后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)。原代培養(yǎng)流程圖原代培養(yǎng)流程圖：消化法消化法取材漂洗剪碎酶解(單細(xì)胞)離心洗滌加液計(jì)數(shù)接種原代培養(yǎng)流程圖原代培養(yǎng)流程圖：半消化法半消化法取材漂洗剪碎酶解(部分酶解)沉降洗滌加液接種（一）獲取小鼠胚胎（一）獲取小鼠胚胎1.將8周齡的昆白鼠和12周齡的昆白按1:1比例合籠。次日晨10:00前觀察鼠陰道口，有乳白色或蛋黃色膠凍狀物（陰道栓）即定為懷孕0.5天；2.斷頸處死孕13.5天的母鼠，置于蠟盤上。75酒精消毒后，用普通剪刀和鑷子剪開下腹皮膚，并用兩把彎頭止血鉗夾住切口處的皮膚向頭尾兩側(cè)牽拉即剝皮。用眼科彎鑷和眼科彎剪打開腹腔，暴露

9、出子宮。用眼科彎鑷夾住一側(cè)子宮，分離子宮系膜，眼科彎剪剪斷子宮角和子宮頸，將整個(gè)子宮分離下來(lái)（注意勿使子宮滑落到腹腔外，避免污染）。將子宮置于無(wú)菌濾紙上去除血跡。3.在超凈臺(tái)內(nèi)將子宮移入預(yù)先盛有PBS的平皿中，洗滌數(shù)次。將子宮移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科彎剪沿子宮系膜打開子宮，取出帶有胎膜的胎鼠，并用兩把眼科鑷子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。將胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科鑷去除胎鼠的頭、四肢和內(nèi)臟，得鼠胚軀干。將鼠胚軀干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗滌兩次至無(wú)肉眼可見的血色。（二）分散細(xì)胞（二）分散細(xì)胞1.將干凈的鼠胚軀干移至干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)（一般6個(gè)鼠胚軀

10、干裝1皿，視大小而定），用眼科直剪充分剪碎，剪成約1mm3以下的碎塊。2.用1ml的移液器每皿加入3ml的PBS，混勻，靜置30sec，用移液器吸去上清液；向裝有鼠胚碎塊的培養(yǎng)皿內(nèi)加入1ml0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液，用1ml移液器輕輕吹吸30秒，可見組織塊變得較為粘稠，緩慢搖動(dòng)培養(yǎng)皿2-5min后利用倒置顯微鏡觀察組織塊變透明，并有單細(xì)胞脫離時(shí)即可進(jìn)行組織塊半消化的原代培養(yǎng)；3.留小部分鼠胚碎塊于培養(yǎng)皿中用于組織塊半消化原代培養(yǎng)，其余移至一尖底離心管中，置37水浴搖動(dòng)消化15-20min，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)；4.培養(yǎng)皿中立即加入1ml含50%新生牛血清的PBS，吹

11、打混勻，以終止酶的作用；離心管消化結(jié)束后，靜置5min，用移液器小心將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，并加入1ml含50%新生牛血清的PBS中，吹打混勻，以終止酶的作用， 1000rpm離心5min，棄上清，沉淀即為分散的鼠胚成纖維細(xì)胞（三）接種培養(yǎng)（三）接種培養(yǎng)用移液器吸去培養(yǎng)皿中的多余液體加入適量含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將組織塊轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿（瓶）中，并均勻分布在培養(yǎng)皿（瓶）的底部，做好標(biāo)記（日期、名稱、編號(hào)），放入37，5CO2，100相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞沉淀用適量含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸??；利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為105個(gè)/ml，計(jì)算細(xì)胞的存活

12、率（具體實(shí)驗(yàn)步驟見“細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)”部分）；剩余細(xì)胞懸液用于細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)（具體見“細(xì)胞的冷凍保存”部分）3. 第2-3天可以觀察，組織塊半消化原代培養(yǎng)可見組織碎塊附著于培養(yǎng)瓶（皿）底部，周圍細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)，此時(shí)可見有多種細(xì)胞類型，有的是呈梭形的成纖維細(xì)胞，有的是呈圓形的上皮細(xì)胞。流程圖流程圖處死孕鼠，取出鼠胚去除鼠胚的頭、四肢及內(nèi)臟，PBS清洗剪碎鼠胚軀干，PBS清洗加入適量胰酶消化5min取少量組織于EP管中繼續(xù)消化20min，獲取單細(xì)胞剩余組織加入含血清的1640培養(yǎng)液終止消化倒置顯微鏡下觀察將半消化的組織塊接種至新的培養(yǎng)皿或瓶，并加入新鮮的1640培養(yǎng)液用移液槍反復(fù)吹打消化液，形成

13、單細(xì)胞懸液，吸取少量懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)v 將原代培養(yǎng)物分割后重新接種到兩個(gè)或多個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，這一操作稱為傳代培養(yǎng),傳代比例為1:3 至1:6，依細(xì)胞種類而異.v 細(xì)胞傳代培養(yǎng)的意義v 傳代時(shí)機(jī)的把握v 傳代培養(yǎng)的代數(shù)限制；少數(shù)細(xì)胞可出現(xiàn)永生化每一代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程分期每一代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程分期退化死亡平臺(tái)期細(xì)胞數(shù)增大極限點(diǎn)，出現(xiàn)接觸抑制細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)極限點(diǎn)（MI、細(xì)胞群體倍增時(shí)間）指數(shù)生長(zhǎng)期潛伏期細(xì)胞數(shù)量024487296120小時(shí)吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約2min在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型貼附型PBS洗 滌12次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度 分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的觀察細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型貼附型培養(yǎng)細(xì)胞的觀察培養(yǎng)液顏色、是否清亮培養(yǎng)液顏色、是否清亮培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型貼附型吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約5min在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀PBS洗 滌12次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度 分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的觀察胰酶消化數(shù)分鐘胰酶