1、 第五章第五章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化n酶的分離純化酶的分離純化 將酶從細(xì)胞或其它酶原料中提取出來，再與雜將酶從細(xì)胞或其它酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需酶制品的過程。質(zhì)分開，而獲得所需酶制品的過程。 酶的制備流程：酶的制備流程：n材料選擇材料選擇細(xì)胞破碎的各種方法及原理細(xì)胞破碎的各種方法及原理酶抽酶抽提的各種方法、原理及注意事項(xiàng)提的各種方法、原理及注意事項(xiàng)離心分離原理離心分離原理及方法及方法過濾與膜分離過濾與膜分離沉淀分離的方法沉淀分離的方法層析分離各種方法層析分離各種方法電泳分離原理及方法電泳分離原理及方法酶酶的結(jié)晶的結(jié)晶濃縮與干燥濃縮與干燥 把生物技術(shù)在把生物技術(shù)

2、在研究、開發(fā)研究、開發(fā)及及應(yīng)用應(yīng)用于生產(chǎn)工藝過程的工作于生產(chǎn)工藝過程的工作分為分為上游上游及及下游下游兩個(gè)部分。兩個(gè)部分。 下游下游（后處理工藝）后處理工藝）（down stream processdown stream process）：）： 如何高收率、高純度、高質(zhì)量的從微生物的發(fā)酵液如何高收率、高純度、高質(zhì)量的從微生物的發(fā)酵液中、細(xì)胞培養(yǎng)液中及動(dòng)、植物組織的提取液中得到所需中、細(xì)胞培養(yǎng)液中及動(dòng)、植物組織的提取液中得到所需的產(chǎn)品。的產(chǎn)品。 第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎n細(xì)胞破碎的目的是細(xì)胞破碎的目的是破壞細(xì)胞外圍使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來破壞細(xì)胞外圍使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。n微生物細(xì)胞的外圍通常包括

3、微生物細(xì)胞的外圍通常包括細(xì)胞壁細(xì)胞壁和和細(xì)胞膜細(xì)胞膜，它們起著，它們起著支撐細(xì)胞的作用。支撐細(xì)胞的作用。 細(xì)胞壁（外壁）：具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)細(xì)胞壁（外壁）：具有固定細(xì)胞外形和保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷或滲透壓破壞的功能。是械損傷或滲透壓破壞的功能。是細(xì)胞破碎的主要阻力細(xì)胞破碎的主要阻力。 細(xì)胞膜細(xì)胞膜( (內(nèi)壁內(nèi)壁):):是一層半透膜。膜較薄，主要由蛋白質(zhì)和是一層半透膜。膜較薄，主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，強(qiáng)度比較差，脂質(zhì)組成，強(qiáng)度比較差，易受易受滲透壓沖擊而破碎。滲透壓沖擊而破碎。n抽提胞內(nèi)酶：需將細(xì)胞壁破碎抽提胞內(nèi)酶：需將細(xì)胞壁破碎n破碎細(xì)胞方法：破碎細(xì)胞方法： 動(dòng)植物細(xì)胞：高速動(dòng)植物

4、細(xì)胞：高速組織搗碎機(jī)組織搗碎機(jī) 組織勻漿器組織勻漿器 微生物細(xì)胞：微生物細(xì)胞：機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法 酶法酶法 化學(xué)試劑法化學(xué)試劑法 物理破碎法物理破碎法等多種。等多種。細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理分類分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 細(xì)胞破碎原理細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法機(jī)械破碎法搗碎法搗碎法研磨法研磨法勻漿法勻漿法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎使組織、細(xì)胞破碎物理破碎法物理破碎法溫度差破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法超聲波破碎法反復(fù)凍融法反復(fù)凍融法干燥法干燥法通過各種物理因素的作用，使通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)

5、構(gòu)破壞，組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎而使細(xì)胞破碎化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑、添加有機(jī)溶劑、添加表面活性劑添加表面活性劑通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的作用，而使細(xì)胞破碎酶促破碎法酶促破碎法自溶法自溶法外加酶制劑法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外加通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎一、機(jī)械破碎法一、機(jī)械破碎法 通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力使細(xì)胞破碎的方法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力使細(xì)胞破碎的方法n1 1、機(jī)械搗碎法、機(jī)械搗碎法 常用于較脆嫩的

6、組織細(xì)胞破碎：動(dòng)物內(nèi)臟、植物葉芽常用于較脆嫩的組織細(xì)胞破碎：動(dòng)物內(nèi)臟、植物葉芽等，也可用于微生物，特別是細(xì)菌的細(xì)胞破碎。等，也可用于微生物，特別是細(xì)菌的細(xì)胞破碎。n2 2、研磨法、研磨法 常用于微生物和植物組織細(xì)胞的破碎：設(shè)備簡單，效常用于微生物和植物組織細(xì)胞的破碎：設(shè)備簡單，效率較低。率較低。n3 3、勻漿法、勻漿法 用于破碎那些易于分散、比較柔軟、顆粒細(xì)小的組織用于破碎那些易于分散、比較柔軟、顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞，細(xì)胞破碎程度較高，其機(jī)械切力對酶的破壞也細(xì)胞，細(xì)胞破碎程度較高，其機(jī)械切力對酶的破壞也較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。 二、物理破碎法二、物理破碎法n各

7、種物理因素：各種物理因素： 溫度、壓力、聲波等的作用，使組織細(xì)胞破碎溫度、壓力、聲波等的作用，使組織細(xì)胞破碎n多用于微生物細(xì)胞的破碎。多用于微生物細(xì)胞的破碎。1 1、溫度差破碎法、溫度差破碎法n利用溫度的突然變化，熱脹冷縮的作用使細(xì)胞破碎。利用溫度的突然變化，熱脹冷縮的作用使細(xì)胞破碎。n對那些較脆弱、易破的細(xì)胞破碎效果好對那些較脆弱、易破的細(xì)胞破碎效果好，但在酶的，但在酶的提取時(shí)，不能在過高或過低溫度下操作，以免酶失提取時(shí)，不能在過高或過低溫度下操作，以免酶失活?；?。n此法難以用于工業(yè)生產(chǎn)。此法難以用于工業(yè)生產(chǎn)。2 2、壓力差破碎法、壓力差破碎法（1 1）高壓沖擊法）高壓沖擊法 （2 2）突然

8、降壓法）突然降壓法 取決因素：取決因素：a.a.壓力差壓力差 b.b.壓力降低的速度壓力降低的速度 c.c.細(xì)胞種類和生長期細(xì)胞種類和生長期 此法對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌效果較佳，最好使用此法對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌效果較佳，最好使用對數(shù)生長期的細(xì)胞。對數(shù)生長期的細(xì)胞。（3 3）滲透壓差法）滲透壓差法n方法：將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的方法：將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或甘油或2020蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞

9、溶脹，甚至破碎。于是，細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破碎。于是，細(xì)胞內(nèi)容物就釋放出來。內(nèi)容物就釋放出來。 n適用于適用于膜結(jié)合的酶膜結(jié)合的酶、細(xì)胞間質(zhì)酶細(xì)胞間質(zhì)酶等的提取等的提取n僅適用于僅適用于細(xì)胞壁較脆弱細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞，或者的細(xì)胞，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理處理，或者，或者在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。 l 對革蘭氏陽性菌不適用對革蘭氏陽性菌不適用,為什么？為什么？l 由于革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁由肽多糖組成，可以由于革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁由肽多糖組成，可以承受滲透壓的變化

10、，而不致細(xì)胞破碎。承受滲透壓的變化，而不致細(xì)胞破碎。3 3、超聲波破碎法、超聲波破碎法n超聲波：超聲波：耳朵可聽到的聲音頻率范圍為耳朵可聽到的聲音頻率范圍為16-20kHz，頻，頻率高于率高于20 kHz的波。的波。n機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。在超聲波作用下，在超聲波作用下，細(xì)胞膜由于空穴作用而破碎。細(xì)胞膜由于空穴作用而破碎。n由于空化作用而使液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)由于空化作用而使液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)生流動(dòng)，旋渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大的壓力使細(xì)胞生流動(dòng)，旋渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大的壓力使細(xì)胞膜破裂到達(dá)破碎細(xì)

11、胞的效果。膜破裂到達(dá)破碎細(xì)胞的效果。n細(xì)胞破碎的程度與細(xì)胞破碎的程度與輸出功率輸出功率和和破碎時(shí)間破碎時(shí)間有密切關(guān)系。有密切關(guān)系。 影響因素：細(xì)胞濃度、溶液粘度、影響因素：細(xì)胞濃度、溶液粘度、pH值、溫度以及離值、溫度以及離子強(qiáng)度等。子強(qiáng)度等。 應(yīng)根據(jù)細(xì)胞種類以及酶的特性加以選擇。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞種類以及酶的特性加以選擇。n一般操作條件為：音頻一般操作條件為：音頻20 kHz；功率；功率100150W；溫；溫度度010；pH47；處理時(shí)間；處理時(shí)間310 min，最好間隔，最好間隔幾次操作；細(xì)胞濃度和溶液粘度不宜太高，最好采用幾次操作；細(xì)胞濃度和溶液粘度不宜太高，最好采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行破碎。細(xì)

12、胞濃度一般以對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行破碎。細(xì)胞濃度一般以1 g濕菌濕菌體加體加12 mL緩沖液為宜。緩沖液為宜。 n超聲波破碎法特點(diǎn)：超聲波破碎法特點(diǎn)： 處理少量樣品時(shí)操作簡單、快捷、液量損失少、效果好；處理少量樣品時(shí)操作簡單、快捷、液量損失少、效果好； 是最常用的物理破碎法，是最常用的物理破碎法，特別適用于特別適用于微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞的破碎。的破碎。n超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時(shí)常在細(xì)胞懸超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時(shí)常在細(xì)胞懸浮液中加入浮液中加入冰塊冰塊或在夾套中通入或在夾套中通入冷卻劑冷卻劑進(jìn)行冷卻。進(jìn)行冷卻。4 4、反復(fù)凍融法、反復(fù)凍融法n方法：將待破碎的細(xì)胞放在低溫下

13、（方法：將待破碎的細(xì)胞放在低溫下（-15-15-20-20）突）突然冷凍，然后在室溫（或然冷凍，然后在室溫（或4040）下緩慢地融解，如此）下緩慢地融解，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。n只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破損率低，常需反復(fù)只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破損率低，常需反復(fù)多次。多次。n凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。 5 5、干燥法、干燥法n細(xì)胞干燥法：如氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷細(xì)胞干燥法：如氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷

14、凍干燥等。凍干燥等。n通過干燥使通過干燥使細(xì)胞壁膜的結(jié)合水分細(xì)胞壁膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來。n干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其他活性物干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其他活性物質(zhì)變性。質(zhì)變性。三、化學(xué)破碎法三、化學(xué)破碎法n化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破碎的方法。碎的方法。n如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬如有機(jī)溶劑、變性劑、表面

15、活性劑、抗生素、金屬螯合劑等螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁和膜的通透性（滲透可以改變細(xì)胞壁和膜的通透性（滲透性），從而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。性），從而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。n取決于取決于化學(xué)試劑的類型化學(xué)試劑的類型以及以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成，不同化學(xué)試劑對各種微生物作用的部位和方式有所不不同化學(xué)試劑對各種微生物作用的部位和方式有所不同。同。n常用的化學(xué)試劑：常用的化學(xué)試劑：有機(jī)溶劑和表面活性劑有機(jī)溶劑和表面活性劑 1 1、有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑n能分解細(xì)胞壁中的類脂。能分解細(xì)胞壁中的類脂。n常用試劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。常用試劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。n使

16、細(xì)胞膜的使細(xì)胞膜的磷脂磷脂結(jié)構(gòu)破壞，改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞，改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放出胞外。提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放出胞外。2 2、表面活性劑、表面活性劑n促使細(xì)胞某些組分溶解（增溶作用），有助于細(xì)胞的促使細(xì)胞某些組分溶解（增溶作用），有助于細(xì)胞的破碎?？膳c細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白作用而破壞膜結(jié)破碎?？膳c細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白作用而破壞膜結(jié)構(gòu)，增加膜的通透性。構(gòu)，增加膜的通透性。n例如，例如，TritonX-100（特里頓）是一種（特里頓）是一種非離子型清潔劑非離子型清潔劑，對疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并對疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并

17、溶解磷脂溶解磷脂，其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。n表面活性劑處理法對膜結(jié)合酶特別有效。表面活性劑處理法對膜結(jié)合酶特別有效。n在酶的提取方面一般不采用離子型表面活性劑的在酶的提取方面一般不采用離子型表面活性劑的原因：原因： 會使酶的結(jié)構(gòu)破壞，引起酶的變性失活。會使酶的結(jié)構(gòu)破壞，引起酶的變性失活。n如何除去如何除去表面活性劑？表面活性劑？n可采用可采用凝膠層析凝膠層析，以免影響下一步分離純化。，以免影響下一步分離純化。 化學(xué)破碎法的化學(xué)破碎法的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：nA A、對產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。、對產(chǎn)物釋放

18、具有一定選擇性。nB B、細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易、細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。于固液分離和進(jìn)一步提取。 化學(xué)破碎法的缺點(diǎn)：化學(xué)破碎法的缺點(diǎn)：nA A、通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。、通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。nB B、時(shí)間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過、時(shí)間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過5050。nC C、有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中，、有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中，需設(shè)法分離除去。需設(shè)法分離除去。 四、酶促破碎法四、酶促破碎法 通過細(xì)胞通過細(xì)胞本身的酶

19、系本身的酶系或或外加酶制劑外加酶制劑的催化作用，使細(xì)的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。1、自溶法（、自溶法（Autolysis） n將發(fā)酵液在一定將發(fā)酵液在一定pHpH值和適宜溫度條件下保溫一段時(shí)間，值和適宜溫度條件下保溫一段時(shí)間，由于胞內(nèi)自身酶系破壞細(xì)胞以釋出胞內(nèi)酶的方法。由于胞內(nèi)自身酶系破壞細(xì)胞以釋出胞內(nèi)酶的方法。n自溶條件：溫度、自溶條件：溫度、pHpH值、離子強(qiáng)度等。值、離子強(qiáng)度等。n自溶時(shí)間一般較長，不易控制，為防止其他微生物在自溶時(shí)間一般較長，不易控制，為防止其他微生物在自溶液中滋長，必要時(shí)可加入甲苯、氯仿、疊氮鈉等自

20、溶液中滋長，必要時(shí)可加入甲苯、氯仿、疊氮鈉等殺菌劑。殺菌劑。n還可以通過加入噬菌體去感染細(xì)胞，或通過電離輻射還可以通過加入噬菌體去感染細(xì)胞，或通過電離輻射等方法，使細(xì)胞自溶。等方法，使細(xì)胞自溶。n自溶法的缺點(diǎn)：自溶法的缺點(diǎn)： 易引起所需蛋白質(zhì)的變性；自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增易引起所需蛋白質(zhì)的變性；自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速率下降；易引起雜菌或噬菌體感染。大，過濾速率下降；易引起雜菌或噬菌體感染。 2 2、外加酶處理、外加酶處理 n酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：酶溶法的優(yōu)點(diǎn)： 選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。外形完整。 n酶溶法的不足：酶溶法

21、的不足： 1 1、溶酶價(jià)格高，溶酶價(jià)格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用，若回收酶則又需限制了大規(guī)模應(yīng)用，若回收酶則又需要增加分離純化溶酶的操作和設(shè)備，其費(fèi)用也不低；要增加分離純化溶酶的操作和設(shè)備，其費(fèi)用也不低； 加入的溶菌酶、幾丁質(zhì)酶等價(jià)格高，而且外加酶本身混加入的溶菌酶、幾丁質(zhì)酶等價(jià)格高，而且外加酶本身混入細(xì)胞破碎液中成為雜質(zhì)，所以入細(xì)胞破碎液中成為雜質(zhì)，所以只適于實(shí)驗(yàn)室采用只適于實(shí)驗(yàn)室采用。 2 2、酶溶法通用性差，酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件。易確定最佳的溶解條件。 破碎細(xì)胞的不同分類方法破碎細(xì)胞的不同分類方法 第二節(jié)第二節(jié) 酶的提取酶

22、的提取 材料的選擇材料的選擇: : 原則原則: :原料所含有的目的蛋白質(zhì)含量要高，且容易原料所含有的目的蛋白質(zhì)含量要高，且容易獲得；由于研究目的不同，有時(shí)只能使用特定的原獲得；由于研究目的不同，有時(shí)只能使用特定的原料。料。 n酶的提?。ɑ蚍Q酶的抽提）：酶的提取（或稱酶的抽提）：指在一定的條件下，指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。解到溶劑或溶液中的過程。n在一定條件下用適當(dāng)溶劑處理含酶原料，將盡可在一定條件下用適當(dāng)溶劑處理含酶原料，將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)，從原料引入溶液中，能多的酶，盡量少的雜質(zhì)，從

23、原料引入溶液中，是酶分離純化之前的必需步驟。是酶分離純化之前的必需步驟。n酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性酸性物質(zhì)溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。溶劑中。 一、酶提取的方法一、酶提取的方法n根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，酶的提取方法主要有：取方法主要有： 稀鹽溶液提取稀鹽溶液

24、提取 稀酸溶液提取稀酸溶液提取 稀堿溶液提取稀堿溶液提取 有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取 1 1、鹽溶液提取、鹽溶液提取n絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶鹽溶”現(xiàn)象現(xiàn)象。n鹽濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶鹽濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，使蛋白質(zhì)與水分子間電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，使蛋白質(zhì)與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。

25、的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。n但有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比但有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。鹽溶液提取的效果較好。 2 2、酸溶液提取、酸溶液提取n有些酶在酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，有些酶在酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。宜用酸溶液提取。 如：從胰臟中提取如：從胰臟中提取胰蛋白酶胰蛋白酶和和胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶，可用，可用0.12mol/L的的H2SO4。n提取時(shí)要注意溶液的提取時(shí)要注意溶液的pHpH值不能太低，以免使酶變性值不能太低，以免使酶變性失活。失活。3 3、堿溶液提取、堿溶液提取n有些酶在堿性條件下

26、溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，有些酶在堿性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用堿溶液提取。宜用堿溶液提取。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :n操作時(shí)要注意操作時(shí)要注意pHpH值不能過高，以免影響酶的活性。值不能過高，以免影響酶的活性。n加堿液的過程要一邊攪拌一邊緩慢加進(jìn)，以免出加堿液的過程要一邊攪拌一邊緩慢加進(jìn)，以免出現(xiàn)局部過堿現(xiàn)象，引起酶的變性失活?，F(xiàn)局部過堿現(xiàn)象，引起酶的變性失活。 4 4、有機(jī)溶劑提取、有機(jī)溶劑提取n一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶難溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿中，常用不同比的酶難溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑

27、提取。例的有機(jī)溶劑提取。n常用的有機(jī)溶劑有常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、丁醇乙醇、丙酮、丁醇等，這些溶劑等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。性。n其中其中丁醇丁醇對脂蛋白的解離能力較強(qiáng)，提取效果較好。對脂蛋白的解離能力較強(qiáng)，提取效果較好。 原因原因: :n丁醇丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解部，與水也能溶解1010，因此具有脂質(zhì)與水之間的表，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋

28、白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中的溶解能力蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中的溶解能力大大增加。大大增加。n一些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一一些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼稀的有機(jī)溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。n例如，例如，胰島素胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的織中與其共存的糜蛋白酶糜蛋白酶對胰島素有極高

29、的水解活性，對胰島素有極高的水解活性，因而采用因而采用6.86.8乙醇溶液并用乙醇溶液并用草酸草酸調(diào)溶液的調(diào)溶液的pHpH為為2.52.53.03.0進(jìn)行提取。進(jìn)行提取。n從下面三個(gè)方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：從下面三個(gè)方面抑制了糜蛋白酶的水解活性： 6.8 6.8的乙醇可以使糜蛋白酶暫時(shí)失活的乙醇可以使糜蛋白酶暫時(shí)失活 草酸可以除去激活糜蛋白酶的草酸可以除去激活糜蛋白酶的CaCa2+2+； 選用選用pH2.5pH2.53.03.0，是糜蛋白酶不宜作用的，是糜蛋白酶不宜作用的pHpH值。值。n還可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。而對還可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。而對胰島

30、素的溶解和穩(wěn)定性都沒有影響。胰島素的溶解和穩(wěn)定性都沒有影響。 酶的主要提取方法酶的主要提取方法提取方法提取方法使用的溶劑或溶液使用的溶劑或溶液 提取對象提取對象鹽溶液提取鹽溶液提取酸溶液提取酸溶液提取堿溶液提取堿溶液提取有機(jī)溶劑提有機(jī)溶劑提取取0.020.020.5 mol/L0.5 mol/L的的鹽溶液鹽溶液pH2pH26 6的水溶液的水溶液pH8pH81212的水溶液的水溶液可與水混溶的有機(jī)可與水混溶的有機(jī)溶劑溶劑用于提取在低濃度鹽溶液中溶解用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶度較大的酶用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶用于提取在

31、稀堿溶液中溶解度大用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶且穩(wěn)定性較好的酶用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶含有較多非極性基團(tuán)的酶二、影響酶提取的主要因素二、影響酶提取的主要因素n分離純化蛋白質(zhì)的手段、方法都適于酶的分離、純化，分離純化蛋白質(zhì)的手段、方法都適于酶的分離、純化，而蛋白質(zhì)純化時(shí)要考慮的因素在酶提純時(shí)都要考慮。而蛋白質(zhì)純化時(shí)要考慮的因素在酶提純時(shí)都要考慮。在提純過程中要嚴(yán)格注意防止酶變性失效在提純過程中要嚴(yán)格注意防止酶變性失效。n主要影響因素：主要影響因素：酶在所使用的溶劑中的溶解度、酶向酶在所使用的溶劑中的溶解度、酶向溶劑中的擴(kuò)散速度

32、、溫度、溶劑中的擴(kuò)散速度、溫度、pHpH、提取液體積、鹽濃度、提取液體積、鹽濃度、污染物、保護(hù)劑污染物、保護(hù)劑n提取時(shí)應(yīng)注意：提取時(shí)應(yīng)注意：n1 1、溫度、溫度n為防止酶的變性失活，提取時(shí)溫度不宜高。特別是采用為防止酶的變性失活，提取時(shí)溫度不宜高。特別是采用有機(jī)溶劑提取時(shí)，整個(gè)提純操作應(yīng)盡可能在有機(jī)溶劑提取時(shí)，整個(gè)提純操作應(yīng)盡可能在低溫下低溫下（0 044）進(jìn)行。進(jìn)行。n在不影響酶的穩(wěn)定性的條件下，在不影響酶的穩(wěn)定性的條件下，適當(dāng)提高提取溫度適當(dāng)提高提取溫度，可，可以提高酶的擴(kuò)散速率，增加酶的溶解度，有利于酶的提以提高酶的擴(kuò)散速率，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。取。 n2、pH值值n酶提取液

33、的酶提取液的pH值首先應(yīng)保證在值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，為了增加酶的溶解度，提取時(shí)溶液的為了增加酶的溶解度，提取時(shí)溶液的pH值應(yīng)值應(yīng)遠(yuǎn)離酶遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)兩側(cè)的等電點(diǎn)兩側(cè)。n如：如：堿性蛋白質(zhì)應(yīng)選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿性蛋白質(zhì)應(yīng)選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。n不宜過酸和過堿。要避免在調(diào)整不宜過酸和過堿。要避免在調(diào)整pH時(shí)產(chǎn)生的時(shí)產(chǎn)生的局部酸、局部酸、堿過濃現(xiàn)象堿過濃現(xiàn)象。n3 3、提取液的體積、提取液的體積 提取液的用量增加可提高提取率。但過量的提取液，提取液的用量增加可提高

34、提取率。但過量的提取液，使酶濃度降低，對進(jìn)一步分離純化不利。故提取液的使酶濃度降低，對進(jìn)一步分離純化不利。故提取液的用量一般為含酶原料體積的用量一般為含酶原料體積的3-53-5倍倍。少量多次。少量多次。n4 4、鹽濃度、鹽濃度 在抽提過程中可選用合適濃度的鹽溶液以促進(jìn)蛋白質(zhì)在抽提過程中可選用合適濃度的鹽溶液以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解；但要注意當(dāng)溶解；但要注意當(dāng)鹽濃度過高鹽濃度過高時(shí)，酶容易變性。時(shí)，酶容易變性。n5 5、攪拌、攪拌 攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌溫和攪拌為宜，為宜，速度太快容易產(chǎn)生速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，增大了

35、與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。會引起酶等物質(zhì)的變性失活。 n6 6、其他污染、其他污染n（重金屬、微生物污染、蛋白酶重金屬、微生物污染、蛋白酶的存在等等）的存在等等） 在提純過程中應(yīng)盡可能防止微生物對酶的破壞。重金在提純過程中應(yīng)盡可能防止微生物對酶的破壞。重金屬能引起酶失活，微生物污染以及蛋白酶的存在會使酶屬能引起酶失活，微生物污染以及蛋白酶的存在會使酶分解破壞。分解破壞。 n7 7、添加保護(hù)劑、添加保護(hù)劑 為提高酶的穩(wěn)定性，防止酶變性失活，可以加入適為提高酶的穩(wěn)定性，防止酶變性失活，可以加入適量的量的酶作用底物酶作用底物或其或其輔酶輔酶，或加入某些，或加入某些抗氧化劑抗氧化劑等保

36、等保護(hù)劑。護(hù)劑。n提取時(shí)要注意防止由提取時(shí)要注意防止由蛋白水解酶蛋白水解酶引起的水解引起的水解 方法之一：降低溫度，方法之一：降低溫度，可防止蛋白水解酶的水解?？煞乐沟鞍姿饷傅乃狻?方法之二：較低方法之二：較低pHpH條件下，條件下，可降低蛋白質(zhì)水解酶引起可降低蛋白質(zhì)水解酶引起的破壞程度。低的破壞程度。低pHpH可使許多酶的酶原在提取過程中不可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。致激活而保留在酶原狀態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。n一些蛋白含一些蛋白含巰基巰基，這些巰基可能是活性所必需。在提取，這些巰基可能是活性所必需。在提取這種蛋白質(zhì)時(shí)不要帶入金屬離子和氧化劑。這種蛋

37、白質(zhì)時(shí)不要帶入金屬離子和氧化劑。方法一：方法一：可往提取液中加金屬螯合劑，如：可往提取液中加金屬螯合劑，如：EDTA方法二：方法二：可加入還原劑，如：可加入還原劑，如：抗壞血酸抗壞血酸 第三節(jié)第三節(jié) 沉淀分離沉淀分離n沉淀分離是通過改變某些條件，使溶液中某些溶質(zhì)的沉淀分離是通過改變某些條件，使溶液中某些溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其它溶溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其它溶質(zhì)分離。質(zhì)分離。 n凡是能破壞蛋白質(zhì)分子水化作用或減弱分子間同性相凡是能破壞蛋白質(zhì)分子水化作用或減弱分子間同性相斥作用的因子，都有可能降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度斥作用的因子，都有可能降低蛋白質(zhì)在水中的

38、溶解度而使它沉淀下來而使它沉淀下來。n根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，沉淀分離根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，沉淀分離法可分為：法可分為： （1 1）鹽析法）鹽析法 （2 2）有機(jī)溶劑沉淀法）有機(jī)溶劑沉淀法 （3 3）等電點(diǎn)沉淀法）等電點(diǎn)沉淀法 （4 4）選擇性變性沉淀法）選擇性變性沉淀法 一、鹽析沉淀法一、鹽析沉淀法n基本原理：基本原理： 中性鹽的親水性大于酶分子的親水性，加入大量中性鹽中性鹽的親水性大于酶分子的親水性，加入大量中性鹽后，奪走了水分子，后，奪走了水分子，破壞了水膜破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域；同，暴露出疏水區(qū)域；同時(shí)又時(shí)又中和了電荷中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)

39、分子即形成，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。沉淀。n蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強(qiáng)度有密蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強(qiáng)度有密切關(guān)系：切關(guān)系： log S = log S0 KsI n式中：式中： SS蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為I I時(shí)的溶解度（時(shí)的溶解度（g/Lg/L） S S0 0 酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0 0時(shí)（即在純?nèi)軇┲?，無時(shí)（即在純?nèi)軇┲?，無鹽溶液中）的溶解度（鹽溶液中）的溶解度（g/Lg/L） I I 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 K Ks s鹽析系數(shù)鹽析系數(shù) nK Ks s為鹽析系數(shù)，它與溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)，鹽的價(jià)數(shù)有關(guān)。為鹽析系

40、數(shù)，它與溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)，鹽的價(jià)數(shù)有關(guān)。nloglogS S0 0 是一個(gè)常數(shù)，如果用是一個(gè)常數(shù)，如果用表示它，鹽析方程可寫為：表示它，鹽析方程可寫為： loglogS S K Ks sI I K Ks s ：鹽析系數(shù)代表鹽析效率，決定于鹽的性質(zhì)，與酶結(jié)構(gòu)：鹽析系數(shù)代表鹽析效率，決定于鹽的性質(zhì)，與酶結(jié)構(gòu)有關(guān)；大小與離子價(jià)數(shù)成正比，與離子半徑和溶液的介電常數(shù)有關(guān)；大小與離子價(jià)數(shù)成正比，與離子半徑和溶液的介電常數(shù)成反比。成反比。 n ：主要決定于酶或蛋白的性質(zhì)，在溫度和主要決定于酶或蛋白的性質(zhì)，在溫度和pHpH值一定時(shí)，是值一定時(shí)，是常數(shù)。常數(shù)。 與離子濃度與離子濃度mi、離子價(jià)數(shù)、離子價(jià)數(shù)Zi有關(guān)。有

41、關(guān)。 I I1/21/2miZi2 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度I I ？ 計(jì)算計(jì)算0.2mol/L (NH4)2SO4的離子強(qiáng)度？的離子強(qiáng)度？ 分段鹽析分段鹽析 (fractional salting out) 蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需的蛋白質(zhì)沉淀時(shí)所需的pHpH值與離子強(qiáng)度也不相同，改變鹽的值與離子強(qiáng)度也不相同，改變鹽的濃度與溶液的濃度與溶液的pHpH值，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。值，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。nKsKs分段鹽析：分段鹽析：在一定的溫度和在一定的溫度和pHpH值條件下（值條件下（為常數(shù)），為常數(shù)），通過通過改變離子強(qiáng)度改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。使不同的酶或蛋白質(zhì)

42、分離的方法。 n分段鹽析：分段鹽析：在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（KsKs、I I為為常數(shù)），通過常數(shù)），通過改變溫度和改變溫度和pHpH值值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。的方法。n常用的鹽析劑常用的鹽析劑: : 硫酸銨硫酸銨n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：鹽析能力強(qiáng)，在水中溶解度最大（鹽析能力強(qiáng)，在水中溶解度最大（2525時(shí)為時(shí)為4.1mol/L4.1mol/L），而溫度系數(shù)最小（對溫度不敏感），價(jià)），而溫度系數(shù)最小（對溫度不敏感），價(jià)格便宜，濃度高時(shí)也不會引起蛋白質(zhì)和酶生物活性的格便宜，濃度高時(shí)也不會引起蛋白質(zhì)和酶生物活性的喪失，抽提效果好。喪失，抽提

43、效果好。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：緩沖能力差，緩沖能力差，NHNH4 4的存在干擾的存在干擾pr.pr.的測定，得到的測定，得到的樣品欲繼續(xù)純化時(shí)，需花一定時(shí)間脫鹽。的樣品欲繼續(xù)純化時(shí)，需花一定時(shí)間脫鹽。 n方法：先將固體硫酸銨研成細(xì)粉，在攪拌下方法：先將固體硫酸銨研成細(xì)粉，在攪拌下緩慢均勻少緩慢均勻少量多次地加入量多次地加入，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢，接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀白質(zhì)沉淀。n鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心離心

44、與與過濾過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法度硫酸銨常用過濾方法 （高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要（高濃度硫酸銨密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速度和較長的離心時(shí)間）較高的離心速度和較長的離心時(shí)間） n注意：注意： 鹽析時(shí)鹽析時(shí)pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至待沉淀的酶蛋白等電點(diǎn)附近，因值應(yīng)調(diào)節(jié)至待沉淀的酶蛋白等電點(diǎn)附近，因?yàn)檫_(dá)到等電點(diǎn)為達(dá)到等電點(diǎn)pH時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小。n硫酸銨濃度的表示方法：硫酸銨濃度的表示方法： 是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度，而不是以飽和溶液的百分

45、數(shù)表示，稱為百分飽和度，而不用實(shí)際的克數(shù)或克分子數(shù)。用實(shí)際的克數(shù)或克分子數(shù)。n飽和度飽和度n飽和硫酸銨制備飽和硫酸銨制備 達(dá)到一定飽和度（達(dá)到一定飽和度（NH4）2SO4的加入量：的加入量：ng (g/ 升)= ng = 213 .0100)(5332sss2213.0100)(541sss（20)（25)S1：達(dá)到的百分飽和度；：達(dá)到的百分飽和度；S1：原溶液中的百分飽和度：原溶液中的百分飽和度g: 一升溶液中需要加入固體（一升溶液中需要加入固體（NH4）2SO4的克數(shù)的克數(shù) 鹽析曲線的制作鹽析曲線的制作n 用鹽析法沉淀欲分離樣品時(shí)，所需濃度范圍要通用鹽析法沉淀欲分離樣品時(shí)，所需濃度范圍要通

46、過試驗(yàn)確定。過試驗(yàn)確定。 n 步驟：步驟：抽提液（調(diào)好抽提液（調(diào)好pHpH值）值） 離心得上清液離心得上清液 得到得到6-106-10個(gè)分級沉淀部分。個(gè)分級沉淀部分。第一次加到渾濁次加鹽分106 硫酸銨分級試驗(yàn)硫酸銨分級試驗(yàn)批次批次 百分飽和百分飽和 酶沉淀酶沉淀/% pr.沉淀沉淀/% 純化倍數(shù)純化倍數(shù) 度范圍度范圍/% （得率）（得率）n第一次第一次 040 4 25 4060 62 22 2.8 6080 32 32 1.0n第二次第二次 045 6 32 4570 90 38 2.4n第三次第三次 048 10 35 486575 25 3.0 n純化倍數(shù)純化倍數(shù)=每步的比活力每步的比

47、活力/粗抽提液的比活力粗抽提液的比活力n收得率收得率=每步的總活力每步的總活力/粗抽提液總活力粗抽提液總活力100%n酶在酶在40%60%鹽中沉淀比在鹽中沉淀比在60%80%的多；要改的多；要改試試45%70%。n45%70%鹽中收得率高，但純度降低，要改試鹽中收得率高，但純度降低，要改試48%65%。 從上表分析：從上表分析：n若生物材料來源容易，主要考慮純化倍數(shù)，選擇若生物材料來源容易，主要考慮純化倍數(shù)，選擇48%65%。 n材料來源困難，則要考慮收得率，則選擇材料來源困難，則要考慮收得率，則選擇45%70%。 二、有機(jī)溶劑沉淀法二、有機(jī)溶劑沉淀法 基本原理：基本原理：（1 1）有機(jī)溶劑）

48、有機(jī)溶劑降低了降低了溶液的溶液的介電常數(shù)介電常數(shù)，減小溶劑的極性，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。降低而沉淀。（2 2）有機(jī)溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時(shí)從蛋）有機(jī)溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。，因而發(fā)生沉淀作用。 有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)：有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)：n分辨能力比

49、鹽析法高分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。n沉淀有機(jī)溶劑可回收、易除去，得到的沉淀易于離沉淀有機(jī)溶劑可回收、易除去，得到的沉淀易于離心分離或過濾，心分離或過濾，過濾比較容易（也可用透析袋脫有機(jī)過濾比較容易（也可用透析袋脫有機(jī)溶劑），在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。溶劑），在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。n不含無機(jī)鹽，不用脫鹽不含無機(jī)鹽，不用脫鹽。適用于食品工業(yè)中酶制劑。適用于食品工業(yè)中酶制劑的制備。的制備。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)： n對某些具有生物活性的大分子容易引起對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失

50、活變性失活，操，操作需在作需在低溫低溫下進(jìn)行。沉淀析出后要盡快分離，盡量減下進(jìn)行。沉淀析出后要盡快分離，盡量減少有機(jī)溶劑對酶活力的影響。少有機(jī)溶劑對酶活力的影響。n注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：n在在低溫下低溫下操作，一般在操作，一般在00左右。因?yàn)樽笥摇Ｒ驗(yàn)闇囟仍降?，溫度越低，沉淀亦越完全。沉淀亦越完全。有機(jī)溶劑要預(yù)冷，所得沉淀要盡快低有機(jī)溶劑要預(yù)冷，所得沉淀要盡快低溫離心并立即用冷緩沖液溶解以降低有機(jī)溶劑濃度。溫離心并立即用冷緩沖液溶解以降低有機(jī)溶劑濃度。 pHpH值調(diào)至待分離酶的等電點(diǎn)附近有助于沉淀效果。值調(diào)至待分離酶的等電點(diǎn)附近有助于沉淀效果。n有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀pr.pr.時(shí)，宜在時(shí)，宜

51、在稀鹽溶液或低濃度緩稀鹽溶液或低濃度緩沖液沖液中進(jìn)行。中進(jìn)行。 加入適量加入適量中性鹽中性鹽能增加能增加pr.pr.在有機(jī)溶劑中的溶解在有機(jī)溶劑中的溶解度，降低有機(jī)溶劑對度，降低有機(jī)溶劑對pr.pr.的變性作用，提高分級效果。的變性作用，提高分級效果。但是過量加入，可引起但是過量加入，可引起pr.pr.析出，影響有機(jī)溶劑的分級析出，影響有機(jī)溶劑的分級作用。作用。n沉淀的能力比較：沉淀的能力比較：丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇甲醇。n丙酮沉淀能力最好，但揮發(fā)損失多，價(jià)格較貴，丙酮沉淀能力最好，但揮發(fā)損失多，價(jià)格較貴，工業(yè)上通常采用工業(yè)上通常采用乙醇乙醇作為沉淀劑。作為沉淀劑。 三、等電點(diǎn)沉淀法三、等電

52、點(diǎn)沉淀法n由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ挠捎谠S多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉蛋白質(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想想，因而此法常與，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。 四、復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀法）四、復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀法）n在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物沉淀，再在酶液中加入某

53、些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物沉淀，再用適當(dāng)方法使待分離酶溶解出來（選擇性抽提），從而用適當(dāng)方法使待分離酶溶解出來（選擇性抽提），從而除去沉淀劑，達(dá)到分離純化目的。除去沉淀劑，達(dá)到分離純化目的。n酶（蛋白質(zhì)）沉淀劑酶（蛋白質(zhì)）沉淀劑: 能與酶形成復(fù)合物沉淀的物質(zhì)。能與酶形成復(fù)合物沉淀的物質(zhì)。n如：聚丙烯酸可沉淀帶正電蛋白質(zhì)。聚丙烯酸分子上如：聚丙烯酸可沉淀帶正電蛋白質(zhì)。聚丙烯酸分子上有相當(dāng)多的羧基，堿性蛋白質(zhì)含較多的堿性基團(tuán)，羧有相當(dāng)多的羧基，堿性蛋白質(zhì)含較多的堿性基團(tuán)，羧基和堿性基團(tuán)形成鹽鍵，則把聚丙烯酸和堿性蛋白質(zhì)基和堿性基團(tuán)形成鹽鍵，則把聚丙烯酸和堿性蛋白質(zhì)結(jié)合而形成很大顆粒沉淀下來。結(jié)合而

54、形成很大顆粒沉淀下來。n在沉淀中加入鈣離子后，生成聚丙烯酸鈣鹽，蛋白質(zhì)在沉淀中加入鈣離子后，生成聚丙烯酸鈣鹽，蛋白質(zhì)則游離出來，從而使蛋白質(zhì)純化。則游離出來，從而使蛋白質(zhì)純化。 PAA（聚丙烯酸）（聚丙烯酸） E PAA-E PAA-E + Ca2 PAA-Ca E PAA-Ca H2SO4 PAA + CaSO4 五、選擇性變性沉淀法五、選擇性變性沉淀法n選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需酶的分離方法。沉淀，而不影響所需酶的分離方法。 熱變性熱變性 利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度利用生物大分子對熱的

55、穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀。使某些非目的生物大分子變性沉淀。 此方法最為簡便，不需消耗任何試劑，但此方法最為簡便，不需消耗任何試劑，但分離效率分離效率較低，通常用于生物大分子的較低，通常用于生物大分子的初期初期分離純化。分離純化。 表面活性劑和有機(jī)溶劑變性表面活性劑和有機(jī)溶劑變性 不同蛋白質(zhì)和酶等對于表面活性劑和有機(jī)溶劑的不同蛋白質(zhì)和酶等對于表面活性劑和有機(jī)溶劑的敏感性不同，在分離純化過程中使用它們可以使那些敏感性不同，在分離純化過程中使用它們可以使那些敏感性強(qiáng)的敏感性強(qiáng)的雜蛋白雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。 通常都在通常都在

56、冰浴或冷室冰浴或冷室中進(jìn)行，以保護(hù)目的物的生物中進(jìn)行，以保護(hù)目的物的生物活性?；钚浴?n 選擇性酸堿變性選擇性酸堿變性 利用蛋白質(zhì)和酶等對于溶液中利用蛋白質(zhì)和酶等對于溶液中酸堿酸堿的穩(wěn)定性不同的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀而使雜蛋白變性沉淀 通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的一個(gè)分離純化通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的一個(gè)分離純化步驟。步驟。 沉淀分離方法沉淀分離方法沉淀分離法沉淀分離法分離原理分離原理鹽析沉淀法鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中中性鹽性鹽，使酶或

57、雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的通過調(diào)節(jié)溶液的pHpH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶

58、與雜質(zhì)分離沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離沉淀分離法沉淀分離法分離原理分離原理復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉選擇性變性沉淀法淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不斷影響所需的酶，從而使變性沉淀，而不斷影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離酶與雜質(zhì)分離 第四節(jié)第四節(jié) 離心分離離心分離n離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。同

59、大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。一、離心機(jī)的選擇一、離心機(jī)的選擇分類：分類：（1 1）按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同可分為：常速（低速）、高速和超）按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同可分為：常速（低速）、高速和超速速（2 2）按用途分：工業(yè)或?qū)嶒?yàn)型，分析或制備型）按用途分：工業(yè)或?qū)嶒?yàn)型，分析或制備型 （有分析用、制備用、分析制備兩用）（有分析用、制備用、分析制備兩用）（3 3）按使用溫度分：常溫或冷凍）按使用溫度分：常溫或冷凍（4 4）按分離形式可分為：沉降法和過濾法兩大類）按分離形式可分為：沉降法和過濾法兩大類（5 5）按操作方式有間歇、連續(xù)和半連續(xù)之分）按操作方式有間歇、連續(xù)和半連續(xù)之分（6 6）按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)則有管

60、式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式等多種。）按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)則有管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式等多種。 1、常速離心機(jī)、常速離心機(jī)n常速離心機(jī)又稱低速離心機(jī)。常速離心機(jī)又稱低速離心機(jī)。 最大轉(zhuǎn)速在最大轉(zhuǎn)速在8000r/min8000r/min以內(nèi)，以內(nèi)， 相對離心力相對離心力(RCF)(RCF)在在1 110104 4g g以下。以下。 在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)上廣泛應(yīng)用。主要用于分離細(xì)胞、在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)上廣泛應(yīng)用。主要用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝铮灿糜诖纸Y(jié)晶細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝?，也用于粗結(jié)晶等較大顆粒的分離。等較大顆粒的分離。 2、高速離心機(jī)、高速離心機(jī)n轉(zhuǎn)速從轉(zhuǎn)速從11042.5104r/m