1、蛋白質(zhì)芯片研討進(jìn)展高 雁指點(diǎn)教師：林炳承 研討員Seminar I.內(nèi)容提要蛋白質(zhì)芯片概述蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵技術(shù)蛋白質(zhì)芯片的運(yùn)用展望.蛋白質(zhì)芯片的定義生物芯片基因芯片蛋白質(zhì)芯片微流控芯片蛋白質(zhì)芯片, 又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的外表構(gòu)成微陣列；用標(biāo)志了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。 proteinmicroarrays/ Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822.Bertone P,et a

2、l., FEBS Journal, 2005, 272 , 54005411.研討蛋白質(zhì)芯片的意義蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的最終產(chǎn)物, 接近生命活動(dòng)的物質(zhì)層面； 探針蛋白特異性高、親和力強(qiáng), 可簡(jiǎn)化樣品前處置，甚至可直接利用生物資料(血樣、尿樣、細(xì)胞及組織等)進(jìn)展檢測(cè)；適宜高通量挑選與靶蛋白作用的化合物；有助于了解藥物或毒物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用。.蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片蛋白質(zhì)功能芯片 蛋白質(zhì)芯片的分類Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161170.蛋白質(zhì)芯片的關(guān)鍵技術(shù)提出生物學(xué)問題實(shí)驗(yàn)?zāi)康臉悠奉A(yù)處置重組蛋白，

3、制備一、二級(jí)抗體，熒光標(biāo)志，配蛋白印記緩沖液生化反響化學(xué)巧合，加底物，反響溫度和時(shí)間，沖洗條件檢測(cè)熒光和比色掃描或拍照，參數(shù)設(shè)置數(shù)據(jù)分析和建模圖象量化，規(guī)范化，采集蛋白信息，建立模型12345蛋白質(zhì)芯片制備6Schena M, Protein microarrays,2005, 7.蛋白質(zhì)芯片的制備固相載體及其處置 載體滴定板、濾膜、凝膠、載玻片 蛋白質(zhì)的預(yù)處置 選擇具有較高純度和完好生物活性的蛋白進(jìn)展溶解點(diǎn)制微陣列 可運(yùn)用點(diǎn)制基因微陣列的商品化點(diǎn)樣儀或噴墨法等固定微陣列上的蛋白樣點(diǎn) 膜為載體：芯片放入濕盒， 37C 1h 載玻片為載體：化學(xué)修飾產(chǎn)生醛 基固定蛋白微陣列的封鎖主要封鎖試劑：BS

4、A或Gly李瑤，基因芯片與功能基因組，2004，32-33.蛋白質(zhì)芯片比較 外表 蛋白固定方式 優(yōu)點(diǎn) 缺陷 PVDF 吸附 無需蛋白修飾過程，高結(jié)合容量 非特異吸附，分布隨機(jī)Nitrocellulose 吸附 無需蛋白修飾過程，高結(jié)合容量 非特異吸附，高背景，低密度 無需蛋白修飾過程，高密度， 非特異吸附，分布隨機(jī) 高分辨檢測(cè)Epoxy-activated 高密度，高分辨檢測(cè) 分布隨機(jī)，外表有吸附PDMS nanowell 高密度，適宜復(fù)雜的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，易與SPR或MS 聯(lián)用 分布隨機(jī)，制造難，未商品化Avidin coated 親和結(jié)合

5、蛋白銜接強(qiáng)度高、特異和高密度，低背景 蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 親和結(jié)合 蛋白銜接強(qiáng)度高、特異和高密度，低背景 蛋白需His x6標(biāo)志 外表蛋白分布均一容量Agarose thin film 制造難，未商品化3D gel pad吸附，共價(jià)偶聯(lián)Poly-lysine coatedAldehyde-coated共價(jià)偶聯(lián)分散 無需蛋白修飾過程，高結(jié)合容量 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology,2003,7,55-63.蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)探針標(biāo)志檢測(cè)法無探針標(biāo)志檢測(cè)法外表加強(qiáng)激光解吸離子化技術(shù)(Surface enhanced

6、laser desorption/ionization, SELDI)外表等離子體共振檢測(cè)技術(shù)surface plasmon resonance, SPR原子力顯微鏡檢測(cè)技術(shù)atomic force microscope, AFM 同位素標(biāo)志檢測(cè)熒光標(biāo)志檢測(cè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)酶免疫標(biāo)志檢測(cè)膠體金標(biāo)志檢測(cè).蛋白質(zhì)芯片的運(yùn)用疾病診斷和預(yù)警藥物開發(fā) 蛋白質(zhì)組學(xué) .定量檢測(cè)組織提取液中的腫瘤標(biāo)志物Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436.孵育后的微陣列熒光圖 A 含抗原 B 無抗原微陣列方法與ELISA方法檢出結(jié)果比較疾病診斷uPA 尿激酶型纖溶酶原激活因子P

7、AI-1血漿纖溶酶原激活因子抑制因子VEGT 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子.高通量挑選蛋白-蛋白作用抑制劑藥物開發(fā)Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431.A 1500 個(gè)點(diǎn)陣的微陣列B 部分點(diǎn)陣放大圖及SPR信號(hào)His6-RB/GST-E7相互作用抑制劑挑選微陣列圖參與His6-RB參與含 PepC抑制劑的His6-RB. 人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞蛋白譜Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280.蛋白質(zhì)組學(xué)提示了oxidized low density lipoprotein誘導(dǎo)人動(dòng)脈平

8、滑肌細(xì)胞的作用方式細(xì)胞經(jīng)oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白譜檢出298個(gè)蛋白54個(gè)蛋白表達(dá)量發(fā)生變化4.7% 抗原一組細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用分子表達(dá)上調(diào)；13.4%抗原構(gòu)造蛋白，體液呼應(yīng)蛋白表達(dá)下降.存在的問題本錢過高, 需一系列昂貴的尖端儀器芯片的規(guī)范化問題 提高芯片的特異性、簡(jiǎn)化樣品制備和標(biāo)志操作程序、添加信號(hào)檢測(cè)的靈敏度和消除芯片背景對(duì)于結(jié)果分析的影響等等.展望蛋白質(zhì)芯片未來的開展重點(diǎn) 建立快速、廉價(jià)、高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化方法，高通量制備抗體并定義每種抗體的親和特異性。 改良基質(zhì)資料的外表處置技術(shù)以減少蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合。提高芯片制造的點(diǎn)陣速

9、度；提供適宜的溫度和濕度以堅(jiān)持芯片外表蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及生物活性。研討通用的高靈敏度、高分辨率檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)成像與數(shù)據(jù)分析一體化。 .參考文獻(xiàn)1 Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822.2 Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 54005411.3 Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161170.4 李瑤，基因芯片與功能基因組，2004，32-335 Zhu H et.al, Current Opinion in c

10、hemical Biology, 2003,755-63.6 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436.7 Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991.8 Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280.9 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431.10 Schena M, Protein microarrays,2005, 7.謝謝！.蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)信號(hào)的提高Sauera U，e

11、t al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178183.優(yōu)化芯片制造過程各種參數(shù)；運(yùn)用金粒子作為輔助標(biāo)志分子；添加SiO2和TiO2層提高外表反射Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片Au 的尺寸及其與Dy633的比例 對(duì)信號(hào)的影響 5 nm Au-particle10 nm Au-particle.Protein Microarray SystemThe Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis. TeleChem / arrayit arrayit It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-protein, antibody-ant