1、福莫特羅對(duì)哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生及粘蛋白MUC5ac mRNA表達(dá)的影響 作者：張蔚， 譚艷芳， 江山*， 陳茗， 梁瑞韻， 呂志強(qiáng)【摘要】 【目的】 探討長(zhǎng)效2受體激動(dòng)劑福莫特羅對(duì)哮喘(支氣管哮喘)小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生及粘蛋白MUC5ac mRNA表達(dá)的影響。【方法】 40只雌性SPF級(jí)BABL/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組10只。A組為生理鹽水對(duì)照組;B組為卵蛋白(ovalbumin，OVA)哮喘組;C組為哮喘福莫特羅干預(yù)組;D組為哮喘地塞米松干預(yù)組。在末次激發(fā)24 h后所有小鼠取左肺組織行過碘酸雪夫(PAS)染色，采用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定支氣管上皮杯狀細(xì)胞面積占上皮細(xì)胞總面積的百分比并計(jì)

2、算杯狀細(xì)胞數(shù)量。取右肺組織行real-time qRT-PCR，檢測(cè)粘蛋白MUC5ac mRNA的表達(dá)?！窘Y(jié)果】 B組小鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量、杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞總面積的百分比和MUC5ac mRNA水平顯著高于A組(163.63 16.68)個(gè)vs (0.46 0.16)個(gè)，(77.36 5.05)% vs (0.03 0.01)%，(10.31 0.73) vs ( 1.00 0.13)，P均 0.05;C組小鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量、杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞總面積的百分比和MUC5ac mRNA水平均低于B組(52.04 4.60)個(gè) vs (163.63 16.68)個(gè)，(30.05

3、3.72)% vs (77.36 5.05)%，(1.64 0.14) vs (10.31 0.73)，P均 0.05 ;D組小鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量、杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞總面積的百分比和MUC5ac mRNA水平均低于B組(63.41 6.39)個(gè) vs (163.63 16.68)個(gè)，(38.52 3.83)% vs(77.36 5.05)%，(1.72 0.10) vs (10.31 0.73)，P均 0.05?！窘Y(jié)論】 長(zhǎng)效2受體激動(dòng)劑福莫特羅可抑制哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生及粘蛋白MUC5ac mRNA的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 哮喘; 福莫特羅; 杯狀細(xì)胞; MUC5ac mRNA; 小

4、鼠Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of long-acting 2-adrenoceptor agonist formoterol on airway goblet cell hyperplasia and protein MUC5ac mRNA expression in asthmatic mice. 【Methods】 Forty female BABL/c mice were randomly divided into four groups with 10 mice in each. Mice in group A we

5、re treated with saline as control， and mice in group B， group C， and group D were sensitized by OVA to establish asthmatic model， but group C were pretreated with formoterol and group D were pretreated with dexamethasone. All mice were killed 24 hours after the final OVA challenged. The left lung ti

6、ssue sections were stained with periodic acid Schiff (PAS) for identification of goblet cell hyperplasia. The right lung was isolated for detecting MUC5ac mRNA by the method of real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (real-time qRT-PCR). 【Results】 The numb

7、er of the goblet cell， the percentage of goblet cell to total cell and the expression of MUC5ac mRNA in group B were significant higher than those of group A (163.63 16.68) vs (0.46 0.16)， (77.36 5.05)% vs (0.03 0.01)%， (10.31 0.73) vs (1.00 0.13)， P 98%，美國Sigma公司);福莫特羅(阿斯利康制藥有限公司);氫氧化鋁(廣州化學(xué)試劑廠);熒光定

8、量試劑盒(QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit)。1.1.3 設(shè) 備霧化器(boy037G6000型，德國Pari公司)、凝膠電泳槽(美國Bio-Rad公司)、熒光定量分析儀(FTC-2000A)、image-pro plus6.0圖像分析軟件(美國MediaCybernetics公司)、Nikon TE2000-U倒置顯微鏡(日本 尼康公司)。1.2 方 法1.2.1 哮喘模型的建立40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(A組)、哮喘組(B組)、福莫特羅干預(yù)組(C組)和地塞米松干預(yù)組(D組)共4組，每組10只。哮喘組(B組)、福莫特羅干預(yù)組(C組)和地塞米

9、松干預(yù)組(D組)均在第1和第14天分別腹腔注射0.2 mL致敏液(OVA 10 g + 氫氧化鋁20 g)進(jìn)行致敏，從第21天起將小鼠置于約0.5 m 0.5 m 0.5 m大小的霧化吸入箱中進(jìn)行激發(fā)，通過超聲霧化器霧化吸入2.5% OVA溶液5 mL，每次30 min，每周3次，連續(xù)6周。福莫特羅干預(yù)組(C組)于每次霧化激發(fā)哮喘前10 min腹腔注射福莫特羅1 mg/kg，地塞米松干預(yù)組(D組)在每次霧化激發(fā)哮喘前30 min腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg。生理鹽水對(duì)照組(A組)以生理鹽水代替OVA溶液腹腔注射致敏和霧化吸入激發(fā)。1.2.2 標(biāo)本收集末次霧化吸入24 h后，以10 g/L

10、戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，結(jié)扎右肺主支氣管，遠(yuǎn)端切斷支氣管后取右肺組織置于液氮罐中保存以備抽提mRNA。1 mL注射器注入左主支氣管，以20 cmH2O (1 cmH2O = 0.098 kPa)壓力灌注40 g/L的多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液入左肺，切取左肺并浸泡于40 g/L多聚甲醛-磷酸緩沖液中24 h。1.2.3 氣道上皮杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)肺組織40 g/L多聚甲醛-磷酸緩沖液固定后，常規(guī)脫水包埋，行過碘酸-雪夫(PAS)染色。每只小鼠隨機(jī)選5張肺組織切片，每張切片以單盲法隨機(jī)選取橫斷面較圓、直徑100 m的支氣管5支進(jìn)行觀察，采用image-pro plus6.0圖像分析軟

11、件測(cè)量每張切片支氣管上皮中被染成紫紅色的杯狀細(xì)胞的面積，以其占所在支氣管上皮總細(xì)胞面積的百分比表示，并計(jì)算杯狀細(xì)胞數(shù)量。1.2.4 real-time PCR檢測(cè)肺組織粘蛋白MUC5ac mRNA 的表達(dá)水平引物由上海吉瑪生物工程公司設(shè)計(jì)并合成。MUC5ac引物序列：上游引物：5-ACCACTTTCTCCTTCTCCACAC-3，下游引物：5-AACAGGGCTCTTCACAGACAATA-3產(chǎn)物長(zhǎng)度：150 bp;18s mRNA為內(nèi)參照物。取液氮保存的肺組織，Trizol一步法提取總RNA，再采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，置-20 冰箱備用。采用SYBR Green熒光染料

12、法經(jīng)預(yù)變性、變性、退火、延伸和再延伸等共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，整個(gè)過程收集熒光。使各組內(nèi)每樣本與內(nèi)參18s mRNA擴(kuò)增效率相同，采用2-Ct法5計(jì)算樣本的原始拷貝數(shù)，分別擴(kuò)增MUC5ac mRNA和18s mRNA，每樣本作3復(fù)孔。利用相應(yīng)軟件獲得各組樣本與內(nèi)參18S mRNA相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，計(jì)算樣本Ct值(即在PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))、Ct值(同一樣本中，待檢基因與內(nèi)參基因平均Ct值的差值)和Ct值(其余樣品的Ct值和對(duì)照樣本相應(yīng)基因的Ct值之差)，最終得出2-Ct值(相對(duì)于參考因子基因表達(dá)的倍數(shù))以獲得四組間MUC5ac mRNA的相對(duì)定量比

13、較，即以A組(生理鹽水對(duì)照組)為參照，其余各組的MUC5ac mRNA相對(duì)表達(dá)量用參照組的2-Ct倍表示，并繪制相應(yīng)柱狀圖。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以 x s 表示，數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，各組計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法。P 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩變量的相關(guān)分析采用等級(jí)Pearson相關(guān)法。2 結(jié) 果2.1 氣道上皮杯狀細(xì)胞增生情況分析觀察PAS染色病理片，4組小鼠氣道上皮被染為紫紅色的杯狀細(xì)胞數(shù)量存在差別(圖1)。圖像分析結(jié)果顯示A組與B組、C組和D組杯狀細(xì)胞數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 163.17、51.58、62.9

14、6，P 0.05);C組和D組顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 111.59、100.22，P 0.05);杯狀細(xì)胞面積占上皮細(xì)胞總面積百分比LSD-t檢驗(yàn)顯示：A組與B組、C組和D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 77.33、30.02、38.50，P 0.05);C組和D組顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 47.31、38.84，P 0.05;表1)。2.2 肺組織的MUC5ac mRNA的轉(zhuǎn)錄水平利用相應(yīng)軟件分別獲得各組樣本與內(nèi)參18S mRNA相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線(圖2)，以生理鹽水對(duì)照組(A組)為定標(biāo)，分別計(jì)算得生理鹽水組(A組)、哮喘組(B組)、福莫特羅干預(yù)組(C組)和地塞米

15、松干預(yù)組(D組)的Ct值、Ct值和Ct值，最后算出2-Ct值(表2)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析B、C、D組的MUC5ac mRNA水平均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.31、0.65，0.72，P 0.05);B組的轉(zhuǎn)錄水平高于C、D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 8.66、8.60，P 0.05)。繪制相應(yīng)柱狀圖(圖3)。2.3 相關(guān)性分析粘蛋白MUC5ac mRNA的表達(dá)水平與支氣管杯狀細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)(r = 0.878;P 0.01)。3 討 論氣道粘液的高分泌性是哮喘重要的病理生理特征之一，不僅可導(dǎo)致氣道的阻塞，使呼吸道感染難以控制，而且是導(dǎo)致哮喘惡化、致死性哮喘發(fā)生的主要原因6。研究表明

16、杯狀細(xì)胞與氣道粘液的分泌有關(guān)，是氣道粘液主要的產(chǎn)生和分泌細(xì)胞7。哮喘時(shí)氣道上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，發(fā)生明顯的肥大改變，杯狀細(xì)胞增生已構(gòu)成哮喘氣道重塑的一個(gè)重要方面2。本研究采用Temelkovski8經(jīng)典方法建立小鼠哮喘模型，通過對(duì)氣道上皮的病理染色后發(fā)現(xiàn)哮喘組(B組)小鼠氣道杯狀細(xì)胞面積占上皮細(xì)胞總面積的百分比及杯狀細(xì)胞的數(shù)量與生理鹽水對(duì)照組(A組)對(duì)比升高有顯著性差異，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，存在杯狀細(xì)胞增生的改變。氣道粘液的高分泌性還表現(xiàn)在黏蛋白的分泌增多，高分子糖基化的黏蛋白粘液素(mucin，MUC)是影響氣道粘液彈性和粘附性的最主要成分，其中粘液素MUC5ac蛋白是表達(dá)于成人呼吸道

17、中的主要黏蛋白，且哮喘氣道出現(xiàn)明顯的杯狀細(xì)胞增生的同時(shí)，肺組織中的MUC5ac蛋白和MUC5ac mRNA表達(dá)水平也明顯升高，證明黏蛋白MUC5ac和MUC5ac mRNA的表達(dá)水平是哮喘氣道杯狀細(xì)胞增生和分泌亢進(jìn)的主要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杯狀細(xì)胞增生明顯的哮喘組(B組)小鼠與生理鹽水對(duì)照組(A組)比較，其肺組織MUC5ac mRNA的水平升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，在杯狀細(xì)胞與黏蛋白MUC5ac mRNA表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性分析中兩者呈正相關(guān)，證明了杯狀細(xì)胞的增生與黏蛋白MUC5ac mRNA水平的表達(dá)存在聯(lián)系，均與文獻(xiàn)報(bào)道一致。由此可見，抑制杯狀細(xì)胞增生和黏蛋白MUC5ac mRNA的表達(dá)可

18、有效控制氣道的高分泌性，對(duì)預(yù)防和治療哮喘具有重要意義。福莫特羅是一種常用的長(zhǎng)效2受體激動(dòng)劑，具有選擇性高、起效快、作用強(qiáng)、全身副作用小、安全性高等作用特點(diǎn)，已被證明能有效地預(yù)防和控制哮喘的發(fā)作。目前關(guān)于福莫特羅對(duì)哮喘氣道作用機(jī)制方面多著重于其擴(kuò)張支氣管和抗炎作用等方面，而對(duì)于其是否對(duì)哮喘氣道粘液的高分泌性有影響，即對(duì)哮喘氣道杯狀細(xì)胞增生和黏蛋白MUC5ac mRNA表達(dá)水平的作用的研究在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道，但Kaur等12研究表明福莫特羅可控制炎癥基因的表達(dá)，Maneechotesuwan等13研究發(fā)現(xiàn)福莫特羅可降低哮喘患者痰中IL-8和中性粒細(xì)胞的數(shù)量，有效抑制炎癥介質(zhì)的釋放;同時(shí)，Ba

19、sbaum等14研究表明，多種炎癥介質(zhì)的釋放均可誘發(fā)氣道上皮杯狀細(xì)胞的增生和黏蛋白基因表達(dá)水平的提高，因此福莫特羅對(duì)哮喘氣道杯狀細(xì)胞增生和黏蛋白基因表達(dá)有抑制作用在機(jī)制上存在可能。本研究通過腹腔注射福莫特羅的方法對(duì)哮喘小鼠進(jìn)行干預(yù)，研究結(jié)果表明哮喘福莫特羅干預(yù)組(C組)小鼠氣道的杯狀細(xì)胞數(shù)量、杯狀細(xì)胞占?xì)獾郎掀た偯娣e的百分比水平和肺組織MUC5ac mRNA水平均顯著低于未干預(yù)的哮喘組(B組)小鼠，提示福莫特羅在降低哮喘小鼠的氣道粘液分泌方面亦可發(fā)揮一定的作用，其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。地塞米松是一種常用的糖皮質(zhì)激素，國內(nèi)外研究15-16均證明其對(duì)哮喘氣道的杯狀細(xì)胞增生及MUC5ac mRN

20、A的表達(dá)有抑制作用。本研究中地塞米松干預(yù)組(D組)小鼠在氣道上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量、杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞總面積的百分比和MUC5ac mRNA水平均顯著低于哮喘組(B組)小鼠，與文獻(xiàn)報(bào)道一致;福莫特羅干預(yù)組(C組)小鼠氣道上皮杯狀細(xì)胞的數(shù)量、杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞總面積的百分比和MUC5ac mRNA水平與地塞米松干預(yù)組(D組)對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示福莫特羅抑制哮喘小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生和粘液素分泌的作用與地塞米松相似。對(duì)人類哮喘氣道，福莫特羅是否具有類似作用尚需進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 Evans CM， Koo JS. Airway mucus： The good， the bad， the stic

21、ky J. Pharmacol Ther， 2009， 121(3)：332-348.Siddiqui S， Martin JG. Structural aspects of airway remodeling in asthma J. Curr Allergy Asthma Rep， 2008， 8(6)： 540-547.Ordonez CL， Khashayar R， Wong HH， et al. Mild and moderate asthma is associated with airway goblet cell hyperplasia and abnormalities in

22、 mucin gene expression J. Am J Respir Crit Care Med， 2001， 163(2)： 517-523.Evans CM， Kim K， Tuvim MJ， et al. Mucus hypersecretion in asthma： causes and effects J. Curr Opin Pulm Med， 2009， 15(1)： 4-11.Kenneth J， Livak TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and

23、 the 2-Ct method J. Method， 2001， 25(9)： 402-408.Hays SR， Fahy JV. The role of mucus in fatal asthma J. Am J Med， 2003， 115(1)： 68-69.Ficker JH. Physiology and pathophysiology of bronchial secretion J. Pneumologie， 2008， 62 suppl 1： S11-13.Temelkovski J， Hogan SP， Shephered DP， et al. An improved mu

24、rine model of asthma： selective airway inflammation， epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen J. Thorax， 1998， 53(10)： 849-856.Kirkham S， Sheehan JK， Knight D， et al. Heterogeneity of airways mucus： variations in the amounts and

25、glycoforms of the major oligomeric mucins MUC5AC and MUC5B J. Biochem J， 2002， 361(pt 3)： 537-546.Zuhdi Alimam M， Piazza FM， Selby DM， et al. Muc-5/5ac mucin messenger RNA and protein expression is a marker of goblet cell metaplasia in murine airways J. Am J Respir Cell Mol Biol， 2000， 22(3)： 253-260.Menezes MB， Teixeira AL， Terra Filho J， et al. Inflammatory and functional effects of increasing asthma treatment with formoterol or double dose budesonide