1、第三章 酶蛋白的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure）蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiary structure）蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternary structure）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系舉例：鐮刀狀細(xì)胞貧血病 鐮刀狀細(xì)胞貧血病是最早被認(rèn)識(shí)的一種分子病，流行于非洲的一些地區(qū)，患者的紅細(xì)胞形態(tài)異常，有很多呈新月?tīng)罨蜱牭稜睿诩t細(xì)胞脫氧時(shí)鐮刀狀細(xì)胞數(shù)量增加，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂、溶血而致命。鐮刀狀紅細(xì)胞產(chǎn)生的原因是患者的血紅蛋白異常。血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)起攜帶氧氣功能的一種重要的蛋白質(zhì)，是一種四聚體蛋白質(zhì)，由兩個(gè)亞基

2、和兩個(gè)亞基組成（22），其中亞基包含141個(gè)氨基酸殘基，亞基包含146個(gè)氨基酸殘基。鐮刀狀細(xì)胞貧血病患者由于基因突變，其血紅蛋白（HbS）的亞基N-末端第6號(hào)位的氨基酸由原來(lái)正常血紅蛋白（HbA）的高度極性的Glu變成了非極性的Val這種改變導(dǎo)致血紅蛋白表面電荷減少，在脫氧狀態(tài)下溶解度下降，發(fā)生不正常聚集，形成鐮刀狀紅細(xì)胞，嚴(yán)重時(shí)造成紅細(xì)胞破裂。血紅蛋白分子共有574個(gè)氨基酸殘基組成，僅僅兩個(gè)亞基上各改變了一個(gè)氨基酸殘基，生理功能就發(fā)生了如此大的變化，可見(jiàn)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)功能的影響之大。牛胰核糖核酸酶復(fù)性實(shí)驗(yàn)8個(gè)CysSH形成4個(gè)二硫鍵的組合方式有753=105種，因而重新形成正確配對(duì)的概率

3、僅1/105， 第一節(jié) 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)研究方法 1. 蛋白質(zhì)的分離純化和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定2.確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目3. 拆分并分離蛋白質(zhì)分子的多肽鏈4. 測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成5. 多肽鏈的N-末端和C-末端分析6.多肽鏈的局部斷裂和肽段的分離 7. 測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序8.確定肽段在多肽鏈中的次序從而排列出多肽鏈的氨基酸順序 9. 多肽鏈中二硫鍵位置的確定1. 蛋白質(zhì)的分離純化和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定電泳單一帶SDS測(cè)分子量（質(zhì)譜法）2.確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目末端分析法3. 拆分并分離蛋白質(zhì)分子的多肽鏈氧化法氧化法的優(yōu)點(diǎn)在于二硫鍵一旦拆開(kāi)，不會(huì)重新形成連接，但在氧化過(guò)程中伴

4、隨著一些副反應(yīng)，Met側(cè)鏈被氧化生成亞砜，Trp側(cè)鏈被破壞。 還原法為了防止游離巰基重新氧化，還需加入烷化劑如碘乙酸，使巰基上發(fā)生取代反應(yīng)而不會(huì)重新被氧化 4. 測(cè)定每條多肽鏈的氨基酸組成蛋白質(zhì)完全水解：要求完全水解且不破壞氨基酸1）酸水解： 作水解程度時(shí)間圖確定最佳時(shí)間1-10mg蛋白樣品 加HCl 抽真空 封閉 烘箱特點(diǎn)：a）Trp完全破壞，生成不溶性物質(zhì)b） Ser、Thr、Tyr部分破壞，Ser破壞10-15%，Thr、Tyr破壞5-10%，應(yīng)予以校正c） Asn Asp Glu Gln d） 胱氨酸半胱氨酸e） 大部分氨基酸不破壞2）堿水解：特點(diǎn)：a)Trp不破壞 b）大部分氨基酸破

5、壞分離檢測(cè)：1）紙層；2）薄層；3）離交；4）氨基酸自動(dòng)分析儀5. 多肽鏈的N-末端和C-末端分析目的：有幾條肽鏈；N、C末端是何氨基酸 測(cè)不出末端的幾種原因：蛋白質(zhì)分子為環(huán)肽；末端被保護(hù)試劑保護(hù)；末端是Pro5-1 N端測(cè)定（介紹原理、分離檢測(cè)方法和優(yōu)缺點(diǎn)）1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法）a）原理：b) 分離檢測(cè)：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而Aa不溶標(biāo)準(zhǔn)Aa + DNP反應(yīng)紙層噴茚三酮未知DNP-Aa紙層噴茚三酮比較即得結(jié)果，若結(jié)果是兩點(diǎn)以上則證明是有幾條肽鏈組成c）優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，末端產(chǎn)物易分離 缺點(diǎn)：N端是Pro測(cè)不出；不能進(jìn)行N端測(cè)序 Lys的另一氨基生成

6、e-DNP-Lys，由于它不溶于乙醚故不影響測(cè)定結(jié)果2) 丹磺酰氯法（DNS法） a) 原理：b）分離檢測(cè)：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶標(biāo)準(zhǔn)Aa + DNS反應(yīng)紙層熒光顯色未知DNS-Aa紙層熒光顯色比較即得結(jié)果，若結(jié)果是兩點(diǎn)以上則證明是有幾條肽鏈組成c）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；是前種方法的100倍；用量少，樣品量為0.1-2ng 缺點(diǎn)：DNS-Pro、DNS-Try被破壞；N端是Pro、Try測(cè)不出；不能進(jìn)行N端測(cè)序 3) Edman降解法苯異硫氰酸酯法（PITC法)a) 原理： a）分離檢測(cè)：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶c）優(yōu)點(diǎn)：N端是Pro可測(cè)；能進(jìn)行N端測(cè)序 缺點(diǎn)：靈敏度

7、稍差 4）DansyCl-Edman法既可檢測(cè)N端序列又有較高靈敏度 5) 亮氨酸氨肽酶法 此酶專一水解N端羧基形成的肽鍵，可測(cè)N端序列，但不能測(cè)N端為Pro.5-2 C-末端分析 C-末端分析方法也有很多，但至今還不能令人滿意，常用的有肼解法、還原法、羧肽酶法等。1）肼解法原理： b）分離檢測(cè)：苯甲醛+酰肼沉淀離心上清液中含游離基酸 2) 還原法用還原劑如硼氫化鋰處理肽鏈，則C-末端殘基的-羧基被還原成醇，將肽鏈完全水解后，分析水解產(chǎn)物，其中的-氨基醇對(duì)應(yīng)的即為C-末端氨基酸。3) 羧肽酶法羧肽酶是一種專一從多肽鏈的C-末端開(kāi)始逐個(gè)水解氨基酸殘基的蛋白水解酶。由于該酶的專一性，當(dāng)它作用于多肽

8、鏈時(shí)，C-末端殘基首先被水解下來(lái)，然后是C-末端第二個(gè)氨基酸殘基，依此類推。根據(jù)氨基酸釋放的動(dòng)力學(xué)曲線，可以確定C-末端氨基酸以及靠近C-末端的幾個(gè)氨基酸的排列順序。不過(guò)這是理想的情況，實(shí)際測(cè)定中常常有多種因素干擾，很難確定C-末端多個(gè)氨基酸的排列順序。 羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在C-末端不能水解 b）C-末端是Pro不能水解c）C-末端第二個(gè)是Pro，無(wú)論第一個(gè)是何氨基酸都不能水解羧肽酶B：a）水解C-末端為L(zhǎng)ys、His、Arg的b）C-末端第二個(gè)是Pro，無(wú)論第一個(gè)是何氨基酸都不能水解6.多肽鏈的局部斷裂和肽段的分離在氨基酸順序測(cè)定時(shí)，只要從肽鏈某一末端（通常是N-末端）起逐

9、個(gè)將氨基酸殘基斷裂下來(lái)，并對(duì)游離出來(lái)的氨基酸或其衍生物進(jìn)行鑒定，就可以確定氨基酸序列。但是實(shí)際操作時(shí)，由于每次末端氨基酸殘基發(fā)生斷裂的效率不能達(dá)到100%，或者說(shuō)，在大多數(shù)肽段在斷裂第二個(gè)氨基酸殘基時(shí)，少數(shù)肽段可能因?yàn)樯弦惠單窗l(fā)生反應(yīng)而正在斷裂第一個(gè)氨基酸殘基，這樣勢(shì)必給測(cè)定帶來(lái)干擾。如果肽鏈很短，這樣的干擾不會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生重大影響；但蛋白質(zhì)肽鏈的長(zhǎng)度都超出這一范圍，這樣測(cè)定將無(wú)法進(jìn)行下去。所以人們首先需將肽鏈進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆纸?，將其斷裂成若干長(zhǎng)度合適的肽段，再分別測(cè)定這些肽段的氨基酸順序。1溴化氰裂解法：BrCN：專一水解Met羧基形成的鍵優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，切點(diǎn)少，產(chǎn)率高（85%） * 弱酸、弱堿也

10、可使肽鏈水解但專一性不好2酶解法：胰酶：水解堿性氨基酸羧基所形成的鍵（Lys，Arg）* 堿性氨基酸的羧基連接的是Pro則不能水解。糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：專一性水解芳香族氨基酸羧基所形成的鍵（Phe，Try，Tyr）。* 若芳香族氨基酸的羧基連接的是Pro則不能水解。 分離肽鏈可用：分子篩；離子交換；等點(diǎn)聚焦（電泳法）7. 測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序測(cè)定肽段的氨基酸順序的方法有：Edman降解法、酶解法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等，其中最常使用的是Edman降解法。Edman降解法的原理是利用前述苯異硫氰酸酯（PITC），又稱Edman試劑與N-末端氨基酸殘基的-氨基之間的特異性反應(yīng)，每輪反應(yīng)后N

11、-末端氨基酸脫落，并生成PTH-氨基酸。通過(guò)層析等方法鑒定PTH-氨基酸的種類，就可以確定肽鏈中對(duì)應(yīng)位置的氨基酸。通過(guò)n輪反應(yīng)，即可確定由肽段中N-末端起n個(gè)氨基酸的順序。8.確定肽段在多肽鏈中的次序從而排列出多肽鏈的氨基酸順序至此，已經(jīng)得出了多肽鏈被斷裂成的各個(gè)肽段的氨基酸順序，但由于沒(méi)有這些肽段在多肽鏈中次序的信息，還是無(wú)法排出整個(gè)多肽鏈的氨基酸順序。為此，必須用兩種或者兩種以上的方法來(lái)斷裂多肽鏈，比如用兩種蛋白酶分別水解多肽鏈，將得到兩套斷裂位點(diǎn)不同的肽段，分別確定這兩套肽段的氨基酸順序，然后利用這兩套肽段的氨基酸順序彼此之間有交錯(cuò)重疊，可以確定整條多肽鏈的氨基酸順序。通過(guò)末端分析得到：

12、N-末端殘基為I，C-末端殘基為L(zhǎng)用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，測(cè)定出氨基酸順序分別為： MTYAGK ISR EAL CAFR DALK用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，測(cè)定出氨基酸順序分別為： TY REAL AGKDAL ISRM KCAF由于N-末端殘基為I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又由于C-末端殘基為L(zhǎng)，EAL和REAL是C-末端肽段。利用兩套肽段的氨基酸順序彼此之間的重疊關(guān)系，得出：第一套肽段： N-末端 ISR MTYAGK DALK CAFR EAL C-末端第二套肽段： N-末端 ISRM TY AGKDAL KCAF REAL C-末端推出完整肽鏈順序： ISRMT

13、YAGKDALKCAFREAL在上例中，兩套肽段之間正好能夠相互跨過(guò)切口而重疊，從而能確定出肽段在多肽鏈中的位置，拼湊出整條肽鏈的氨基酸順序。9. 多肽鏈中二硫鍵位置的確定對(duì)于含有二硫鍵的蛋白質(zhì)，我們?cè)诜治龆嚯逆湴被犴樞蚯跋葘⑵洳痖_(kāi)，然而在測(cè)定完多肽鏈氨基酸順序后需要確定鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵的位置，常用的方法是對(duì)角線電泳法。不拆開(kāi)二硫鍵直接用蛋白酶水解蛋白質(zhì)，所得肽段樣品點(diǎn)樣到濾紙中央的電泳原點(diǎn)，在第一個(gè)方向上進(jìn)行電泳，則不同的肽段按其所帶電荷和分子大小分離。結(jié)束后將濾紙?jiān)谶^(guò)甲酸蒸氣中熏，二硫鍵被氧化和拆開(kāi)。將濾紙旋轉(zhuǎn)90，在相同條件下進(jìn)行第二個(gè)方向上的電泳。這時(shí)，對(duì)于不含二硫鍵的肽段，由于沒(méi)有

14、發(fā)生變化，電泳遷移率不變，電泳后位置應(yīng)處于對(duì)角線上；而含有二硫鍵的肽段，其大小和電荷發(fā)生了變化，電泳遷移率也要改變，電泳后位置偏離對(duì)角線，將這些肽段提取出來(lái)，進(jìn)行氨基酸順序分析，與已經(jīng)測(cè)定的多肽鏈氨基酸順序相比較，即可推斷出二硫鍵的位置。除了上述經(jīng)典的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法外，由于核苷酸序列測(cè)定技術(shù)發(fā)展迅速，目前DNA的核苷酸序列測(cè)定已完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而蛋白質(zhì)的氨基酸順序是由DNA所決定的，人們通過(guò)提純指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的mRNA，再將mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄作用得到cDNA，并擴(kuò)增cDNA，然后測(cè)定其核苷酸序列，根據(jù)三聯(lián)體遺傳密碼規(guī)則可確定出蛋白質(zhì)的氨基酸順序。到目前為止，已有10萬(wàn)種以上的蛋白質(zhì)完成

15、了一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，對(duì)于大多數(shù)常見(jiàn)蛋白質(zhì)，通過(guò)查閱數(shù)據(jù)庫(kù)，可得到關(guān)于一級(jí)結(jié)構(gòu)的資料。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究方法二級(jí)結(jié)構(gòu)：a-螺旋（a-helix) ；b-片層(-sheet) ； b-轉(zhuǎn)角(-turn) ；無(wú)規(guī)卷曲(random)維持鍵：氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵、配位鍵等R基團(tuán)對(duì)a-螺旋的影響：a) 構(gòu)成a-螺旋要求R不太大，不帶電荷 b）幾個(gè)相連的氨基酸的R帶同種電荷，不形成a-螺旋 c）R帶電荷但間斷，可形成a-螺旋*= -57，= -47是形成a-螺旋的條件，不滿足此條件不能形成a-螺旋*Gly不參與a-螺旋，原因：Gly的a-C上連兩個(gè)H，故、無(wú)法確定*Pro、Hyp不參與

16、a-螺旋，原因：不形成角；空間障礙不形成氫鍵= -119，= +113時(shí)，蛋白質(zhì)分子成平行的b-片層= -139，= +135時(shí)，蛋白質(zhì)分子成反平行的b-片層從能量上看，反平行式要比平行式更穩(wěn)定。 三級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲形成,具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白一般為球形或橢球形纖維蛋白具有超二級(jí)結(jié)構(gòu)(超螺旋)四級(jí)結(jié)構(gòu)具有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)間的結(jié)構(gòu) 晶體蛋白測(cè)定X光衍射古老的方法，1958年英國(guó)科學(xué)家開(kāi)始運(yùn)用，分辨率6A0，目前分辨率1.4A0，我國(guó)X光衍射儀分辨率1.8A0，測(cè)胰島素結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)：只能測(cè)晶體，不能測(cè)溶液。 不能測(cè)氫原子位置，故測(cè)不出氫鍵的作用。 只能測(cè)靜態(tài)酶結(jié)構(gòu)，無(wú)法測(cè)酶催化反應(yīng)的動(dòng)態(tài)。目前有較

17、新的實(shí)驗(yàn)方法中子衍射。溶液中構(gòu)象的測(cè)定a) 紫外吸收法（常用方法）：Try，Tyr，Phe在紫外波長(zhǎng)范圍有最大光吸收，產(chǎn)生紫外吸收光譜。受pH、溶劑或鄰近分子、鄰近發(fā)色團(tuán)的相對(duì)取向影響。目前用紫外吸收法可以探討下列問(wèn)題：芳香族氨基酸在表面？在內(nèi)部？極性環(huán)境？非極性環(huán)境？數(shù)量？(氨基酸由極性到非極性，上升。極性溶液中，氨基酸在蛋白中，大于游離時(shí)，一定在蛋白內(nèi)部且被非極性氨基酸包圍。極性變化對(duì)，影響大，氨基酸一定在表面。）外界條件影響，二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)有無(wú)變化？變化過(guò)程？b) 熒光光譜法Tyr，Try，Phe能發(fā)射熒光。最大熒光強(qiáng)度波長(zhǎng)為348nm、303nm、282nm，發(fā)光強(qiáng)度Try：Tyr：P

18、he=100：9：0.5。故一般以Try為準(zhǔn)，熒光的靈敏度是紫外的103104倍。用熒光光譜法可研究蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化、酶活性部位結(jié)構(gòu)、Try和Tyr殘基的微環(huán)境、蛋白質(zhì)變性。蛋白位于極性溶劑時(shí)，max短波，Try進(jìn)入蛋白內(nèi)部非極性區(qū)。蛋白位于非非極性溶劑，max短波，Try到蛋白表面。紫外測(cè)值，純酶需配成0.5mg/ml熒光測(cè)值，純酶需配成0.035mg/ml研究酶活性部位一般要引入一個(gè)熒光探針.此試劑要求與酶結(jié)合牢固、不影響底物結(jié)合。探針在水中，熒光很?。辉诜菢O性中增大。例：酶+熒光標(biāo)記的底物：熒光強(qiáng)度上升，峰值移向短波, 酶活部位是疏水區(qū)c) 園二色譜法（CD譜）CD光譜圖：遠(yuǎn)紫外區(qū)1

19、85nm245nm，吸光是肽鍵所致，故可看出主鏈，可算出-螺旋、-折疊的含量。近紫外區(qū)245nm320nm，吸光是Tyr、Trp、Phe所致，故可看出芳香族氨基酸所在的微環(huán)境。至今為止人們還無(wú)法做到直接觀察蛋白質(zhì)分子中原子和原子團(tuán)的排列，光學(xué)顯微鏡的最大分辨率在0.2m，而蛋白質(zhì)分子內(nèi)各原子之間的距離在0.1nm左右。目前人們對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究都是借助于一些輻射方法，常見(jiàn)的包括X-射線衍射法、核磁共振、熒光光譜法、旋光色散、圓二色性、拉曼光譜、掃描隧道顯微技術(shù)、原子力顯微技術(shù)，等等。例1 氨基酸組成 Phe+Pro+2Lys+Glu Edman降解 PTHGlu，胰酶，羧肽酶A、B均不

20、可水解成氨基酸或小肽，求順序。例2：A肽經(jīng)酸解得 :Lys+His+Asp+2Glu+Ala+Val+Tyr+2NH3。 經(jīng)FDNB得DNPAsp 經(jīng)羧肽酶得Val 經(jīng)胰酶得（1）Lys+Asp+Glu+Ala+Tyr（PH6.4是等電點(diǎn)）（2）His+Glu+Val（PH6.4帶+電荷）（2）經(jīng)FDNB得DNPHis。 經(jīng)胰凝乳蛋白酶得（1）Asp+Ala+Tyr（PH6.4中性）（2）Lys+His+2Glu+Val（PH6.4帶+電荷） 求順序。例3（1）肽經(jīng)酸解得Try+Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Pro（2）肽經(jīng)FDNB法得DNPAla -DNP-Lys（3）肽

21、經(jīng)羧肽酶A不能測(cè)出C-末端氨基酸（4）肽經(jīng)羧肽酶B不能測(cè)出C-末端氨基酸（5）肽經(jīng)溴化氰得Ser+Try+Pro；Ala+Arg+Ser+Lys+Phe+Met（6）肽經(jīng)胰凝乳蛋白酶（chT）得Ser+Pro；Met+Try；Phe+Lys+Ser+Arg+Ala（7）肽經(jīng)胰酶（T）得Ala+Arg；Lys+Ser；Phe+Try+Met+Ser+Pro 求順序。例 1答案：Glu-Phe-Lys-Pro-Lys解法：PTHGlu N-末端為Glu，胰酶不水解故有LysPro羧肽酶A不水解：Lys為C末端，Pro為C末端，Pro為C末端第二。羧肽酶B不水解：Pro為C末端第二。故Pro為C末端第二。故有Glu-Phe-Lys-Pro-Lys或Glu-Lys-Lys-Pro-Phe若是后一種胰酶可將其水解成Glu-Lys，Lys-Pro-Phe，而實(shí)驗(yàn)顯示胰酶不水解，故只能是第一種情況。例 2 答案：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val解法：酸解說(shuō)明Asp和2Glu中有兩個(gè)是以酰胺狀態(tài)存在 FDNB得N-末端是Asp 羧肽酶得C-末端是Val 胰酶水解堿性氨