1、2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09抗藥抗體免疫原性分析方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則時(shí)間：2021.03.09創(chuàng)作：歐陽法摘要：幾乎所有的生物制藥產(chǎn)品都會(huì)引起一定的抗藥抗體(anti-drugantibody,ADA)反應(yīng)，抗藥抗體反應(yīng)可能會(huì)降低藥物療效或?qū)е聡?yán)重的不良反應(yīng)。在人體內(nèi)，抗藥抗體通常不會(huì)引起明顯的臨床反應(yīng)。但是對(duì)于某些治療性蛋白質(zhì)，抗藥抗體反應(yīng)能引起各種臨床的不良反應(yīng)，包括溫和事

2、件及嚴(yán)重不良事件。臨床前研究表明，抗藥抗體能對(duì)藥物暴露、藥物毒性作用、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)等造成影響。因此治療性蛋白質(zhì)的免疫原性引起了臨床醫(yī)生、藥企及監(jiān)管機(jī)構(gòu)的注意。為了評(píng)估生物藥物分子的免疫原性，以及將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床事件聯(lián)系起來，在臨床前研究和臨床研究中，很有必要開發(fā)可靠的能夠有效評(píng)估抗藥抗體反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法。這里方法學(xué)驗(yàn)證顯得尤為重要，并且方法學(xué)驗(yàn)證是藥物上市申請(qǐng)必不可少的?，F(xiàn)行的監(jiān)管文件對(duì)于免疫分析方法的驗(yàn)證的指導(dǎo)相當(dāng)有限，特別是缺乏有關(guān)免疫原性分析方法的驗(yàn)證的指導(dǎo)。因此，本文對(duì)抗藥抗體免疫分析方法的驗(yàn)證提供科學(xué)的建議。在現(xiàn)有的關(guān)于生物分析的規(guī)范性文件的基礎(chǔ)上加入獨(dú)特的性能驗(yàn)證。

3、筆者建議采用實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法進(jìn)行免疫分析的方法學(xué)驗(yàn)證。這些建議被視為最佳的例子，旨在促進(jìn)整個(gè)醫(yī)藥行業(yè)形成一個(gè)更加統(tǒng)一的抗體檢測(cè)方法。1簡(jiǎn)介：生物制藥產(chǎn)品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，一般通過人細(xì)胞系、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，比常規(guī)的小分子藥物更大（一般大于13KD）。由于以上特性，生物制藥產(chǎn)品引起免疫反應(yīng)的潛力更大。生物制藥的免疫原性與產(chǎn)品的內(nèi)在因素（種屬特異性表位、外源性、糖基化程度、聚合或變性程度、雜質(zhì)和制劑）、外在因素（給藥途徑、慢性或急性給藥、藥代動(dòng)力學(xué)及內(nèi)源性當(dāng)量）、患者因素（自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代療法）相關(guān)?？顾幙贵w反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀，包括過敏、自身

4、免疫和不同的藥代動(dòng)力學(xué)特征（例如，藥物中和、生物分布異常和藥物清除率增強(qiáng)等均可能會(huì)使藥物的的療效發(fā)生改變）。藥物引起的免疫反應(yīng)是藥物安全性和有效性的重要指標(biāo)，這也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)、生產(chǎn)企業(yè)、臨床醫(yī)生和患者共同關(guān)注的。因此，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局以及歐盟、日本、加拿大、澳大利亞等國(guó)家的監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求通過藥理學(xué)或毒理學(xué)相關(guān)的方法對(duì)抗藥抗體進(jìn)行評(píng)估。免疫原性與臨床癥狀之間的相關(guān)性的研究依賴于臨床前研究和臨床研究中對(duì)于抗藥抗體的客觀檢測(cè)和表征。因此免疫原性生物分析方法在用于檢測(cè)研究樣本之前應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)拈_發(fā)及驗(yàn)證。已有出版物提供了關(guān)于抗藥抗體檢測(cè)和表征的策略、方法開發(fā)及優(yōu)化等方面的指南。方法學(xué)驗(yàn)證是對(duì)分析方法

5、的評(píng)價(jià)，通過特定的實(shí)驗(yàn)室方法表明采用的分析方法適用于相應(yīng)的檢測(cè)要求。具體到抗藥抗體的檢測(cè)方法，驗(yàn)證就是指證明該方法能可靠的（例如一致性和重復(fù)性）在復(fù)雜的生物基質(zhì)（血清或血漿）中檢測(cè)出低量的藥物特異性抗體。方法學(xué)驗(yàn)證應(yīng)該通過預(yù)先研究階段和研究階段兩個(gè)階段進(jìn)行，預(yù)先研究階段是指在分析樣品之前的工作，研究階段是指樣品的分析工作，預(yù)先研究階段和研究階段對(duì)于表明分析方法的有效性和可控性同等重要。本文主要介紹抗藥抗體免疫分析方法驗(yàn)證的主要性能特征，推薦方法學(xué)驗(yàn)證相關(guān)的方法和措施。本指南應(yīng)當(dāng)被視為最佳實(shí)踐范例，考慮到具體實(shí)際分析方法時(shí)，在保持科學(xué)合理性和客觀性的情況下，也可以采取替代方法。若采用替代方法，建

6、議與監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行充分討論。以細(xì)胞功能為基礎(chǔ)的中和抗藥抗體生物檢測(cè)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫分析不在本指南的討論范圍內(nèi)。方法2.1抗藥抗體檢測(cè)臨床和非臨床研究通常是通過對(duì)治療引起的抗藥抗體反應(yīng)的檢測(cè)和表征來評(píng)估藥物的免疫原性。目前可通過多種方法可用于抗藥抗體的檢測(cè)，包括酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫檢定法（RIA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等離子體共振（SPR）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）。每一種檢測(cè)方法均有其優(yōu)點(diǎn)和局限性，在最近的文章中已進(jìn)行過討論8,14。不管是采用何種方法，在方法開發(fā)和優(yōu)化后均應(yīng)進(jìn)行正式的方法學(xué)驗(yàn)證，以保證該方法適合相應(yīng)的檢測(cè)要求。因此可以預(yù)測(cè)，本指南的驗(yàn)證建議適用于大部分的

7、抗藥抗體免疫檢測(cè)。研究人員應(yīng)根據(jù)檢測(cè)系統(tǒng)的特點(diǎn)確定合適的方法學(xué)驗(yàn)證方案。臨床研究中抗藥抗體的檢測(cè)和表征通常包括四種不同類型的方法?？顾幙贵w檢測(cè)試驗(yàn)通常包括篩選試驗(yàn)和特異性確證試驗(yàn)，表征試驗(yàn)通常包括抗體滴定和中和抗體檢測(cè)10。應(yīng)用到具體研究樣本時(shí)，抗藥抗體分析試驗(yàn)需要兩個(gè)關(guān)鍵決策參數(shù)，分別為篩選試驗(yàn)的篩選臨界點(diǎn)（screeningcutpoint）和特異性確證試驗(yàn)的特異性臨界點(diǎn)（specificitycutpoint）。篩選臨界點(diǎn)有助于抗藥抗體檢測(cè)結(jié)果的分類，高于篩選臨界點(diǎn)為活性樣品（活性樣品通常為潛在陽性樣品），低于臨界點(diǎn)為無活性樣品?；钚詷悠吠ㄟ^特異性確證試驗(yàn)（如競(jìng)爭(zhēng)性藥物抑制信號(hào)通路）檢測(cè)

8、是陽性（特異性活性）還是陰性（非特異性活性）。特異性臨界點(diǎn)為抑制信號(hào)通路所需的樣品量，也就是具體藥物的抗藥抗體，需要通過試驗(yàn)確定?？顾幙贵w的檢測(cè)方法通常是非定量試驗(yàn)（有時(shí)是半定量試驗(yàn)），因?yàn)闆]有可用的標(biāo)準(zhǔn)化的物種特異性的抗藥抗體作為校正標(biāo)準(zhǔn)品15。陽性對(duì)照一般都是內(nèi)部開發(fā)的（例如單克隆抗體或高免血清的多克隆抗體），不可能將受試者檢測(cè)到的所有抗藥抗體作為陽性對(duì)照。如果準(zhǔn)備使用質(zhì)量單位標(biāo)示抗藥抗體水平，那應(yīng)該證明標(biāo)準(zhǔn)品和試驗(yàn)樣品的平行性，以確定樣品的濃度的準(zhǔn)確性8,10。若未證明樣品與標(biāo)準(zhǔn)品間的平行性，則準(zhǔn)確性是可疑的。滴定法是另一種評(píng)估抗體水平的方法，該方法不同樣品稀釋間容易缺乏平行性。然而，值

9、得注意的是已有研究表明，滴定法適用于抗體水平的評(píng)估。幾十年來，臨床上感染、自身免疫疾病的診斷和治療以及預(yù)防接種等都采用這一方法1622。滴定法比較抗藥抗體反應(yīng)更為簡(jiǎn)便且所需的驗(yàn)證工作更少，因?yàn)槠洳恍枰賹?duì)不同產(chǎn)品的抗藥抗體與標(biāo)準(zhǔn)品間的平行性進(jìn)行詳細(xì)描述與證明。此外質(zhì)量單位法每當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品品改變時(shí)均需要進(jìn)行重新驗(yàn)證。綜上所述，兩種方法都無法提供準(zhǔn)確的定量數(shù)據(jù)。因此，贊助商建議采用相對(duì)濃度（質(zhì)量單位）或滴度表示抗藥抗體水平。某些監(jiān)管機(jī)2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.

10、03.09構(gòu)會(huì)更傾向于使用滴度單位。滴度是仍能產(chǎn)生陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。在方法的開發(fā)和優(yōu)化階段，應(yīng)先確定方法并進(jìn)行記錄，例如選擇所需的試劑、最佳濃度、預(yù)期樣品所需的最大稀釋倍數(shù)等。這些需要研究人員在預(yù)先研究階段進(jìn)行簡(jiǎn)單或重復(fù)確證。本文假定以下屬性在驗(yàn)證之前已被確證：免疫分析方案及方法設(shè)計(jì)，分析基質(zhì)的類型，最大稀釋倍數(shù)（MRD）、試劑的最佳濃度、酶標(biāo)板的均勻性評(píng)估（如位置的影響、漂移等）。監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能會(huì)要求提供相關(guān)的數(shù)據(jù)支持。在方法的開發(fā)和優(yōu)化階段，通過對(duì)對(duì)照品的檢測(cè)，對(duì)方法的變異性有一個(gè)初步的認(rèn)識(shí)。2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)的應(yīng)用降低驗(yàn)證過程中的主觀作用是本文的重點(diǎn)之一。為了確保實(shí)驗(yàn)的客觀性必須依靠

11、于統(tǒng)計(jì)手段。由于大多數(shù)研究者無法獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)家的服務(wù)，本文提供了簡(jiǎn)單且足夠嚴(yán)格和有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。所涉及的統(tǒng)計(jì)計(jì)算都可以采用商業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算過程不需要經(jīng)驗(yàn)豐富的統(tǒng)計(jì)學(xué)家。然而，如果有統(tǒng)計(jì)學(xué)家協(xié)助2021.03.09進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理的話，統(tǒng)計(jì)學(xué)的應(yīng)用可能會(huì)比本文提供的更為嚴(yán)格和有效。預(yù)研究驗(yàn)證臨床和非臨床研究中在開始樣品生物分析前的驗(yàn)證試驗(yàn)稱為預(yù)研究驗(yàn)證，它主要從數(shù)學(xué)和可定量方面描述分析方法的性能特征8。預(yù)驗(yàn)證(prevalidation)是指研究工作啟動(dòng)前的籌備工作，兩者不能混淆。另一方面，在研究驗(yàn)證是指監(jiān)控整個(gè)方法使用過程的性能特征，以確保方法的有效性和數(shù)據(jù)的可靠性。通過完

12、整的方法開發(fā)和優(yōu)化后，分析方法應(yīng)具備驗(yàn)證的條件，如優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明檢測(cè)方法具有潛在的可靠性和適用于相應(yīng)的檢測(cè)要求。方法的可靠性依賴于分析設(shè)備和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)以及試驗(yàn)人員的熟練程度。本質(zhì)上，分析方法是包含多個(gè)因素的整體系統(tǒng)而不僅僅是試劑而已。驗(yàn)證方法應(yīng)包括系統(tǒng)適用性，這屬于在研究驗(yàn)證范疇。建議開始預(yù)研究驗(yàn)證之前制定相應(yīng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案或驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.09應(yīng)說明該方法的預(yù)

13、期目的、分析方法的詳細(xì)說明、待驗(yàn)證的性能特征以及精密度、穩(wěn)健性、穩(wěn)定性和耐用性的預(yù)期驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。此外建議在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案中加入適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和數(shù)據(jù)處理步驟，這樣可以為驗(yàn)證人員提供一個(gè)明確的指導(dǎo)以確保更好的處理數(shù)據(jù)?？顾幙贵w檢測(cè)應(yīng)建立相應(yīng)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，有助于確保在研階段的試驗(yàn)的有效性。為此，應(yīng)通過對(duì)驗(yàn)證過程中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)后建立用于質(zhì)控的系統(tǒng)適用性標(biāo)準(zhǔn)（可接受范圍）。此外，在研驗(yàn)證階段中間精密度試驗(yàn)，對(duì)照品和樣品檢測(cè)也應(yīng)有相應(yīng)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)在研驗(yàn)證階段的分析數(shù)據(jù)不符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)拒絕該數(shù)據(jù)。在預(yù)研驗(yàn)證階段不應(yīng)建立驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)檫@可能會(huì)使某些驗(yàn)證數(shù)據(jù)被排除，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確估計(jì)分析誤差。除了可明原

14、因（如技術(shù)誤差）、有意或無意偏離實(shí)驗(yàn)方案所得分析數(shù)據(jù)應(yīng)被剔除外，預(yù)研階段的所有分析數(shù)據(jù)都應(yīng)計(jì)算在內(nèi)。目前，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）和美國(guó)藥典的指導(dǎo)性文件闡述了定量檢測(cè)的分析驗(yàn)證應(yīng)研究的一般性能特點(diǎn)2325。由于抗藥抗體免疫分析屬于半定量檢測(cè)，所以有些要求并不不適用。對(duì)于抗藥抗體免疫分析方法學(xué)驗(yàn)證，應(yīng)對(duì)以下9項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定：1.篩選臨界點(diǎn)2.確證臨界點(diǎn)3.靈敏度*4系統(tǒng)適用性控制（QCs）驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)5.耐藥性*6精密度7魯棒性8穩(wěn)定性*9耐用性（有條件時(shí)）如果分析方法的開發(fā)和優(yōu)化過程已充分說明并得到適當(dāng)記錄，在預(yù)研驗(yàn)證階段不需要對(duì)以上標(biāo)有*的參數(shù)進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，盡管驗(yàn)

15、證報(bào)告中應(yīng)提供相關(guān)的數(shù)據(jù)。如果最終的方法有所變動(dòng)的話，預(yù)研驗(yàn)證階段應(yīng)重新測(cè)定?？顾幙贵w檢測(cè)方法開發(fā)階段的預(yù)期用途和產(chǎn)品上市后的用途可能會(huì)不同。例如，在開發(fā)早期只有一個(gè)分析人員進(jìn)行試驗(yàn)，開發(fā)工作完成后和上市后可能會(huì)有多個(gè)分析人員進(jìn)行試驗(yàn)。整個(gè)產(chǎn)品生命周期的驗(yàn)證要求應(yīng)隨著檢測(cè)方法應(yīng)用的改變而改變。然后，在藥物申請(qǐng)期間還是應(yīng)對(duì)以上列出的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。傳統(tǒng)分析方法的稀釋線性測(cè)試不適用于抗藥抗體檢測(cè)。當(dāng)使用滴度標(biāo)示抗藥抗體反應(yīng)時(shí)，需要使用陽性對(duì)照，或者最好使用累積抗藥抗體陽性樣品，在合理稀釋范圍內(nèi)不出現(xiàn)異常非線性。通常，在方法開發(fā)階段都會(huì)包括最大稀釋濃度（MRD）的選擇，驗(yàn)證階段不需要進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。如果

16、出現(xiàn)前帶效應(yīng)，建議選擇一個(gè)不受前帶效應(yīng)影響的MRD,或者采用多種稀釋樣品。稀釋線性信息有助于設(shè)計(jì)系統(tǒng)適應(yīng)性質(zhì)量控制。3.1篩選臨界點(diǎn)篩選臨界點(diǎn)定義為篩選試驗(yàn)的響應(yīng)水平，響應(yīng)值高于該臨界點(diǎn)的樣品為活性樣品（或者稱為潛在陽性），響應(yīng)值低于該臨界點(diǎn)的樣品為陰性樣品。一個(gè)有效的篩選臨界點(diǎn)需要在預(yù)研究驗(yàn)證階段對(duì)一些列樣品測(cè)定值進(jìn)行系統(tǒng)性的統(tǒng)計(jì)分析確定，所使用的樣品要求來自代表藥物使用目標(biāo)群體或受試者。當(dāng)免疫分析的方法存在錯(cuò)誤風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，篩選試驗(yàn)寧可出現(xiàn)假陽性也要避免假陰性8,10。如果篩選試驗(yàn)中不能識(shí)別出活性樣品，應(yīng)懷疑該方法檢測(cè)低陽性樣品的能力。約5%的篩選試驗(yàn)的陽性結(jié)果為假陽性，從而保證可以檢測(cè)出低陽性

17、樣品8。在實(shí)踐中，假陽性結(jié)果總比沒有陽性結(jié)果好（如假陽性率可能不等于5%）。3.1.1篩選臨界點(diǎn)的類型可以應(yīng)用于在研驗(yàn)證階段的篩選臨界點(diǎn)共有三種：固定臨界點(diǎn)、浮動(dòng)臨界點(diǎn)、動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)。（a）固定臨界點(diǎn)：預(yù)研驗(yàn)證階段確定固定臨界點(diǎn)，然后應(yīng)用于在研驗(yàn)證階段。固定臨界點(diǎn)用于測(cè)試樣品的分析，直到需要重新驗(yàn)證或改變（如測(cè)定方法發(fā)生關(guān)鍵變化、轉(zhuǎn)移到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)或儀器升級(jí)等）。固定臨界值在一個(gè)目標(biāo)人群的同一研究中或多目標(biāo)人群的各研究間是固定的。當(dāng)預(yù)研究階段的整個(gè)試驗(yàn)的均值相等、方差齊性時(shí)，采用固定臨界點(diǎn)。（b）浮動(dòng)臨界點(diǎn)浮動(dòng)臨界點(diǎn)有兩種計(jì)算方法，分析過程中數(shù)據(jù)需要進(jìn)行對(duì)數(shù)（Log）轉(zhuǎn)換時(shí)，通過預(yù)研階段

18、確定的特定歸一化因子乘以在研階段的生物背景計(jì)算而得；分析過程無對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換時(shí)，計(jì)算方法歸一化因子加上生物背景，生物背景可以由陰性對(duì)照（由樣品的基質(zhì)組成，抗藥抗體反應(yīng)為陰性）、分析稀釋劑或預(yù)處理受試者樣品（個(gè)體特異性臨界點(diǎn)）標(biāo)示。浮動(dòng)臨界點(diǎn)可以是每一次試驗(yàn)每一塊板（每一次試驗(yàn)中的若干塊板）所特有的或每一個(gè)受試者所特有的（使用受試者的預(yù)處理/基線樣本結(jié)果）。如果采用個(gè)體特異性臨界點(diǎn)，需要在同一塊板上檢測(cè)預(yù)處理樣品和處理后樣品（或至少在同一試驗(yàn)中檢測(cè)）。由于浮動(dòng)臨界點(diǎn)的確定過程需要對(duì)預(yù)研究驗(yàn)證的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差估計(jì)，所以不同試驗(yàn)間的結(jié)果應(yīng)表現(xiàn)出方差齊性。采用陰性對(duì)照進(jìn)行歸一化時(shí)，應(yīng)確保陰性對(duì)照結(jié)果能代表目標(biāo)

19、人群的藥物初治基質(zhì)樣品的結(jié)果，例如通過驗(yàn)證陰性對(duì)照均值和生物基質(zhì)樣品均值在整個(gè)試驗(yàn)中是相關(guān)聯(lián)的。如果均值相關(guān)，陰性對(duì)照均值適用于計(jì)算浮動(dòng)臨界點(diǎn)。如果均值不相關(guān)，則使用稀釋液或預(yù)處理樣品結(jié)果進(jìn)行歸一化處理更為合理。(c)動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)、同一試驗(yàn)的不同板之間、同一研究的不同試驗(yàn)間或不同研究間的動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)均不同。動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)的確定不需要預(yù)研究階段的方差估計(jì)。這一特征將動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)和浮動(dòng)臨界點(diǎn)區(qū)別開來。只有當(dāng)不同試驗(yàn)間的結(jié)果方差有顯著性差異時(shí)，才使用動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)。實(shí)際使用時(shí)，動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)的限制性因素是每次試驗(yàn)都需要大量的樣本數(shù)才能確定臨界點(diǎn)。建議優(yōu)先采用固定臨界點(diǎn)或浮動(dòng)臨界點(diǎn)。如果試驗(yàn)間的均值或方差存在差異，建議

20、在采用動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)之前先進(jìn)行差異來源調(diào)查。例如，若果差異來源于分析員或設(shè)備，則采用分析員或設(shè)備的固定臨界點(diǎn)或浮動(dòng)臨界點(diǎn)代替動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)。因?yàn)閯?dòng)態(tài)臨界點(diǎn)是一種不常見的非常規(guī)方法，建議謹(jǐn)慎制定該臨界點(diǎn)，最好能與監(jiān)管機(jī)構(gòu)進(jìn)行充分溝通。3.1.2評(píng)估臨界點(diǎn)的樣品建議從適當(dāng)?shù)娜巳褐谐闃佑糜诜治雠R界點(diǎn)的評(píng)估。有時(shí)候需要在開始預(yù)研究驗(yàn)證試驗(yàn)之前從目標(biāo)疾病人群中獲得樣品基質(zhì)是不實(shí)際的，甚至是不可能的。因此，一般從藥物初治健康受試者的樣本中進(jìn)行評(píng)估，并確立一個(gè)起始臨界點(diǎn)。該方法適用于于臨床I期的研究。當(dāng)臨床研究開展到臨床II期以后，便可得到目標(biāo)疾病患者的樣本，應(yīng)該對(duì)不同的目標(biāo)人群重新評(píng)估臨界點(diǎn)。如果目標(biāo)人群和正常志

21、愿者的響應(yīng)值的平均值和方差相當(dāng)，可以使用同一個(gè)臨界點(diǎn)。如果沒有可比性，則需要采用目標(biāo)疾病特異性的臨界點(diǎn)。為了確定臨界點(diǎn)，在驗(yàn)證階段應(yīng)分析足夠數(shù)量的樣本，這樣才能對(duì)生物和分析變異進(jìn)行有效的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。通常在臨床研究中，需要分析超過50個(gè)獨(dú)立受試者的樣本。非臨床研究至少需要15個(gè)樣品。不應(yīng)使用混合基質(zhì)樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)評(píng)估，因?yàn)閺幕旌蠘悠分袦y(cè)試重復(fù)的樣品，檢測(cè)的只是分析變異而不是生物變異。建議采用平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有效評(píng)估潛在的變異性來源(seeAppendixA)。如果將有多個(gè)分析員在研究過程進(jìn)行分析樣品操作，那么在預(yù)研究驗(yàn)證階段應(yīng)至少包括兩位分析員。如果研究過程中只有一個(gè)分析員進(jìn)行樣品分析，而這個(gè)分析員

22、與驗(yàn)證階段的分析員不同，預(yù)研究驗(yàn)證階段也應(yīng)至少包括兩位分析員。是否需要對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)取決于在研驗(yàn)證的報(bào)告形式（例如在微量滴定板中進(jìn)行兩個(gè)復(fù)孔或三個(gè)復(fù)孔）。3.1.3排除異常值應(yīng)確認(rèn)藥物初治患者的偶然活性樣本，以確保藥物的特異性。在這一點(diǎn)上，確證臨界點(diǎn)將不能真正的確認(rèn)陽性，此時(shí)應(yīng)該使用科學(xué)的判斷方法，應(yīng)排除無法確定是否為偶然活性樣本。在分析臨界點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估時(shí)應(yīng)去除抗藥抗體陽性樣品和統(tǒng)計(jì)學(xué)異常樣品（樣品響應(yīng)值過高或過低）。因?yàn)橄虏繕O端異常值通常會(huì)使差異性波動(dòng)從而影響臨界點(diǎn)，所以應(yīng)當(dāng)排除。去除較高或較低異常值會(huì)得到一個(gè)較低的臨界點(diǎn)，通常會(huì)增加假陽性率而變得更為謹(jǐn)慎（假陽性樣本會(huì)在隨后的特異

23、性確證試驗(yàn)中被證明為陰性）。如果在臨界點(diǎn)評(píng)估中使用了強(qiáng)大的統(tǒng)計(jì)方法（例如基于中位數(shù)的方法，圖基的Tukeysbiweight函數(shù))，則不需要排除異常點(diǎn)。3.1.4確定篩選臨界點(diǎn)為了確定篩選臨界點(diǎn)的類型，需要進(jìn)行一系列的數(shù)據(jù)評(píng)估，如圖1所示。首先，如果使用參數(shù)估計(jì)的方法，需要對(duì)藥物初治的樣本結(jié)果的分布類型進(jìn)行檢驗(yàn)(正態(tài)分布檢驗(yàn))，如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則可以對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換(如對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)，然后排除異常值(AppendixB.1)。如果不需要用到參數(shù)估計(jì)(第95百分位)，則不需要進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，但仍需要排除異常值。其次，采用單因素方差分析(ANOVA-basedstatisticalmetho

24、ds)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理比較每一次試驗(yàn)運(yùn)行的平均值和方差，從而決定采用固定臨界點(diǎn)、浮動(dòng)臨界點(diǎn)還是動(dòng)態(tài)臨界點(diǎn)(AppendixB.2)。在浮動(dòng)臨界點(diǎn)的評(píng)價(jià)過程中，如果歸一化過程使用了陰性對(duì)照，則應(yīng)該將陰性對(duì)照的均值與目標(biāo)人群的基質(zhì)樣本進(jìn)行比較，以確定是否適合使用陰性對(duì)照。最后，基于以上評(píng)估，使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出臨界點(diǎn)(AppendixB.3)。3.2確證臨界點(diǎn)特異性是分析方法在其它基質(zhì)成分存在的條件下明確檢測(cè)目標(biāo)分析物的能力23。篩選試驗(yàn)篩選出活性樣品（通常稱為潛在陽性），因?yàn)楹Y選臨界點(diǎn)允許5%的假陽性率，所以這些活性樣品可能是非特異性的。因此從活性樣品中鑒定出陽性樣品需要藥物的特異性活性。

25、檢測(cè)人源樣本的抗藥抗體特異性是一種常見的做法，動(dòng)物樣本也一樣。特異性確證試驗(yàn)通常是一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)，通過檢測(cè)含或不含預(yù)孵育研究藥物的樣品的信號(hào)變化來進(jìn)行評(píng)估。此外還可通過比較相同大小和電荷的免疫無關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。還有一些研究者通過比較加藥和不加藥的信號(hào)區(qū)別進(jìn)行評(píng)估，然而本文建議與監(jiān)管機(jī)構(gòu)積極討論這一方法的可接受性。以上的任何一種方法，確證陽性信號(hào)的變化值稱為確證臨界點(diǎn)。確證臨界點(diǎn)將抗體與藥物的特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合區(qū)別開來，其有效性非常關(guān)鍵，必須客觀評(píng)估。不鼓勵(lì)使用50%信號(hào)抑制等主觀標(biāo)準(zhǔn)。信號(hào)略高于臨界點(diǎn)的低信號(hào)的抗藥抗體弱陽性樣品的評(píng)價(jià)尤為重要?？顾幙贵w強(qiáng)陽性藥品需要用過量的藥物進(jìn)

26、行競(jìng)爭(zhēng)性抑制，所以一般不會(huì)出現(xiàn)這一問題。當(dāng)評(píng)價(jià)抗藥抗體弱陽性樣品時(shí)，即使是加標(biāo)藥物樣品的信號(hào)很細(xì)微的減弱都可能會(huì)使相對(duì)應(yīng)的未加標(biāo)藥物樣品的信號(hào)降低50%以上，從而導(dǎo)致假陽性。此外，只有將抗藥抗體陽性樣品的信號(hào)下降到背景信號(hào)，這信號(hào)強(qiáng)度只有未抑制樣品信號(hào)的50%以下，這樣可能會(huì)出現(xiàn)假陰性。因此，特異性確證臨界點(diǎn)應(yīng)該通過客觀的方法進(jìn)行評(píng)估，在弱陽性樣本附近評(píng)估分析方法的變異性。有多種試驗(yàn)方法可以用于特異性確證臨界點(diǎn)的評(píng)估。建議在篩選臨界點(diǎn)的驗(yàn)證過程評(píng)估特異性確證臨界點(diǎn)。篩選臨界點(diǎn)評(píng)估試驗(yàn)所用到的藥物初治樣本可以加入藥物后再以相同的方式檢驗(yàn)。計(jì)算未加標(biāo)藥物樣本（抑制）的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），特異性

27、確證臨界點(diǎn)為抑制平均值加上3.09倍的SD值（如果預(yù)期假陽性率為1%）。與篩選臨界點(diǎn)的評(píng)估一樣，特異性確證臨界點(diǎn)的評(píng)估過程也需要排除異常值。特異性確證臨界點(diǎn)的詳細(xì)計(jì)算步驟參見附錄C（AppendixC）。在某些實(shí)驗(yàn)室，會(huì)在低于篩選臨界點(diǎn)的樣品（建議樣本量大于等于25）中加標(biāo)陽性對(duì)照使其信號(hào)值等于或稍微大于篩選臨界點(diǎn)。用過量藥物孵育后，計(jì)算平均抑制百分率，并通過“XSD”值進(jìn)行校正，確定特異性確證臨界點(diǎn)（“X”取決于適當(dāng)?shù)募訇栃月剩?。必須確保陽性對(duì)照樣品的信號(hào)不會(huì)高于篩選臨界點(diǎn)太多，以免使假陽性率增高。這一方法確定的特異性確證臨界點(diǎn)高度依賴于所使用的陽性對(duì)照品。值得注意的是，研究樣本中的低抗藥抗

28、體親和力樣本（特別是多價(jià)IgM,親和力成熟的IgG）可能會(huì)不被抑制。因此，使用單一陽性對(duì)照品確定的特異性確證臨界點(diǎn)可能無法有效地將一個(gè)研究樣品分為特異性樣品還是非特異性樣品。Neyer等提出了一種基于T檢驗(yàn)（t-test）的表示抗藥抗體特異性的方法，該方法的原理是比較未加標(biāo)藥物樣品與加標(biāo)藥物樣品的信號(hào)值。然而，該分析法的競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)果的觀測(cè)樣本量相當(dāng)有限，沒有考慮到生物變異的影響。然而，以上列舉的方法均比人為的50%抑制率更為客觀、可靠。一些研究人員進(jìn)行抗體免疫耗竭（如ProteinA）,這一方法并不涉及特異性藥物，它只能證明信號(hào)來源于免疫球蛋白。這種方法可以用作支撐測(cè)試，不建議作為藥物特異性

29、的決定性試驗(yàn)。3.3靈敏度完全定量方法一般采用適當(dāng)?shù)膮⒖紭?biāo)準(zhǔn)曲線來估計(jì)分析方法靈敏度，而抗藥抗體分析的靈敏度高度依賴于所用的陽性對(duì)照試劑。例如，在同一個(gè)分析試驗(yàn)中，使用高親和力陽性對(duì)照品得到的靈敏度優(yōu)于低親和力陽性對(duì)照品。因此當(dāng)有一種以上的陽性對(duì)照品時(shí)，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)不同的陽性對(duì)照品會(huì)得到不一樣的靈敏度。此外，沒有一種陽性對(duì)照品能表示出不同化合物處理后的免疫應(yīng)答圖譜。盡管如此，分析靈敏度提供了分析方法的一般相關(guān)性，需要進(jìn)行測(cè)定并報(bào)告。靈敏度有助于在分析方法開發(fā)階段選擇最優(yōu)的抗藥抗體檢測(cè)方法（方法開發(fā)起始階段比較不同方法），也有助于確定低陽性對(duì)照品的驗(yàn)證?？顾幙贵w分析的靈敏度指陽性對(duì)照抗體能穩(wěn)定產(chǎn)生

30、陽性信號(hào)的最低濃度。例如，預(yù)期試驗(yàn)的結(jié)果的95%高于篩選臨界點(diǎn)的對(duì)照抗體的濃度，具體的比例2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09取決于一致性水平。確定分析靈敏度的試驗(yàn)方法參見附錄D（Appendix）。3.4系統(tǒng)適用性控制系統(tǒng)適用性控制確保了分析方法的有效性24。分析方法通常都包含一系列的質(zhì)量控制（強(qiáng)、弱陽性對(duì)照和陰性對(duì)照），這些質(zhì)量控制確保了性能的一致性，從而確保了結(jié)果的有效性。換言之，系統(tǒng)適應(yīng)性控制有助于確保了分析方法在整個(gè)研究階

31、段都是有效的。因此，系統(tǒng)適用性控制幫助確認(rèn)試驗(yàn)運(yùn)行是否通過驗(yàn)證的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于系統(tǒng)適用性控制開發(fā)和相關(guān)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)信息參見附錄E（AppendixE）。選擇性/干擾性（耐藥性）考慮到樣品中的其它組分可能會(huì)影響抗藥抗體的檢測(cè)。選擇性就是指分析方法在其它組分存在的情況下檢測(cè)目的物質(zhì)的能力27，通過從含有潛在干擾組分（多個(gè)）的樣品中檢測(cè)分析物（模擬陽性對(duì)照品）的回收率來進(jìn)行表征。當(dāng)陽性對(duì)照和樣品基質(zhì)來源于不同物種時(shí)，anti-framework抗體和抗異種抗體常常會(huì)阻礙陽性對(duì)照品的回收。注意當(dāng)使用陽性對(duì)照時(shí)，抗藥抗體分析的選擇性不太可能會(huì)影響測(cè)定臨床或非臨床樣品的選擇性。盡管如此，還是很有必要去

32、了解抗藥抗體檢測(cè)的試驗(yàn)條件，基質(zhì)中可能含有研究藥物、內(nèi)源性抗體、合并用藥和類風(fēng)濕因子等。3.5.1基質(zhì)成分的干擾抗藥抗體分析的回收率評(píng)估包括在試驗(yàn)條件下檢測(cè)基質(zhì)成分是否會(huì)抑制抗藥抗體與藥物的結(jié)合。如果可能的話，選擇性研究應(yīng)包括陽性對(duì)照與疾病狀態(tài)下的血清的對(duì)照試驗(yàn)，因?yàn)槟承┤巳夯蚣膊顟B(tài)下可能會(huì)產(chǎn)生干擾性物質(zhì)。如果有顯著比例的測(cè)試樣本出現(xiàn)溶血或高血脂，則需要進(jìn)行回收率評(píng)價(jià)。為了確定目標(biāo)基質(zhì)樣品的回收率，應(yīng)將高、低濃度的特異性抗藥抗體對(duì)照品（單克隆或多克?。┘尤敕治鼍彌_液（不含基質(zhì)成分）、健康個(gè)體的生物基質(zhì)（血清或血漿）、治療人群樣本。比較緩沖液的響應(yīng)值與生物基質(zhì)的響應(yīng)值，可接受標(biāo)準(zhǔn)通常為兩者的差

33、異超過20%，具體差異取決于所用的陽性對(duì)照。在試驗(yàn)中選擇表達(dá)高、低非特異性背景的捐助者是很有幫助的。2021.03.09不僅能夠檢測(cè)回收率，還能檢查基質(zhì)的干擾性，確證最小稀釋濃度（MRD）。3.5.2藥物干擾研究（耐藥性）抗藥抗體檢測(cè)的主要干擾物質(zhì)通常來自藥物本身。由于目標(biāo)藥物和試驗(yàn)過程用到的捕獲試劑的特異性抗體的產(chǎn)生存在競(jìng)爭(zhēng)性作用，含藥樣品可能存在干擾物質(zhì)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。通常的做法是確定抑制陽性對(duì)照抗體檢測(cè)的藥物濃度，并將此耐藥限度應(yīng)用于研究樣本抗藥抗體狀態(tài)的決策方面。這一做法存在一定的缺陷，因?yàn)槟退幮愿叨纫蕾囉谒褂玫年栃詫?duì)照，在同一個(gè)試驗(yàn)中，使用高親和力陽性對(duì)照可以獲得較低的耐藥性，而

34、低親和力對(duì)照獲得的耐藥性更高。因?yàn)榭顾幙贵w存在個(gè)體差異性，所以研究樣本的抗體獲得的真正的耐藥性可能會(huì)與陽性對(duì)照的耐藥性不同。事實(shí)上，當(dāng)有一個(gè)以上陽性對(duì)照時(shí)，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)每一個(gè)陽性對(duì)照會(huì)對(duì)應(yīng)一個(gè)不同的耐藥性值。因此，真正的耐藥性是無法確定的。與靈敏度類似，耐藥性僅限于了解試驗(yàn)中藥物是否會(huì)產(chǎn)生干擾，在方法的開發(fā)和優(yōu)化階段可以用于比較不同方法。盡管如此，確定耐藥性是監(jiān)管期望。為了測(cè)定藥物的耐藥性，先用系列稀釋的藥物對(duì)低濃度ADAQC進(jìn)行預(yù)孵育，然后再進(jìn)行檢測(cè)。抑制低濃度QC信號(hào)檢測(cè)的最低藥物濃度就是試驗(yàn)的藥物耐受限，該耐受限會(huì)隨著陽性對(duì)照的不同而改變。研究階段的生物分析報(bào)告中，當(dāng)在抗藥抗體陰性的樣本中

35、檢測(cè)藥物時(shí)，建議附上該抗藥抗體陰性樣本可能伴隨的藥物干擾聲明。精密度精密度是指分析方法一系列隨機(jī)測(cè)量值的變異程度，精密度的可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該在免疫分析的常用預(yù)期范圍內(nèi)；同時(shí)也應(yīng)該適合所用的平臺(tái)(例如，電化學(xué)發(fā)光法的標(biāo)準(zhǔn)要嚴(yán)于Elisa法)。建議采用平衡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行精密度性能驗(yàn)證，如附錄A(AppendixA)所示。篩選試驗(yàn)、特異性確證試驗(yàn)和滴定方法的精密度確定方法如下。如果可行，建議在研究階段將精密度試驗(yàn)適當(dāng)放大至預(yù)期實(shí)際使用規(guī)模。3.6.1篩選試驗(yàn)精密度2021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03

36、.092021.03.09歐陽法創(chuàng)編2021.03.09對(duì)試驗(yàn)對(duì)照品(陰性對(duì)照、高、低濃度陽性對(duì)照)進(jìn)行至少6次獨(dú)立檢測(cè)，分析相應(yīng)數(shù)據(jù)確定篩選試驗(yàn)精密度。以上數(shù)據(jù)可以通過附錄D(AppendixD)所述的靈敏度確定試驗(yàn)獲得。從以上試驗(yàn)中計(jì)算出高濃度陽性樣品和低濃度陽性樣品(剛好高于臨界點(diǎn))的不精確性，不精確性可以用變異系數(shù)(CV%)表示，變異系數(shù)表征了先關(guān)變異的來源。批內(nèi)分析精密度(也稱批內(nèi)精密度或內(nèi)部運(yùn)行精密度)和中間精密度(也稱運(yùn)行間精密度、批間精密度、中間精密度或整體精密度)都應(yīng)該用變異系數(shù)CV%表示，例如最近出版物的表示方式27。如果分析研究樣本是使用了分析員特異性臨界點(diǎn)，則應(yīng)該測(cè)定分

37、析員中間精密度(inter-analystCV)。3.6.2特異性確證試驗(yàn)精密度特異性確證試驗(yàn)精密度的目的是檢測(cè)信號(hào)抑制的重復(fù)性。為了計(jì)算百分抑制率(%)，特異性確證臨界點(diǎn)的確定試驗(yàn)中，在至少6次獨(dú)立運(yùn)行中，往高、低濃度對(duì)照組中加入適量的藥物。以上試驗(yàn)已經(jīng)有足夠的數(shù)據(jù)計(jì)算批間精密度，計(jì)算方式如3.6.1.穩(wěn)健性魯棒性能夠指示分析方法的可靠性。魯棒性是指當(dāng)方法的參數(shù)發(fā)生故意的微小變化時(shí)，分析方法不受影響的能力23。魯棒性關(guān)注的是在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)室發(fā)生真實(shí)生活的變化時(shí)分析方法的一致性。驗(yàn)證過程中魯棒性參數(shù)測(cè)定需要基于具體的分析方及其相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)28。應(yīng)該評(píng)估特定實(shí)驗(yàn)室哪些試驗(yàn)條件可能發(fā)生變化，并設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臏y(cè)

38、試，以檢查被認(rèn)為關(guān)鍵的參數(shù)。包括微孔板批次、孵育時(shí)間、溫度、每一次運(yùn)行的微孔板數(shù)、試劑批次和濃度或者設(shè)備。研究樣本或陽性對(duì)照樣本都可用于檢測(cè)魯棒性。建議在魯棒性驗(yàn)證過程中使用系統(tǒng)適用性控制的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)（在方法開發(fā)和優(yōu)化階段計(jì)算或驗(yàn)證系統(tǒng)適用性驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)）穩(wěn)定性穩(wěn)定性研究評(píng)估分析方法在預(yù)期樣品的儲(chǔ)存條件下的分析性能。理想狀態(tài)下，穩(wěn)定性測(cè)試條件應(yīng)模仿預(yù)期樣品和試劑的裝卸條件、儲(chǔ)存溫度和不同的儲(chǔ)存時(shí)間?？紤]到分析物的穩(wěn)定性，抗藥抗體的本質(zhì)屬性值得深思。不管抗藥抗體分析物是抗X藥物抗體還是抗Y藥物抗體，他們都是多克隆抗體。因此，有理由認(rèn)為抗藥抗體的穩(wěn)定性都是一樣的。按照這一邏輯，抗藥抗體的穩(wěn)定性接近血清或

39、血漿中任意抗原的免疫球蛋白的穩(wěn)定性。建議對(duì)每一物種的的基質(zhì)樣本分開進(jìn)行穩(wěn)定性表征，無論是臨床的還是非臨床的，然后在研究實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將試驗(yàn)結(jié)果推廣至所有的藥物檢測(cè)項(xiàng)目，有必要檢測(cè)來自目標(biāo)適應(yīng)癥(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的基質(zhì)。因此，并未規(guī)定分析不同藥物時(shí)樣品穩(wěn)定性都要分開進(jìn)行驗(yàn)證。需要注意一個(gè)事實(shí)，當(dāng)不同受試者注射不同的藥物時(shí)，產(chǎn)生的IgM，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的比例各不相同，不可以知道并模擬不同人群的免疫球蛋白的比例。因此使用該法評(píng)價(jià)分析物質(zhì)的穩(wěn)定性是合理的。加了陽性對(duì)照的藥物初治基質(zhì)可以用作模擬陽性樣本進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定，但是這樣的樣本是否能合理的模擬預(yù)期測(cè)試樣品需要科學(xué)的判斷。最好是能有多個(gè)不同濃度的陽性樣品，至少也要包含一個(gè)強(qiáng)陽性對(duì)照和一個(gè)弱陽性對(duì)照。更詳細(xì)的信息參見附錄F(AppendixF)。穩(wěn)定性表征還應(yīng)包括關(guān)鍵試劑的穩(wěn)定性，如質(zhì)量控制樣品、涂層試驗(yàn)板或芯片（如果有使用）以及