1、植入前胚胎染色體嵌合型的初步分析【摘要】目的應(yīng)用熒光原位雜交(fish)技術(shù)對(duì)人類(lèi)早期胚胎染色體的嵌合型進(jìn)展初步分析，并討論胚胎染色體嵌合型對(duì)常規(guī)體外受精-胚胎移植(ivf-et)成功率以及植入前診斷的影響。方法對(duì)ivf-et治療周期中胚胎質(zhì)量差、不適于胚胎移植和冷凍保存的正常受精胚胎以及在植入前胚胎性別診斷中診斷為男性胚胎、不能移植的38個(gè)胚胎進(jìn)展fish。結(jié)果38個(gè)胚胎共有293個(gè)核，雜交率為96.2%。其中正常胚胎12個(gè)，占31.6%，二倍體胚胎正常胚胎+二倍體嵌合型胚胎28個(gè)，占73.7%，嵌合型胚胎二倍體嵌合型胚胎+異常嵌合型胚胎19個(gè)，占50.0%。在4細(xì)胞期胚胎中，嵌合型胚胎占1

2、8.2%，但在58細(xì)胞期和9細(xì)胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分別增至68.4%和50.0%。結(jié)論隨著卵裂次數(shù)的增加，嵌合型胚胎所占的比例也增加，但嵌合型胚胎中嵌合細(xì)胞的比例卻隨之而降低。胚胎染色體的嵌合型可能是影響常規(guī)ivf-et成功率的重要因素。應(yīng)用fish技術(shù)可準(zhǔn)確地進(jìn)展單細(xì)胞植入前性別診斷，但在進(jìn)展植入前單基因診斷時(shí)，最好能同時(shí)活檢2個(gè)細(xì)胞，以增加準(zhǔn)確度。preliinaryanalysisfhrsesaiisinpreiplantatinebrysxuyanen,zhuangguanglun,shuyiin,etal.reprdutiveedialresearhenter,departe

3、ntfbstetrisandgynelgy,firstaffiliatedhspitalfsunyat-senuniversityfedialsienes,guangzhu510080,hina【abstrat】bjetiveusingflureseneinsituhybridizatintanalyzehrsesaiisinhuanpreiplantatinebrysandaesstheinfluenefsaiisninvitrfertilizatin-ebrytransfer(ivf-et)andpreiplantatingenetidiagnsis.ethdsnralfertilized

4、ebrys,hiherentsuitablefrebrytransferandrypreservatin,andaleebrysinpreiplantatingenderdiagnsisereanalyzedbyflureseneinsituhybridizatin.resultsthundredandninetythreenuleuseserefundang38ebrys.thehybridizatinrateas96.2%.telveebrys(31.6%)erenral.tenty-eightebrys(73.7%)erediplidebrys,hihinludednraldiplide

5、brysandebrysithdiplidsaiis.inadditin,19(50.0%)ebryserensideredtbehrsalsaisduetdiplidsaiisandabnralsais.thefrequenyfsaiisinreasedfr18.2%in4ell-stageebryst68.4%and50.0%in58ell-stageand9ell-stageebrysrespetively.nlusinthefrequenyfsaiisinreasesithsuessiveleavagedivisins.saiisaybeneftheiprtantfatrsaffeti

6、ngthesuessratesinivf-et.identifiatinfsexbyanalysisfasingleleavageellisaurate;hever,ituldbebettertbipsy2ellstredueerrrsinpreiplantatingenetidiagnsisfsinglegenediseases.【keyrds】insituhybridizatin,fluresene;saiis;preiplantatindiagnsis人類(lèi)生育才能較大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物低，35歲以下有生育才能的婦女每個(gè)排卵周期只有1/4的受孕可能1。而在常規(guī)試管嬰兒體外受精-胚胎移植(inv

7、itrfertilizatin-ebrytransfer,ivf-et)中，每一胚胎移植周期的成功率也只有1/4左右1。單純形態(tài)學(xué)參數(shù)只能粗略地估計(jì)胚胎的發(fā)育潛能，而80年代初，人們?cè)谘芯颗咛サ男螒B(tài)和著床的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)胚胎的染色體異?？赡苁怯绊懪咛ブ驳闹匾蛩?。近年來(lái)，在應(yīng)用熒光原位雜交flureseneinsituhybridizatin,fish技術(shù)，分析植入前胚胎也證實(shí)，染色體嵌合型不管在形態(tài)正常與否的胚胎中均占有一定的比例3。我們從1998年11月開(kāi)場(chǎng)，應(yīng)用雙色fish分析胚胎的性染色體，1999年5月開(kāi)場(chǎng)加用18號(hào)染色體探針進(jìn)展三色熒光原位雜交技術(shù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。資料與方

8、法一、研究對(duì)象取1998年11月1999年8月，本生殖醫(yī)學(xué)研究中心ivf-et治療周期中胚胎質(zhì)量差、不適于胚胎移植和冷凍保存的正常受精胚胎以及在植入前胚胎性別診斷中，診斷為男性胚胎、不能移植的胚胎共38個(gè)為研究對(duì)象，在受精后第24天進(jìn)展固定。二、方法1.細(xì)胞固定：將胚胎置于酸性酞假設(shè)液內(nèi)，當(dāng)透明帶被消化后轉(zhuǎn)移到n-2-羥乙基哌嗪-n-2-乙磺酸(hepes)緩沖液內(nèi)，用細(xì)管吹打至細(xì)胞散開(kāi)。取單個(gè)細(xì)胞放在已滴有1lteen-20/鹽酸(0.1%teen-20,0.01l/l鹽酸)的玻片上，在解剖鏡下觀(guān)察直至細(xì)胞溶解。待玻片枯燥后，在磷酸鹽緩沖液內(nèi)洗5in，然后依次用70%、85%和100%的乙醇

9、脫水。玻片可在-20保存4,5。2.對(duì)照淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)：用淋巴細(xì)胞行fish雜交率的對(duì)照。將染色體正常的成年男性外周血0.6l參加5l淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液rpi1640中，搖勻后置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)66h。在培養(yǎng)終止前參加秋水仙素2g/l,0.5l，然后用低滲液0.075l氯化鉀和固定液甲醇冰醋酸為31處理。最后將細(xì)胞懸液滴在清潔的玻片上，鏡下觀(guān)察染色體的分散情況，玻片在-20保存。3.fish:選用美國(guó)vysis公司的染色體計(jì)數(shù)探針。其中x染色體探針用橙色標(biāo)記，y染色體探針用綠色標(biāo)記，18號(hào)染色體探針用綠藍(lán)色標(biāo)記。變性時(shí)將玻片置于7370%的甲酰氨中5in，然后參加73已變性并混有雜交液的探針。蓋

10、上蓋玻片后用橡皮水泥封口，37雜交爐內(nèi)雜交24h。雜交完成后，將玻片置于730.4氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液/0.3%乙基苯基聚乙二醇0.4ss/0.3%nnidetp-40中2in和室溫下2ss/0.1%nnidetp-40中1in洗脫非特異性雜交，最后參加10l4，6-diaidin-2-plenylindle(dapi)復(fù)染劑復(fù)染后在奧林巴斯bx60熒光顯微鏡下分別用羅丹明、異硫氰酸熒光素和aqua濾片觀(guān)察結(jié)果。4.結(jié)果評(píng)定:當(dāng)細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)紅綠信號(hào)各1個(gè)和兩個(gè)綠藍(lán)色信號(hào)時(shí)，診斷為男性胚胎xy，1818。僅當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)紅色和兩個(gè)綠藍(lán)色信號(hào)時(shí)，才診斷為女性胚胎xx，1818。假如信號(hào)有分裂，但

11、兩個(gè)信號(hào)非常接近，互相有穿插或并排排列的兩者之間間隔 小于信號(hào)大小的一半時(shí)判斷為一個(gè)信號(hào)6,7。根據(jù)delhanty等1的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，將胚胎分成正常和異常兩大類(lèi)。正常胚胎即全部細(xì)胞核均為正常二倍體。異常胚胎再分為嵌合型、異常非嵌合型以及無(wú)規(guī)律分裂型3類(lèi)。根據(jù)嵌合型胚胎中占主導(dǎo)的細(xì)胞為正常二倍體還是其他異常核型，將其再分為二倍體嵌合型和異常嵌合型。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用2檢驗(yàn)和相關(guān)分析。結(jié)果一、對(duì)照淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果在對(duì)照的507個(gè)男性淋巴細(xì)胞中，99.6%的淋巴細(xì)胞有雜交信號(hào)，94.9%顯示正常男性核型xy，1818，異常核型包括3個(gè)x，1818，5個(gè)y，1818，5個(gè)xy，18，3個(gè)xyy，1818

12、，1個(gè)xxy，1818。二、fish結(jié)果38個(gè)胚胎共有293個(gè)核，282個(gè)核有雜交信號(hào)，雜交率為96.2%。11個(gè)核無(wú)雜交信號(hào)。正常胚胎12個(gè)，占31.6%，二倍體胚胎正常胚胎+二倍體嵌合型胚胎28個(gè)，占73.7%，嵌合型胚胎二倍體嵌合型胚胎+異常嵌合型胚胎19個(gè)，占50.0%。8個(gè)加用18號(hào)染色體探針的二倍體嵌合型胚胎中，單倍體/二倍體2個(gè)，三倍體/二倍體1個(gè)，四倍體/二倍體1個(gè)，非整倍體4個(gè)，其中單體性1個(gè)，染色體不別離3個(gè)。3個(gè)異常非嵌合型胚胎和4個(gè)無(wú)規(guī)律分裂型胚胎的碎片均25.0%。不同分裂期胚胎中，嵌合型胚胎所占比例不同。在4細(xì)胞期胚胎中，嵌合型胚胎占18.2%，但在58細(xì)胞期和9細(xì)

13、胞期胚胎中，嵌合型胚胎的比例分別增至68.4%和50.0%，兩者比擬，差異有顯著性(p0.05)。隨著分裂次數(shù)的增加，二倍體嵌合型胚胎中，嵌合型細(xì)胞的比例隨著胚胎細(xì)胞數(shù)目的增加而明顯減少(r=0.74，p=0.001)。討論一、嵌合型的發(fā)生率及其影響因素unn等8在比擬了4個(gè)中心的胚胎fish結(jié)果后報(bào)道，胚胎染色體嵌合型的發(fā)生率波動(dòng)在11%52%。嵌合型及其他染色體異常發(fā)生率的波動(dòng)受以下因素影響：(1)卵子培養(yǎng)和操作時(shí)溫度的改變；(2)母親年齡；(3)培養(yǎng)時(shí)氧濃度；(4)超排卵方案；(5)胚胎的形態(tài)及發(fā)育；(6)有無(wú)多核細(xì)胞；(7)檢測(cè)染色體的數(shù)目和號(hào)數(shù)。其中，培養(yǎng)系統(tǒng)和超排卵方案影響最大。本

14、研究中正常二倍體胚胎12個(gè)占31.6%，與laverge等9的結(jié)果相近，嵌合型胚胎比例偏高，占50.0%，這可能與局部胚胎質(zhì)量差、樣本量少和培養(yǎng)系統(tǒng)不同等因素有關(guān)。二、嵌合型的發(fā)活力理一般認(rèn)為，由于有絲分裂時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤染色體不別離或12個(gè)細(xì)胞極性改變可形成嵌合型胚胎。嵌合型發(fā)生的時(shí)間與卵裂有關(guān)。本研究中嵌合型胚胎所占的比例隨著胚胎細(xì)胞數(shù)目的增多而明顯增加，提示隨著卵裂次數(shù)的增加，有絲分裂發(fā)生錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)也增加，所以嵌合型胚胎所占的比例也隨之而增加。但嵌合型胚胎中嵌合型細(xì)胞的比例卻隨之而降低，假如嵌合型發(fā)生于第1次卵裂時(shí)，那么所有細(xì)胞均不正常，嵌合型發(fā)生于第2、3次卵裂時(shí)，其不正常細(xì)胞分別為50.0

15、%和25.0%6。本研究結(jié)果也支持這種觀(guān)點(diǎn)。近年來(lái)，在進(jìn)展卵子和胚胎極性的研究中，有學(xué)者提出嵌合型可能是胚胎發(fā)育過(guò)程中的正?，F(xiàn)象。嵌合型細(xì)胞可能發(fā)育較慢或停滯，并有可能開(kāi)展為滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，而不開(kāi)展為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，所以不一定會(huì)影響胚胎的正常發(fā)育。因此，胎兒的染色體異常率遠(yuǎn)沒(méi)有胚胎的異常率高10。三、胚胎嵌合型對(duì)ivf的影響在常規(guī)ivf中，胚胎的形態(tài)是最重要的評(píng)定胚胎質(zhì)量的指標(biāo)。但胚胎的形態(tài)學(xué)改變并不一定能真實(shí)地反映胚胎的發(fā)育潛能。雖然在形態(tài)正常的胚胎中嵌合型胚胎的比擬低，但亦占有一定的比例。1995年unn等3將胚胎分為發(fā)育停滯，發(fā)育緩慢和有碎片及正常形態(tài)3組進(jìn)展x,y,18,13/21號(hào)染色體的

16、fish，結(jié)果嵌合型胚胎分別為39.6%，25.2%和14.1%，3組之間差異有顯著性。本研究中也可見(jiàn)無(wú)規(guī)律分裂的胚胎和異常非嵌合型胚胎的形態(tài)較差，胚胎碎片均25.0%。另外也有學(xué)者分析了其他染色體，如delhanty等1報(bào)道，用x，y和1號(hào)染色體探針三色fish檢測(cè)，有嵌合型的胚胎占30.0%。由于存在一定比例的染色體異常，因此在常規(guī)ivf中，每個(gè)胚胎移植周期的成功率一直在25%左右。從另一個(gè)角度來(lái)說(shuō)，這可能也反映了人類(lèi)對(duì)異常胚胎的自然選擇和淘汰。四、染色體嵌合型對(duì)植入前診斷的影響盡管胚胎中有一定比例的嵌合型，但嵌合型不會(huì)對(duì)胚胎的性別診斷有影響11。本研究男性胚胎中無(wú)一例出現(xiàn)2個(gè)x信號(hào)和2個(gè)

17、18號(hào)染色體信號(hào)。但據(jù)報(bào)道，x在男性胚胎中約占12.0%5,11，因此不能單憑1個(gè)x信號(hào)就診斷為女性胚胎。本研究中還有一個(gè)無(wú)規(guī)律分裂的胚胎核型為xxxx，1818/xy，1818/xy，18/y，1818/3個(gè)x，1818，假如僅活檢xxxx，1818并將其診斷為女性胚胎也會(huì)造成誤診。所以必須同時(shí)出現(xiàn)2個(gè)x信號(hào)和2個(gè)18號(hào)染色體信號(hào)時(shí)才診斷為女性胚胎。在本研究后期加用18號(hào)染色體探針從而可以區(qū)分單體性和單倍體細(xì)胞。如在x中有2個(gè)18號(hào)染色體的信號(hào)，就應(yīng)診斷為單體性細(xì)胞，而x中僅有1個(gè)18號(hào)染色體的信號(hào)，應(yīng)診斷為單倍體細(xì)胞?；罱M織檢查時(shí)，取出這兩種細(xì)胞均會(huì)對(duì)植入前單基因疾病的診斷造成不良的影響。

18、ku等11報(bào)道，7號(hào)和18號(hào)染色體的喪失率分別為3.7%和3.3%。harper等12那么報(bào)道用1號(hào)和17號(hào)染色體探針雜交時(shí)，少于二倍體信號(hào)的細(xì)胞占15%。本研究中，104個(gè)用3種探針雜交的細(xì)胞核中，其中9個(gè)細(xì)胞核缺少1個(gè)18號(hào)染色體信號(hào)，信號(hào)缺失率為8.7%。因此，在進(jìn)展植入前單基因診斷時(shí)最好能同時(shí)活檢2個(gè)細(xì)胞，以增加準(zhǔn)確度。參考文獻(xiàn)1，delhantyjd,harperj,aa,etal.ultilurfishdetetsfrequenthrsalsaiisandhatidivisininnralpreiplantatinebrysfrfertilepatients.hugenet,199

19、7,99:755-760.2，angellrr,aitkenrj,vanlkpfa,etal.hrseabnralitiesinhuanebrysafterin-vitrfertilizatin.nature，1983，303:336-338.3，unns,alikani,tking,etal.ebryrphlgy,develpentalrates,andaternalagearerrelatedithhrseabnralities.fertilsteril,1995,64:382-391.4，nere,harperj,raaekersfs,etal.presenefhrsalsaiisinabnralpreiplantatinebrysdetetedbyfish.hugenet,1994,54:609-615.5，徐艷文，莊廣倫，周燦權(quán)，等.應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)展人類(lèi)早期胚胎性染色體嵌合型的初步研究.中華婦產(chǎn)科雜志，1999，34：603-605.6，unns,eierhug,grifj，etal.hrsesaiisinhuanebrys.bilreprd,1994,51:373-379.7，unns,daileyt,finkelstein,etal.redutininsignalverlapresultsininrea