1、植物(zhw)的抗寒性檢測主講人員(rnyun)：小組代號：小組成員：共二十四頁Company Logo實驗(shyn)主要內(nèi)容實驗(shyn)背景實驗目的實驗原理實驗步驟1234 注意事項5共二十四頁Company Logo實驗背景我國植物種類繁多，分布區(qū)域廣，在晚秋和早春時期發(fā)生的凍害和冷害兩種低溫危害，常常給越冬作物和果木造成嚴重(ynzhng)傷害。凍害由 0以下低溫造成，冷害由 0以上低溫引起，冷害對植物的傷害程度，除取決于低溫外，還取決于低溫維持時間的長短。植物抗寒性的強弱決定(judng)其生長季節(jié)，因此蔬菜作物利用抗寒品種，可以將露地栽培提前，提早供應市場；而選育抗寒性強的果樹

2、品種，不僅是寒帶果樹育種者的主攻方向，而且也是溫帶甚至熱帶果樹育種者重要育種目標之一。本實驗重點學習實驗室間接鑒定植物抗寒性的檢測方法。共二十四頁Company Logo實驗(shyn)目的Your Text hereYour Text hereYour Text here 1、了解(lioji)植物的抗寒性機制并掌握實驗室間接鑒定抗寒性的檢測方法。 2、掌握用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)分離 POD 同工酶的原理和技術(shù)。共二十四頁Company Logo實驗(shyn)原理 實驗室間接鑒定(jindng)就是根據(jù)作物某些生理生化指標及物理指標間接推斷供試材料的抗寒性。 在一定低溫范圍內(nèi)，植物

3、體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間基本上可以保持平衡。當溫度持續(xù)下降時，活性氧自由基就會明顯增加，清除劑含量降低，導致自由基積累，造成膜脂氧化。生理生化指標主要包括超氧物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性測定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。共二十四頁Company Logo實驗(shyn)原理本實驗采用(ciyng)同工酶分析測定法。同工酶帶相對遷移率計算：Rf 酶帶遷移距離/溴酚藍遷移距離研究表明，過氧化物同工酶與植物抗寒性的關系極為密切，抗寒性強的品種的同工酶帶一般比抗寒性差的品種多 13 條，且隨著溫度下降變化緩慢。共二十四頁Company Lo

4、go實驗(shyn)步驟實驗(shyn)步驟6、同工酶帶相對遷移率計算1、材料處理 2、貯液的配制3、凝膠板的制備4、電泳5、染色共二十四頁Company Logo一、材料(cilio)處理植物枝條（花朵），將采回的枝條剪成 40cm 左右的長度，用自來水沖洗數(shù)遍（洗掉泥土、灰塵），再用蒸餾水沖洗三次，然后用吸水紙吸干水分，最后將枝條末端進行(jnxng)蠟封。將每個品種蠟封后的枝條分成相等的6 份，其中一份作為對照，其余每份作為一個低溫處理，放于冰箱中（04）保存?zhèn)溆谩Ｃ看翁幚頃r，各取參試品種的一份枝條放于超低溫冰箱低溫處理，處理溫度梯度為：CK（0），-20，-25，-30，-35，-40

5、。降溫速度為 4/h，達到目的處理溫度后維持 12h，然后逐步升溫，升溫速度亦為 4/h?；ǘ涞奶幚頊囟忍荻葹椋篊K（0），-1，-3，-5，-6，-7，-8。共二十四頁Company Logo二、貯液的配制(pizh)A30%Acr0.8%Bis 貯液B1M Tris-HCl 緩沖液（pH 值 8.8）C1M Tris-HCl 緩沖液（pH6.8）D電極(dinj)緩沖液E1%過硫酸銨溶液F溴酚藍溶液貯液的詳細配制共二十四頁Company Logo三、凝膠板的制備(zhbi)分離膠的制備分離膠濃度多為 7%，按照表 53 進行配制。先用刻度吸管準確地吸取 30%Acr0.8%Bis 和 1M

6、 Tris-HCl（pH8.8）于抽濾瓶中，用電動吸引器減壓(jin y)抽氣，除去溶液中氣泡，抽氣畢，再加入 1%過硫酸銨溶液和 TEMED，搖勻后，小心地將凝膠加入凝膠板模具內(nèi)，上面加一水層，在 2530的地方進行聚膠，約 1h。共二十四頁Company Logo表 53 貯 液不同配量及凝膠濃度所需貯液（ml）20ml30ml5%7%10%5%7%10%30%Acr0.8%Bis3.24.56.54.96.89.71M Tris-HCl pH8.816.315.013.024.322.419.51%過硫酸銨0.50.50.5400.80.8TEMED（為l）202020404040共二十

7、四頁Company Logo隔層膠的配制按表 54 進行隔層膠的配制，用刻度吸管準確吸取 30%Acr0.8%Bis 和 1M Tris-HCl（pH6.8）于抽濾瓶中，用電動吸引器減壓抽氣，與此同時，吸去分離膠上層的水層，抽氣畢，加入 1%過硫酸銨溶液和TEMED，立即灌注隔層膠（凝膠板需要迅速(xn s)加入蓖子），其中加一水層，約 1h 可聚合好。共二十四頁Company Logo表 54貯 液不同配量及凝膠濃度所需貯液（ml）10ml20ml3%4%3%4%30%Acr0.8%Bis1.01.32.02.61M Tris-HCl pH6.81.01.32.02.6重蒸水7.77.115

8、.414.21%過硫酸銨0.30.30.60.6TEMED（為l）15153030共二十四頁Company Logo加樣裝置好垂直(chuzh)板電泳槽，用 1%熱瓊脂封好縫隙。樣品制備：每克鮮樣加 3.0ml 0.1mol/L 的磷酸緩沖液（pH7.0），研磨，用紗布粗過濾。濾液離心：4000r/min，（02），取上清液作供試酶液。用 10 伏/厘米預電泳三分鐘后，用微量進樣器吸取樣品液分別每管加入 50 微升。共二十四頁Company Logo四、電泳(din yn)加樣畢，注電極緩沖液入上、下電泳槽，在上槽中加入(jir)一滴溴酚藍。接通電源，上槽為負極，下槽為正極。調(diào)節(jié)電流為 2 毫

9、安/厘米（2 毫安/管），在冰箱內(nèi)進行。待溴酚藍遷移至下端約 0.51cm 處停止電泳，約 2h。共二十四頁Company Logo五、染色(rns)將脫下的凝膠，用去離子水沖洗凝膠板后，放入長方型白瓷盤中染色。A染色貯液配制 0.2M 醋酸鈉溶液：稱 2.8g 醋酸鈉溶于 100ml 重蒸水中。 5mM 硫酸錳溶液：稱取 0.168g 硫酸錳，溶于 200ml 重蒸水中。 聯(lián)苯胺溶液：稱 0.5g 聯(lián)苯胺，溶于 10%冰醋酸 250ml 中。 愈創(chuàng)木酚溶液：稱 1.35g 愈創(chuàng)木酚，溶于 250ml10%醋酸中。以上四種溶液放冰箱(bngxing)中長期備用。 0.12%H2O2：凝膠洗出后

10、才加。隨配隨用。共二十四頁Company LogoB染色配比：20：2：5：8：5C染色將配好的染色液倒入白瓷盤內(nèi)凝膠板上，37保溫 30min，酶帶呈紫紅色。取出漂洗后，7%醋酸中保存。過氧化物(u yn hu w)酶同工酶顯色 23d 更為清楚，在暗室用透光照相的方法效果較好。也可用280mm 波長下用光密度計掃描定量。共二十四頁Company Logo六、同工酶帶相對(xingdu)遷移率計算研究表明，過氧化物同工酶與植物抗寒性的關系極為密切，抗寒性強的品種的同工酶帶，一般比抗寒性差的品種多 13 條，且隨著(su zhe)溫度下降變化緩慢。共二十四頁Company Logo注意事項密封

11、條要封好，不能漏水；灌膠時用移液管，可以慢一點，并水平移動，防止凝膠不均勻，凝膠不會很快凝固，所以(suy)不用擔心；灌膠時不能有氣泡產(chǎn)生，否則會影響后面凝膠的效果。共二十四頁Company LogoA30%Acr0.8%Bis 貯液：稱取 30gAcr 和 0.8gBis，用 50ml 重蒸水加熱溶解(rngji)，將溶液用定性濾紙過濾到 100ml 容量瓶內(nèi)，定容后盛于棕色瓶中，于 0-4冰箱中保存。B1M Tris-HCl 緩沖液（pH 值 8.8）：稱取 121.14gTris 用重蒸水溶解后倒入 1000ml容量瓶中，用濃鹽酸調(diào) pH 值至 8.8，最終加水定容至 1000ml，然后

12、用濾紙過濾，盛于棕色瓶中，放入 04冰箱保存。共二十四頁Company LogoC1M Tris-HCl 緩沖液（pH6.8）：稱 12.114gTris 用重蒸水溶解(rngji)后倒入 100ml 容量瓶中，用濃鹽酸調(diào) pH 值至 6.8，最終加水定容至 100ml，然后用濾紙過濾，盛于棕色瓶中，放入 04冰箱保存。D電極緩沖液：稱取 141.1g 甘氨酸和 30g Tris 用重蒸水加熱溶解后倒入 1000ml 容量瓶中，加水定容至 1000ml。用時稀釋 20 倍，調(diào) pH 值至 8.3。共二十四頁Company LogoE1%過硫酸銨溶液(rngy)：稱 0.5g 過硫酸銨溶于 50ml 重蒸水中，放入 04冰箱，可保存一周。F溴酚藍溶液：稱 0.2g 溴酚蘭溶于 100ml 重蒸水中，配成 0.2%。共二十四頁Thank You !共二十四頁內(nèi)容摘要植物的抗寒性檢測。育種者重要育種目標之一。1、了解植物的抗寒性機制并掌握實驗室間接鑒定抗寒性的檢測方法。2、掌握用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)分離 POD 同工酶的原理和技術(shù)。實驗室間接鑒定就是(jish)根據(jù)作物某些生理生化指標