1、卵黃抗體生產(chǎn)及應(yīng)用技術(shù)進(jìn)展李建濤2003年6月內(nèi)容一、生產(chǎn)技術(shù)二、應(yīng)用技術(shù)三、問題及展望一、 生產(chǎn)技術(shù)(一) IgY產(chǎn)生過程(二) IgY轉(zhuǎn)移時(shí)間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因素(三）IgY結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(四) IgY相對(duì)與IgG的優(yōu)勢(shì)(五) IgY純化、活性測(cè)定及保存(一) IgY產(chǎn)生過程 1.腔上囊是禽類特有的控制體液免疫的淋巴器官； 2.腔上囊中B細(xì)胞受到抗原刺激后分化成漿細(xì)胞，后者 分泌抗體進(jìn)入血液； 3.通過血液循環(huán)和輸卵管上皮層分泌濾泡，產(chǎn)蛋雞將母 源抗體選擇性分泌到卵黃內(nèi)； 4.卵黃中Ig主要是IgG，叫IgY（IgM和IgA轉(zhuǎn)移到蛋清中）； 5.小雞通過IgY實(shí)現(xiàn)獲得性被動(dòng)免疫(豬、牛、馬屬通

2、過初乳；兔通過胎盤)； 6.卵黃中含有多種不同抗體（約200種，滴度取決于暴露程度；M.Coleman,2000)； 7.用某種病原菌免疫母雞，可產(chǎn)生特異性IgY， Sugita等（1996）用26種甲醛滅活病原菌免疫產(chǎn)蛋雞，IgY 可預(yù)防多種疾病。(二) IgY轉(zhuǎn)移時(shí)間、產(chǎn)量及影響產(chǎn)量的因 素 1.用HI、ELISA、ID檢查卵黃中IgY，抗體應(yīng)答形成時(shí)間 晚于血清12周（Theresa H P,1985；鴨腺病毒），以后與血清測(cè)得的HI滴度一致，也有報(bào)道卵黃卵黃抗體具有累積作用； 2.經(jīng)加強(qiáng)免疫，卵黃中特異性IgY效價(jià)能維持?jǐn)?shù)月奶至1年； 3.一個(gè)卵黃約含100400 mgIgY，一只產(chǎn)蛋

3、雞每年可獲 得4050gIgY（D .Carlander,2002），相當(dāng)與30只家兔同期內(nèi)血清IgG 產(chǎn)量； 4.卵黃中抗原特異性抗體數(shù)量占IgY平均10%，范圍是5%（抗胰島素抗體）28%（抗鼠IgG抗體），取決于免疫個(gè)體、免疫程序及抗原的免疫原性；續(xù)（2） 5.影響IgY產(chǎn)量的因素包括： （1）抗原的質(zhì)與量（顆粒/可溶性抗原、類毒素/菌體抗原、活菌/死菌，免疫麻痹；高免疫原性和安全） （2）機(jī)體方面，A包括產(chǎn)蛋雞品種（來(lái)航雞、洛島紅雞及其雜交后代的特異性IgY最高平均濃度有顯著差異（D Carlander,2002)、B產(chǎn)蛋率和產(chǎn)蛋間歇與IgY濃度、C蛋重及卵黃重、D營(yíng)養(yǎng)影響免疫系統(tǒng)發(fā)育

4、、免疫機(jī)能狀況和生產(chǎn)性能、E健康狀況（SPF雞群，起碼應(yīng)無(wú)免疫抑制性疾病和垂直傳播性疾病，對(duì)父母代IBD的免疫） （3）免疫途徑、免疫程序、佐劑續(xù)（3） 6.生產(chǎn)卵黃抗體典型的免疫程序（Li-Chan等，2000）： (1)首免，胸肌注射0.51mg/羽弗氏完全佐劑等體積乳化抗原； (2)首免后第3、5、7和25周用弗氏不完全佐劑乳化抗原進(jìn)行24次加強(qiáng)免疫，劑量逐步放大12倍。這種多次注射加強(qiáng)劑量的抗原使之產(chǎn)生較高自動(dòng)獲得性免疫的過程，稱之為“超免疫作用”。（三）IgY結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 1.分子量160180kDa，稍大于IgG（ 160kDa ）； 2.多一穩(wěn)定區(qū)而少一鉸鏈區(qū)（鉸鏈區(qū)有較多脯氨酸，具

5、有韌性，與抗體分子構(gòu)型變化有關(guān)）；續(xù)（1） 這種差異沒有影響IgY的抗原-抗體結(jié)合特性和結(jié)合能力，結(jié)合價(jià)也是2（Warr等, 1995），然而對(duì)于pH、溫度及蛋白水解等引起構(gòu)象變化的環(huán)境條件，IgY比IgG穩(wěn)定； 由于缺乏鉸鏈區(qū)，兩個(gè)抗原結(jié)合片段（Fab）緊密排列，使IgY缺少韌性及功能種類，在確定條件下沉淀及聚合反應(yīng)能力降低（Warr等，1995），這使其具有抵抗幼齡動(dòng)物胃酸屏障的能力。 3.IgY能介導(dǎo)過敏反應(yīng)，與哺乳動(dòng)物的IgE相似。（四） IgY相對(duì)IgG的優(yōu)勢(shì)1.高度保守的哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)對(duì)禽有較強(qiáng)的免疫原性，且產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小（Danielpour.D,1993），如IG

6、F-1，且免疫應(yīng)答快；2.免疫反應(yīng)具有交叉性，血緣越近，交叉反應(yīng)程度越高；由于結(jié)構(gòu)上差異，IgY 與IgG幾乎沒有交叉免疫反應(yīng)，減少了非特異結(jié)合和假陽(yáng)性；減少非特異性結(jié)合使免疫學(xué)檢測(cè)靈敏性提高（達(dá)50%）；3. IgY具有較強(qiáng)的抗熱、抗酸、抗離子強(qiáng)度和一定的抗酶分解能力（相對(duì)于IgG），提純后IgY在合適條件儲(chǔ)存10年滴度沒有損失（Olovson等，1993），幼畜可以口服，經(jīng)保護(hù)處理后成年動(dòng)物也可以口服，提純后可以肌注（孫希琪，1995） ；4.USDA和FDA認(rèn)為卵黃抗體是GRAS（generally regarded as safe）且已允許商業(yè)生產(chǎn)用于人； 續(xù)（1）5.符合動(dòng)物福利原則

7、。 因此，IgY具有可規(guī)模生產(chǎn)、成本低、特異性抗體含量高、安全性好等優(yōu)點(diǎn),比實(shí)驗(yàn)室條件下通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備有限的高免血清更有實(shí)用性。 （五）IgY純化、活性測(cè)定及保存 1.雞蛋儲(chǔ)存在+4條件下6個(gè)月IgY活性損失很小。用做食品和飼料添加劑，或獸醫(yī)臨床上，IgY多以全卵黃或其水溶液的形式直接利用，或制成干粉利用。2.用于診斷分析或純化生物活性分子，或在人醫(yī)臨床上則需要提高IgY純度或提純特異性IgY。 IgY純化分三步： 第一步是粗提，將含有IgY的水溶性蛋白與水不溶的脂類和脂蛋白分離，即除去脂質(zhì)；方法有超濾、有機(jī)溶劑萃取、以及PEG、SDS沉淀脂蛋白等，經(jīng)粗提的上清液或水溶液中IgY含量占蛋白質(zhì)

8、的15%； 第二步用硫酸葡聚糖鈉等進(jìn)一步沉淀，提純出純度大于80%的IgY，此時(shí)的IgY要低溫或凍干保存；續(xù)（1） 第三步是精提法：使用凝膠滲透層析、陰離子交換層析或超濾方法進(jìn)一步純化，獲得純度96%99%的IgY。 3.Akita等建立的水稀釋法：先在微酸條件下用水稀釋卵黃，分離出卵黃蛋白；再用鹽析、超濾、乙醇沉淀、凝膠過濾等進(jìn)一步純化IgY。4.特異性抗體采用親合色譜法純化，離子交換層析法濃縮；或用免疫親合法直接從水溶液中提取。5.普洛瑪格公司的卵黃抗體純化系統(tǒng)（Promegas EGGstract IgY）提供了快速和簡(jiǎn)易的IgY分離方法。該系統(tǒng)能在約1小時(shí)內(nèi)提取25mg/ml純度75%

9、的IgY。續(xù)（2）6.提純方法的選擇取決于IgY產(chǎn)量、純度、費(fèi)用要求和技術(shù)水平。 7.常用ELISA測(cè)定IgY活性。8.提純后抗體冷凍或凍干保存。50%（w/v）蔗糖能在熱、酸和高壓等加工條件下阻止IgY變性，在不能冷藏或在加工過程中保護(hù)IgY活性。9. 對(duì)提純的IgY進(jìn)行微膠囊化處理能顯著增強(qiáng)起抗胃蛋白酶和胃酸的能力。 二、 IgY應(yīng)用技術(shù) IgY上述優(yōu)勢(shì)及其對(duì)病原菌感染的防御無(wú)動(dòng)物種屬差異使其在傳染病的預(yù)防、診斷及治療、免疫抗體監(jiān)測(cè)、免疫分析、酶聯(lián)分析以及做為功能食品因子和抗生素替代品都很有用，特別是用雞高免卵黃抗體防治其他動(dòng)物和人的腸道疾病。內(nèi)容（一）在家禽中的應(yīng)用（二）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)

10、用（三）對(duì)仔豬和犢牛腹瀉的防治（四）在奶牛上的應(yīng)用（五）在人醫(yī)上的應(yīng)用（一）在家禽中的應(yīng)用1.目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用卵黃抗體防治的禽病有傳染性法氏囊、雞新城疫、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、番鴨細(xì)小病毒、雞減蛋綜合征等。2.用IgY治療IBD和ND混合感染。 3.抗沙門氏菌LPS特異IgY阻止禽蛋和禽肉中沙門氏菌粘附、控制其增殖上發(fā)揮明顯作用（H.H.Sunwoo等，2000）。 4.IgY對(duì)雛雞傳染病的預(yù)防有獨(dú)到優(yōu)點(diǎn)；用于緊急預(yù)防接種見效快；5.IgY代替血清抗體對(duì)禽傳染病做出診斷和疫苗免疫后抗體水平監(jiān)測(cè)。（二）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用1.通過飼料用IgY治療鰻魚愛德華氏菌癥。（三）IgY對(duì)仔豬和犢牛腹瀉的防治 1

11、.幼齡動(dòng)物消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，吸收初乳的同時(shí)口服特異性IgY， 保護(hù)作用將顯著增強(qiáng)。這方面應(yīng)用最多的是對(duì)仔豬大腸桿菌及仔 豬、羔羊輪狀病毒腹瀉的治療。2.大腸桿菌導(dǎo)致仔豬腹瀉及抗大腸桿菌菌毛I(xiàn)gY阻止其在小腸粘膜上 附著，體外粘著抑制試驗(yàn)支持這一假設(shè)（Yokoyama等,1992）。3.李國(guó)平等（2002）證明：仔豬出生后頭36小時(shí)內(nèi)口服IgY不被分解， 和注射效果無(wú)差異。卵黃抗體與菌毛抗原的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過母乳 及高免血清中抗體與抗原的親和力，對(duì)控制此病極為有利 。4.如分離自家病原制備IgY用于本豬場(chǎng)腹瀉防治，更有針對(duì)性，其效 果優(yōu)于抗生素。續(xù)（1）5.卵黃抗體治療仔豬黃痢的效果(肖馳，1

12、997) 注：與其它三組相比，差異極顯著（p0.005） 6.人工攻毒試驗(yàn)證明，含特異性牛冠狀病毒（BCV）或產(chǎn) 毒素大腸桿菌的卵黃和初乳具有類似防治犢牛腹瀉的 效果。 組別治療數(shù)治愈數(shù)治愈率卵黃抗體慶大霉素土霉素痢特靈 131685733 128534523 97.7177.9478.9569.69 （四）IgY在奶牛上的應(yīng)用 1.乳房炎給奶業(yè)帶來(lái)巨大損失，在美國(guó)，1992年乳房炎造成十億美元損失；3.SCC是衡量乳房感染與否及感染程度的指標(biāo)，主要病原是葡萄球菌和鏈球菌；4.日糧中特異性抗葡萄球菌和鏈球菌IgY顯著降低了SCC；5.IgY給量與產(chǎn)奶量和奶中無(wú)脂固型物增加相關(guān)；6.M Cole

13、man(2000推測(cè))，IgY酶解片段（Fab）含9-11個(gè)氨基酸，可能不再降解而被吸收進(jìn)入血液，仍能在循環(huán)中發(fā)揮活性作用。（五）IgY在人醫(yī)上的應(yīng)用 1.通過口服病原特異性抗體建立人被動(dòng)免疫保護(hù)，特別是對(duì)于胃腸道抗原。雞蛋是正常的食物組成，口服IgY沒有毒副作用的風(fēng)險(xiǎn)，是人們喜歡的口服免疫治療物品。 2.用抗鏈球菌卵黃抗體漱口能減少鏈球菌在牙齒琺瑯質(zhì)上的定居（Hatta H等，1997），有效預(yù)防齲齒。3.雖然可以通過遺傳工程設(shè)計(jì)出HIV顆粒的許多抗原決定簇，由于HIV不斷變異，使抗HIV抗原決定簇的單克隆治療AIDS病人缺乏長(zhǎng)期效果；IgY是多抗，能同時(shí)識(shí)別幾個(gè)位點(diǎn)，提高了結(jié)合HIV顆粒的

14、機(jī)會(huì)，使免疫系統(tǒng)除去HIV。4.卵黃抗體保護(hù)免疫抑制病人或治療先天性免疫缺陷患兒。5.IgY作為分泌型IgA的替代物，為免疫抑制病人內(nèi)臟表面提供保護(hù)。 續(xù)（1）6.與抗生素相比，IgY不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，是安全、有效、廉價(jià)的方式。人醫(yī)上用IgY預(yù)防小兒病毒性腹瀉已取得理想的結(jié)果。開發(fā)功能性食品。三、問題及展望1.現(xiàn)代免疫技術(shù)、最新生化分離技術(shù)、雞蛋的工業(yè)化加工綜合利用技術(shù)相結(jié)合生產(chǎn)卵黃抗體是解決我國(guó)雞蛋生產(chǎn)供大于求、提高蛋雞附加值有效措施。2.IgY作為一種經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)多克隆抗體（PcAb）的方法，多種病毒、霉形體、棘球絳蟲、酶、激素、Ig、動(dòng)物毒素等的特異性IgY已成功制備（羅函祿，1997）

15、。3.經(jīng)濟(jì)、高效的分離純化技術(shù)是關(guān)鍵。4.缺點(diǎn)及需要解決的問題。5.發(fā)展趨勢(shì)。感謝大家9、春去春又回，新桃換舊符。在那桃花盛開的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽(yáng)光，心情像桃花一樣美麗，日子像桃子一樣甜蜜。2022/7/242022/7/24Sunday, July 24, 202210、人的志向通常和他們的能力成正比例。2022/7/242022/7/242022/7/247/24/2022 8:14:02 AM11、夫?qū)W須志也，才須學(xué)也，非學(xué)無(wú)以廣才，非志無(wú)以成學(xué)。2022/7/242022/7/242022/7/24Jul-2224-Jul-2212、越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔

16、別人的錯(cuò)兒。2022/7/242022/7/242022/7/24Sunday, July 24, 202213、志不立，天下無(wú)可成之事。2022/7/242022/7/242022/7/242022/7/247/24/202214、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If Id gone alone, I couldnt have seen nearly as much, because I wouldnt have know