1、1、工業(yè)菌種改良的方法有哪些？（1）解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟：通過(guò)增加特定基因的拷貝數(shù)或增加 相應(yīng)基因的表達(dá)能力來(lái)提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝 步驟，由此提供一個(gè)旁路代謝途徑。（2）增加前體物的濃度。（3）改變代謝途徑，減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成以及提高 菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。（4）抑制或消除產(chǎn)品分解酶。（5）改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。（6）消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。 如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性。2、基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌落中篩選出含有陽(yáng)性重組子的菌 落，并鑒定重組子的正確性，有哪些方法，其原理是什么？一、抗藥性標(biāo)志的篩選：如果克隆載體帶

2、有某種抗藥性標(biāo)志基因如ampr或tetrr ,轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)菌才能在含該抗菌素的平 板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。如果重組 DNA時(shí)將外源基因插入標(biāo)志基因內(nèi)，該標(biāo)志基因失活，通過(guò)有無(wú)抗菌素培 養(yǎng)基對(duì)比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。 二、（3半乳糖甘酶系統(tǒng)篩選：很多載體都攜帶一段細(xì)菌的lacZ基因，它 編碼B半乳糖甘酶N-端的146個(gè)氨基酸，稱(chēng)為肽，它表達(dá)B半乳糖 昔酶的C-端肽鏈。當(dāng)宿主的細(xì)胞的（3半乳糖甘酶基因發(fā)生刪除突變，缺 失N一端的一段氨基酸序列，使酶失活，但在-肽存在時(shí)可以互補(bǔ)使酶恢復(fù)活性。攜帶pUC質(zhì)粒載體的

3、大大腸桿菌在異丙基硫代-&D-半乳糖甘（isopropylthio-&D-半孚L糖昔，ITPG）的誘導(dǎo)下發(fā)生 互補(bǔ)，可使呈色底 物5-澳-4-氯-3/引噪-&D-半乳糖甘被分解產(chǎn)生藍(lán)色。而重組子由于基因插 入使肽基因失活，不能形成互補(bǔ)，在含X-gal （5-澳-4-氯3呻噪 -&D-半乳糖甘）的平板上，含陽(yáng)性重組子的細(xì)菌為無(wú)色菌落或噬菌斑。三、菌落快速裂解鑒定法： 從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測(cè) 載體質(zhì)粒大小，判斷有無(wú)插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子 初篩。四、內(nèi)切酶圖譜鑒定：經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離 出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體 DNA,用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，

4、釋放出插入片斷； 對(duì)于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。五、重組DNA的鑒定3、什么是微生物的生物轉(zhuǎn)化？有什么特點(diǎn)？簡(jiǎn)述微生物轉(zhuǎn)化的一般過(guò)程？ 微生物的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)定義：是利用生物細(xì)胞對(duì)一些化合物某一特定部位（基團(tuán)）的作用，使它轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相類(lèi)似但具有更在經(jīng)濟(jì)價(jià)值的化合物.最終 產(chǎn)物是由微生物細(xì)胞的酶或酶系對(duì)底物某一特定部位進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而形成 的。微生物的生物轉(zhuǎn)化特點(diǎn)：1、生物轉(zhuǎn)化具有化學(xué)變化的單元反應(yīng)多類(lèi)型。由于微生物轉(zhuǎn)化對(duì)爸體激素藥物工業(yè)所起的重大作用，因此人們對(duì)微生物生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的研究與其他化合物的微生物轉(zhuǎn)化來(lái)比較，是研究得最為深人 廣泛的彳散生物幾乎對(duì)爸休的每個(gè)位

5、置都能進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涉及的反應(yīng)類(lèi)型也最 為廣泛；2微生物的生物轉(zhuǎn)化起著立體專(zhuān)一性催化劑的作用.不同的化學(xué)變 化單元反應(yīng)類(lèi)型，發(fā)生在化合物分子的不同位置。反應(yīng)可在分子中通常因 活性不足而不能用化學(xué)方祛生反應(yīng)的位置進(jìn)行。反應(yīng)通常是含有幾種酶的 一種微生物來(lái)完成的。3彳散生物的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)率高。微生物轉(zhuǎn)化的一般過(guò)程：1、制備培養(yǎng)系統(tǒng)：選擇優(yōu)良的培養(yǎng)物，使其生活 在合適的環(huán)境中，達(dá)到足夠的菌體，這些菌體是生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的催化劑。2、 加入底物：底物加入的時(shí)間與方法是重要的考慮因素。3、加入效應(yīng)物：效應(yīng)物是反應(yīng)后未改變的化合物。效應(yīng)物分抑制劑或激活劑。加入抑制劑， 可以有效抑制副反應(yīng)。這些化合物加入的時(shí)間和

6、方法也十分重要。 4、保溫 反應(yīng)：在合適的環(huán)境條件下進(jìn)行保溫，直至轉(zhuǎn)化反應(yīng)完成。5、監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程：間歇取樣并監(jiān)測(cè)底物與產(chǎn)物水平、pH、細(xì)胞量、能源和其他參數(shù)。6、 終止反應(yīng)：當(dāng)樣品分析表明產(chǎn)物積累停止，則移去活性細(xì)胞，停止反應(yīng)。7、 產(chǎn)物分離：生物轉(zhuǎn)化的溶劑主要是水，產(chǎn)物在水中濃度相對(duì)較低，經(jīng)過(guò)分 離和純化得到產(chǎn)物。4、分解代謝物阻遏作用與環(huán)腺甘酸（cAMP）的濃度有什么關(guān)系？ 分解代謝物阻遏作用與環(huán)腺甘酸（cAMP）的濃度有關(guān)。當(dāng)存在容易利用的碳源時(shí)（如葡萄糖），cAMP濃度低-cAMP-CRP 復(fù)合物不能形成一 cAMPCRP復(fù)合物不與啟動(dòng)基因結(jié)合 -RNA聚合酶不 能結(jié)合到啟動(dòng)基因上一無(wú)

7、法轉(zhuǎn)錄、翻譯一不能合成酶；當(dāng)容易利用的碳 源（如葡萄糖）不存在，cAMP濃度高-cAMP-CRP復(fù)合物能形成一cAMP CRP復(fù)合物與啟動(dòng)基因結(jié)合 -RNA聚合酶能結(jié)合到啟動(dòng)基因上 一 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯一進(jìn)行酶的合成。5、比較單級(jí)萃取、多級(jí)錯(cuò)流萃取、多級(jí)逆流萃取的優(yōu)缺點(diǎn)？單級(jí)萃取：流程簡(jiǎn)單，效率不高，增加萃取劑的用量會(huì)使產(chǎn)品的濃度降低， 對(duì)萃取劑的處理、回收增加工作量。多級(jí)錯(cuò)流萃?。喝軇┓謩e加入各級(jí)萃取器，萃取推動(dòng)力大，效果較好，仍需 加入大量的溶劑，因而產(chǎn)品的濃度稀，需消耗多的能量回收 溶劑。多級(jí)逆流萃?。菏章矢撸苊接昧可?，工業(yè)上經(jīng)濟(jì)，普遍采用的流程。6、論述超臨界CO2萃取技術(shù)的應(yīng)用前景與

8、存在問(wèn)題。應(yīng)用前景：（1）近年來(lái)，許多行業(yè)對(duì)利用超臨界 CO2流體萃取技術(shù)分離物質(zhì) 的組分進(jìn)行了大量研究。在萃取設(shè)備和分析技術(shù)都有了較大的進(jìn)步。在萃 取成分分析方面，已采取萃取設(shè)備與 GC、IR、MS、LC等聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了提 取、分析、質(zhì)量檢測(cè)一體化。能快速準(zhǔn)確地反應(yīng)出萃取物的結(jié)構(gòu)、濃度和 純度。（2）所有研究都是從研究分析超臨界二氧化碳萃取的主要工藝參數(shù)（壓 力、溫度、時(shí)間、CO2流量、物料粒度）和輔助工藝措施（加入輔助溶劑、控制溫度及壓力的升降方式)對(duì)萃取效果的影響，找出理想的工藝條件，對(duì) 比常規(guī)物質(zhì)組分分離方法，證明了該技術(shù)對(duì)某些物質(zhì)分離的優(yōu)越性。(3)從這些研究中可以看到，該技術(shù)在我國(guó)的

9、研究及應(yīng)用已擴(kuò)展到許多行業(yè)，獲 得了大量研究成果和技術(shù)資料，研究水平也在不斷提高。其在天然產(chǎn)物的 深加工及中藥現(xiàn)代化領(lǐng)域具有廣闊的前景。存在的主要問(wèn)題：(1)技術(shù)理論尚不成熟，還沒(méi)有公認(rèn)的萃取過(guò)程的熱力學(xué)模型。(2)超臨界萃取的工藝技術(shù)要求較高。(3)由于萃取過(guò)程在高壓下進(jìn)行，所以對(duì)設(shè)備以及整個(gè)管路系統(tǒng)的耐壓性能 要求較高。(4)傳統(tǒng)的食品行業(yè)，是一個(gè)低投資的行業(yè)，而超臨界萃取技術(shù)要想取得高 產(chǎn)出，必須建成大型生產(chǎn)設(shè)備。7、作為超臨界CO2萃取裝置中的關(guān)鍵設(shè)備，萃取釜和高壓泵有什么特殊 要求？超臨界CO2萃取裝置中的關(guān)鍵設(shè)備(1)萃取釜：屬于高壓設(shè)備；設(shè) 計(jì)、制造、材料、操作等方面要求較高；密

10、封結(jié)構(gòu)的完善性。工業(yè)化萃 取釜宜采用自緊式密封。(2)高壓泵：高壓泵的作用是輸送高壓 CO2流 體并調(diào)節(jié)流量大小。要求其壓力平穩(wěn)，脈沖小，并能根據(jù)生產(chǎn)需要實(shí)現(xiàn)無(wú) 級(jí)調(diào)速。由于超臨界CO2流體具有很強(qiáng)的溶解能力和滲透能力，因此須采用專(zhuān)用的CO2高壓泵。8、論述在什么情況下采用流加發(fā)酵方式？為實(shí)現(xiàn)重組菌體的高密度和高表達(dá)培養(yǎng)時(shí)采用流加發(fā)酵方式。流加發(fā)酵的 特點(diǎn)是能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度。一方面，可以避免某種營(yíng)養(yǎng) 成分的初始濃度過(guò)高而出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象；另一方面，能防止某些限制性 營(yíng)養(yǎng)成分在培養(yǎng)過(guò)程中被耗盡而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成。很多重組 菌體表達(dá)的物質(zhì)不利于菌體自身的生長(zhǎng)，若采用分批流

11、加補(bǔ)料培養(yǎng)：可消 除高濃度底物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，還可以彌補(bǔ)低濃度底物限制細(xì)胞生 長(zhǎng)的缺陷，從而有效地控制了菌體的生長(zhǎng)過(guò)程。9、利用基因工程菌生產(chǎn)的特點(diǎn)是什么？論述重組大腸桿菌高密度、高表達(dá)培養(yǎng)的策略。利用基因工程菌生產(chǎn)的特點(diǎn)： 基因工程菌帶有外源基因，外源基因可能 在質(zhì)粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩(wěn)定。丟失外源基因的 菌往往比未丟失質(zhì)粒的菌生長(zhǎng)快得多，這樣就會(huì)大大降低產(chǎn)物的表達(dá)。為 了抑制基因丟失的菌的生長(zhǎng)，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素。 基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到某一階段，加入 誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。基因不穩(wěn)定性：生產(chǎn)的目標(biāo)是得到最大量的 外源

12、蛋白，但是大量外源蛋白的形成對(duì)宿主細(xì)胞是有損害的，通常是致死 的，失去制造外源蛋白的能力的細(xì)胞一般生長(zhǎng)得快得多，從而能替代有生產(chǎn)能力的菌株，這就導(dǎo)致基因的不穩(wěn)定性。基因的不穩(wěn)定性原因：分離丟 失；結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性；宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)突變。生長(zhǎng)速率占優(yōu)勢(shì)的不穩(wěn)定性： 所有這三種因素的關(guān)鍵是變異了的宿主載體系統(tǒng)和原宿主-載體系統(tǒng)的生長(zhǎng)速率不同。如果變異了的宿主載體系統(tǒng)比原來(lái)的宿主-載體系統(tǒng)有生長(zhǎng)優(yōu) 勢(shì)，那么變異了的系統(tǒng)將最終占優(yōu)勢(shì)，基因不穩(wěn)定性就出現(xiàn)。菌密度的測(cè)定：光密度（OD值或A值）在波長(zhǎng)600660nm菌生長(zhǎng)的障礙是：重組菌攜帶外源基因，加重代謝負(fù)擔(dān)，生長(zhǎng)緩慢； 外源蛋白不能分泌到胞外，在菌體內(nèi)合成后

13、就會(huì)造成積累。高表達(dá)的外源 蛋白尤其是高度疏水性蛋白對(duì)菌體有害，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，甚至?xí)?導(dǎo)致細(xì)胞中毒或死亡，因此工程菌的比生長(zhǎng)速率往往遠(yuǎn)小于宿主菌。高表達(dá)的障礙是：外源基因的不穩(wěn)定，造成表達(dá)的下降；高生長(zhǎng)速率 與高表達(dá)之間的矛盾；乙酸的產(chǎn)生；蛋白的降解。高密度培養(yǎng)的措施：分批補(bǔ)料培養(yǎng)：以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，吸取了連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，可消除高濃 度底物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，還可以彌補(bǔ)低濃度底物限制細(xì)胞生長(zhǎng)的缺 陷，從而有效地控制了菌體的生長(zhǎng)過(guò)程。因此，要實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌的高 密度培養(yǎng)，最常用和最有效的方法就是分批流加補(bǔ)料培養(yǎng)法?，F(xiàn)在常用的 是反饋補(bǔ)料培養(yǎng)。有幾種反饋控制控制基質(zhì)濃度流加：用專(zhuān)門(mén)的電

14、極維持基質(zhì)濃度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。 以葡萄糖為例，用葡萄糖電極檢測(cè)發(fā)酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖電極通 過(guò)反饋系統(tǒng)與補(bǔ)糖單元相連。當(dāng)葡萄糖濃度在設(shè)定值之上，糖閥關(guān)閉；當(dāng) 葡萄糖濃度由于菌體消耗低于設(shè)定值時(shí)，糖閥開(kāi)啟，葡萄糖以一定速率加 入。這樣，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效 應(yīng)，達(dá)到很高的細(xì)胞濃度。恒pH流加：大腸桿菌在LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，pH會(huì)上升。這是由于菌體分 解LB培養(yǎng)基中的胰蛋白月東，造成氨積累的原因。因此用葡萄糖代替酸液 進(jìn)行恒pH流加。實(shí)驗(yàn)通過(guò)pH反饋控制系統(tǒng)流加葡萄糖，使 pH恒定，結(jié) 果推遲了比生長(zhǎng)速率降低的時(shí)間，細(xì)胞密度是無(wú)流加的2倍。也可以以葡

15、萄糖代替酸液，以氨水代替氫氧化鈉堿液，同時(shí)流加氨水和葡萄糖。這種 方法的缺點(diǎn)是葡萄糖濃度往往不易控制，容易產(chǎn)生乙酸，對(duì)某些工程菌不 適宜。恒溶氧流加：用復(fù)膜氧電極來(lái)控制補(bǔ)糖。當(dāng)培養(yǎng)液的氧飽和百分?jǐn)?shù)高于控制 點(diǎn)，糖閥開(kāi)啟，以一定速率補(bǔ)糖。加入的糖被菌利用則需要更多的氧，從 而降低溶氧濃度，引起讀數(shù)下降。當(dāng)讀數(shù)下降到控制點(diǎn)以下，糖閥關(guān)閉， 需氧就會(huì)隨之減少，溶氧逐漸上升，從而達(dá)到供需平衡。Konstantinov等進(jìn) 一步發(fā)展了這種方法，用 DO-state法間歇流加葡萄糖，通過(guò)控制溶氧、攪 拌轉(zhuǎn)速及糖流加速率，使乙酸維持在低濃度，從而獲得高密度和高表達(dá)?？刂票壬L(zhǎng)速率的葡萄糖流加：菌體的比生長(zhǎng)速

16、率與代謝產(chǎn)物的表達(dá)密切相關(guān)。比生長(zhǎng)速率太大，超過(guò)某一值，易產(chǎn)生乙酸，這一比生長(zhǎng)速率值稱(chēng) 為菌體的乙酸產(chǎn)生臨界比生長(zhǎng)速率。通過(guò)考察得出最優(yōu)比生長(zhǎng)速率，控制 溶氧、轉(zhuǎn)速、補(bǔ)糖來(lái)控制比生長(zhǎng)速率。10、論述甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母培養(yǎng)的影響因素？答：影響因素有：1、外源基因自身的影響：外源基因的特性是決定表達(dá)成 敗的首要因素。外源基因序列中 mRNA 5端非編碼區(qū)（5r-UTR）的核甘酸序 列和長(zhǎng)度影響外源基因的表達(dá)。適當(dāng)長(zhǎng)度的5非翻譯區(qū)可極大地促進(jìn) mRN A有效地翻譯，5-UTR太長(zhǎng)或太短都會(huì)造成核糖體40 S亞單位識(shí)別的障礙。 酵母菌對(duì)外源基因的表達(dá)也和外源基因密碼子的選用有關(guān)。如果外源基因 密碼子中存在

17、過(guò)多的宿主低利用密碼子， 位于起始密碼子附近 的低利用密 碼子對(duì)基因的表達(dá)就會(huì)產(chǎn)生很大影響。2、表達(dá)框的染色體整合位點(diǎn)和方式。Pp沒(méi)有天然質(zhì)粒，所以設(shè)計(jì)表達(dá)載體偏向于染色體整合，通過(guò)同源重 組，載體整合到細(xì)胞染色體中間。整合性載體具有表達(dá)框穩(wěn)定和可控制整 合位點(diǎn)等優(yōu)越性，并且能夠發(fā)生多位點(diǎn)整合而獲得多拷貝。3、宿主的甲基 營(yíng)養(yǎng)表型：Mut+或Muts Mut-由于缺乏aoxl基因在甲醇限制性培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)緩慢，它們只能利用弱的aox2因啟動(dòng)合成AOX;而aox1基因完整的 酵母則生長(zhǎng)正常（Mut+ ）。原則上，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut 細(xì)胞， 這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的

18、蛋白量相對(duì)較多，使下 游純化更易進(jìn)行。4、基因劑量：基因拷貝數(shù)對(duì)表達(dá)量的影響是無(wú)法預(yù)測(cè)的。 高表達(dá)菌株的篩選只應(yīng)以表達(dá)的蛋白量為唯一標(biāo)準(zhǔn)。5、分泌信號(hào)：對(duì)于一個(gè)原本就不能分泌的蛋白來(lái)說(shuō)，采用分泌方式生產(chǎn)是非常困難甚至是不可 能的。但為了下游工程處理的方便，外源蛋白的生產(chǎn)應(yīng)盡量考慮采用分泌 表達(dá)的方式。6、培養(yǎng)條件的影響 培養(yǎng)條件主要包括培養(yǎng)基、通氣量、pH 值、甲醇含量等。培養(yǎng)基主要對(duì)生物量和誘導(dǎo)表達(dá)有影響。充足的通氣量 對(duì)于誘導(dǎo)階段外源蛋白的表達(dá)極其重要，應(yīng)該保持高通氣量。止匕外，甲醇 誘導(dǎo)的方式、用量、誘導(dǎo)時(shí)間都會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)水平。7、產(chǎn)物的穩(wěn)定性 酵母細(xì)胞膜上有一種KEX-2樣蛋白水解酶，能專(zhuān)一性水解a因子前體 中竣基端的肽鍵，使酵母基因工程表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生降解現(xiàn)象。另外，如果基 因工程產(chǎn)物會(huì)影響宿主菌生長(zhǎng)代謝活性的話(huà)，也可能出現(xiàn)高度降解的情況。 8、翻譯后修飾：一般情況下 Pp能產(chǎn)生較釀酒酵母明顯要短的高甘露糖型 寡糖鏈，且較均一，長(zhǎng)度在8-14個(gè)之間，使產(chǎn)物更加穩(wěn)定，雖然糖基化對(duì) 某些外源蛋白的活性沒(méi)有太大影響，它卻可能在蛋白折疊和抗蛋白酶降解 中起重要作用。11、論述中藥發(fā)酵的研究現(xiàn)狀及發(fā)展方向。中藥發(fā)酵研究開(kāi)始于80年代，但僅是對(duì)真菌類(lèi)自身發(fā)酵的研究，如靈芝 菌絲體、冬蟲(chóng)夏草菌絲體等，大都是單一發(fā)酵。90