1、細(xì)胞培養(yǎng)中的研究方法 侯桂琴 鄭州大學(xué)藥學(xué)院內(nèi)容提要一、細(xì)胞生長狀況觀察二、細(xì)胞活力測定三、細(xì)胞凋亡檢測四、流式細(xì)胞術(shù)五、常用單細(xì)胞分離技術(shù)一、細(xì)胞生長狀況觀察 1.常規(guī)觀察 2.細(xì)胞計(jì)數(shù) 3.細(xì)胞生長曲線 4.細(xì)胞分裂指數(shù) 5.細(xì)胞貼壁率 6.細(xì)胞周期 1.常規(guī)觀察 倒置顯微鏡下觀察，生長狀態(tài)好的細(xì)胞透明度大，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，沒有空泡。包膜清晰。培養(yǎng)液清澈透明，無懸浮細(xì)胞和碎片。 從培養(yǎng)基顏色判斷：正常桃紅色，當(dāng)變淺變黃，需換液或傳代。 培養(yǎng)液渾濁，液體內(nèi)漂浮菌絲或細(xì)菌，表示微生物污染。 細(xì)胞生長變慢，支原體污染。2.細(xì)胞計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法細(xì)胞數(shù)/ml（4大格細(xì)胞總數(shù)/4）1

2、04 稀釋倍數(shù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法原理：臺盼藍(lán)排斥法。再結(jié)合 CCD成像，快速準(zhǔn)確完成細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率計(jì)數(shù)。電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)結(jié)果注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞分散度較好，成單細(xì)胞懸液。2.取樣計(jì)數(shù)前混勻細(xì)胞3.計(jì)數(shù)時，2個以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)按單個細(xì)胞計(jì)算，細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明消化不充分；細(xì)胞數(shù)少于2個/mm3或多于50個/mm3，需重新制備細(xì)胞懸液。3.細(xì)胞生長曲線 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞必須生長特征穩(wěn)定，可采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定并繪制細(xì)胞生長曲線來觀察細(xì)胞狀態(tài)。方法：取生長狀態(tài)較好細(xì)胞接種24孔板，每天或隔天計(jì)數(shù)（3個復(fù)孔），計(jì)數(shù)1-2周，以細(xì)胞數(shù)對時間作圖繪制生長曲線。用MTT法測定96孔板中細(xì)胞生長

3、細(xì)胞倍增時間：細(xì)胞數(shù)量增加一倍所需時間。作圖法：直接從圖上找出公式法: lg2DT=t lgNt-lgNoNt:培養(yǎng)t時間后細(xì)胞數(shù)No:首次計(jì)數(shù)，一般接種24h進(jìn)行4.細(xì)胞分裂指數(shù) 指分裂細(xì)胞占全部細(xì)胞中的比例，可反映細(xì)胞增殖旺盛程度，一般計(jì)算觀察1000個細(xì)胞。5.細(xì)胞貼壁率6.細(xì)胞周期：同位素標(biāo)記、流式細(xì)胞儀二、細(xì)胞活力測定細(xì)胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成，從形態(tài)上區(qū)別死、活細(xì)胞是困難的。1. 細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn)測定單個細(xì)胞的增殖能力單個細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的

4、增殖能力 克隆形成率比克隆形成數(shù)接種細(xì)胞數(shù)缺點(diǎn)：操作繁瑣優(yōu)點(diǎn)：精確、可靠常見方法：平板克隆形成試驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)（1）平板克隆形成試驗(yàn)適用于貼壁生長的細(xì)胞（腫瘤、正常）方法步驟：1.制備單細(xì)胞懸液2.接種細(xì)胞：倍比稀釋后接種于培養(yǎng)皿，每皿接50、100、200等梯度，輕搖（十字方向）使細(xì)胞分布均勻。3.培養(yǎng)：2-3周4.染色：甲醇固定、吉姆薩染液染色5.計(jì)數(shù)：肉眼或顯微鏡（2）軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)適用于懸浮細(xì)胞方法步驟1.制備單細(xì)胞懸液，103/ml2.制備底層瓊脂：50 5%瓊脂以1：9和37新鮮培養(yǎng)基混合均勻鋪入24孔板，每孔1ml，室溫凝固3. 50 5%瓊脂以0.6：9.4和細(xì)胞懸

5、液混合，加入上述24孔板，每孔1ml。調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，一般每孔25、50、100個4.培養(yǎng)2-3周5.計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞充分分散2.平板試驗(yàn)培養(yǎng)早期勿晃動平皿、軟瓊脂試驗(yàn)培養(yǎng)液與瓊脂液混勻。3.防治污染缺點(diǎn)：難獲得真正單細(xì)胞懸液 有些腫瘤細(xì)胞集落形成率低 確定集落有一定難度 耗時長，重復(fù)性差2.臺盼藍(lán)排斥試驗(yàn)原理：臺盼藍(lán)能使死細(xì)胞著色（淡藍(lán)色），而活細(xì)胞拒染。 活細(xì)胞總數(shù)100活細(xì)胞率（ ） 活細(xì)胞總數(shù)死細(xì)胞總數(shù)注意：簡單，最常用。染色時間不宜過長3. 四唑鹽（MTT）比色法測定細(xì)胞存活和生長?？焖?、簡單、靈敏度高三、細(xì)胞凋亡檢測1.形態(tài)學(xué)觀察2.電泳法3.原位切口末端標(biāo)記法（

6、TUNEL）4.流式細(xì)胞術(shù)測定法1.形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞凋亡時，染色質(zhì)固縮， Hoechst染色時，細(xì)胞核呈致密濃染。25min。碧云天生物技術(shù)公司：beyotime2.電泳法（DNA Ladder）原理：凋亡細(xì)胞DNA被內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶斷裂成180-200bp的整數(shù)倍，電泳時形成梯度條帶。壞死細(xì)胞的DNA電泳呈模糊彌散條帶。方法：收集細(xì)胞，蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提細(xì)胞DNA（試劑盒有賣），電泳。注意：1.提DNA時細(xì)胞數(shù)勿太多，否則酶解不全，DNA液粘稠2.盡量用去尖頭的槍頭吸取DNA液，防止人為剪切3.低電壓電泳，利于DNA分離200bp400bp600bp800bp3.原位切口末端標(biāo)記法（

7、原位細(xì)胞凋亡檢測，TUNEL）原理：細(xì)胞凋亡時，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶使核小體內(nèi)DNA斷裂出現(xiàn)缺口，產(chǎn)生一系列3-OH 末端。生物素（biotin）標(biāo)記的dUTP 在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下與3-OH 末端連接，并與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，加入DAB顯色底物可在原位出現(xiàn)棕沉淀，鏡下即可觀察和計(jì)數(shù)著色細(xì)胞； 正?；蛘谠鲋车募?xì)胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3-OH 形成，很少能夠被染色。 組織樣本和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）均可檢測。優(yōu)點(diǎn)：對完整凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確反應(yīng)凋亡細(xì)胞典型的生化和形態(tài)特征，極少量的凋亡細(xì)胞也可被檢測

8、出來，靈敏度高于染色法和DNA Ladder，應(yīng)用廣。注意：1.設(shè)好陽性及陰性對照，控制好藥物處理時間2.TDT酶與生物素-dUTP混合液現(xiàn)用現(xiàn)配3.DAB顯色時間勿過長4.細(xì)胞爬片操作要輕柔4.流式細(xì)胞術(shù)測定法(詳見下節(jié))四、流式細(xì)胞術(shù)20世紀(jì)70年代出現(xiàn)。特點(diǎn)：在單細(xì)胞水平上對大量細(xì)胞作準(zhǔn)確 快速分析和分選。應(yīng)用：1.判斷細(xì)胞體積、DNA含量、蛋白含量、 酶活性、細(xì)胞膜受體、表面抗原等。2.無菌狀態(tài)下，對活細(xì)胞分類收集，純度 達(dá)99%。流動室、液流系統(tǒng)激光光源光學(xué)系統(tǒng)光電管、檢測系統(tǒng)計(jì)算機(jī)、分析系統(tǒng)工作原理：1.檢測單細(xì)胞不同指標(biāo) 經(jīng)熒光染色的單細(xì)胞懸液在氣體壓力下進(jìn)入流動室，在鞘液約束下

9、細(xì)胞排成單列從噴嘴噴出，形成細(xì)胞流。其與激光束垂直相交，細(xì)胞被激發(fā)出熒光，經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)收集后，傳給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)儲存、分析并顯示。 用不同單克隆抗體或熒光染料，可對一個細(xì)胞同時進(jìn)行多個參數(shù)檢測。 當(dāng)細(xì)胞液滴逐個通過激光束時，干涉檢測器被激活，而帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞同時也使熒光檢測器激活，液滴充電信號使液滴帶上負(fù)電荷，從而向正極移動，進(jìn)入熒光標(biāo)記細(xì)胞收集器，純度達(dá)99%以上。 無菌狀態(tài)下進(jìn)行時，得到細(xì)胞仍可繼續(xù)體外培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)研究。2.細(xì)胞分選流式細(xì)胞儀使用1.調(diào)試和校準(zhǔn)：激光強(qiáng)度、液流速度、光路等、由專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行。2.儀器操作：打開細(xì)胞儀 打開聯(lián)機(jī)電腦 在氣壓閥減壓狀態(tài)下確認(rèn)鞘液桶充滿并保證管路通

10、暢 氣壓閥加壓排出管路氣泡 樣品管加去離子水沖洗噴嘴系統(tǒng) 預(yù)熱5-10min開始試驗(yàn) 完畢后去離子水沖洗 分析結(jié)果常規(guī)樣品制備方法1.直接熒光標(biāo)記法： 直接用熒光素（FITC、PE等）標(biāo)記的抗體處理細(xì)胞，進(jìn)行檢測（可同時加入幾種不同熒光標(biāo)記的抗體）。 此法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析。2.間接熒光標(biāo)記法： 細(xì)胞先與一抗結(jié)合，再加熒光標(biāo)記的二抗檢測。 此法費(fèi)用低，但特異性差（二抗多為多克隆抗體），應(yīng)設(shè)好陰陽對照。不適合細(xì)胞數(shù)少的標(biāo)本測定。應(yīng)用實(shí)例1.檢測細(xì)胞膜受體原理：細(xì)胞表面保留有完整的抗原，用熒光標(biāo)記的特異性抗體與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，依熒光強(qiáng)度或陽性百分率可知相應(yīng)抗原密度。步驟：對數(shù)期細(xì)胞單細(xì)

11、胞懸液，PBS洗滌，調(diào)濃度為1107個/ml；取100ul，加血清封閉；加抗原避光孵育20min， PBS洗滌2次；棄上清，用固定液固定細(xì)胞；檢測檢測結(jié)果注意事項(xiàng)1.上機(jī)前細(xì)胞濃度1106個/ml，過高或低 均影響結(jié)果2.設(shè)立對照3.抗體孵育后充分洗滌，輕柔混勻，低速 離心，以減少重疊細(xì)胞和細(xì)胞碎片4.孵育時避光2.同時檢測細(xì)胞內(nèi)外抗原原理：先標(biāo)記膜抗原，固定后用破膜劑或打孔劑將胞膜破壞，再標(biāo)記胞內(nèi)抗原，測定陽性百分率。注意：抗原用不同熒光標(biāo)記設(shè)立陰性對照避光操作原理：碘化丙啶（PI）可與胞內(nèi)DNA及RNA結(jié)合，用RNA酶消化后，PI的熒光強(qiáng)度反應(yīng)胞內(nèi)DNA含量。因細(xì)胞周期各時相的DNA含量不

12、同，故區(qū)分出來。G1/G0：二倍體細(xì)胞DNA含量（2N）G2/M：4N S：二者之間凋亡細(xì)胞總DNA含量降低，在G1/G0細(xì)胞群前出現(xiàn)一DNA低染細(xì)胞群，即G1峰前出現(xiàn)二倍體峰，即凋亡細(xì)胞群。3.細(xì)胞周期及凋亡檢測方法步驟：1.收集不同方法或藥物處理的細(xì)胞，70%冷乙醇固定20min ，4放置（最長4周）2.PBS清洗兩次出去固定液，PBS調(diào)細(xì)胞濃度為2107個/ml3.加入RNase A 消化半小時，加入PI，4 避光20min4.檢測檢測結(jié)果：注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞收集后及時固定，防止自溶或DNA降解2.要用對細(xì)胞穿透性強(qiáng)的固定劑，一般70%乙醇3.上機(jī)檢測前細(xì)胞濃度要足夠，一般1106個/m

13、l，雜質(zhì)、碎片和重疊細(xì)胞2%（可用合適目數(shù)篩子過濾）4.反應(yīng)的凋亡結(jié)果應(yīng)考慮的因素：DNA含量降低或DNA結(jié)構(gòu)改變使DNA可染性降低。原理：正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡早期，PS翻轉(zhuǎn)到膜外。膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）是一種磷脂結(jié)合蛋白，可與PS特異性結(jié)合，檢測早期凋亡細(xì)胞。以熒光素FITC標(biāo)記的Annexin-V作探針，配合PI，可用流式細(xì)胞儀將凋亡早期。凋亡晚期及死細(xì)胞區(qū)分開。 4.細(xì)胞凋亡和壞死檢測方法步驟：1.收集不同方式或藥物處理的細(xì)胞，調(diào)整濃度為1-51072.預(yù)冷結(jié)合緩沖液（可置冰上）洗滌兩次（1000r/min,5min）3.用250u

14、l結(jié)合緩沖液重懸，使細(xì)胞濃度為11074.取100ul置于流式樣品管，加5ul Annexin-V和PI，避光孵育15min5.加入400ul PBS，選擇合適波長測定 正常細(xì)胞：V（-） PI（-） 早期凋亡： V（+） PI（-） 晚期凋亡或壞死： V（+） PI（+）依據(jù)：正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞胞膜完整，故PI拒染；正?；罴?xì)胞PS不外翻，故Annexin-V拒染，胞膜完整，PI拒染；晚期及壞死細(xì)胞膜受損，PS外翻，二者均染色結(jié)果判定：檢測結(jié)果： I：晚期凋亡細(xì)胞 II：早期凋亡細(xì)胞III：活細(xì)胞IIIIII注意事項(xiàng)：1.操作中動作輕柔，低速離心，勿用力吹打 細(xì)胞，盡量冰上操作2.與熒光染料反應(yīng)完盡快檢測，1h后熒光衰減3. Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，操作 時避光4.試劑作用時間的影響5.PI能透皮吸收，勿直接接觸5.凋亡細(xì)胞內(nèi)游離Ca離子濃度檢測原理： 細(xì)胞凋亡時細(xì)胞內(nèi)Ca離子濃度急劇升高。Ca離子熒光指示劑Fluo-3/Am與細(xì)胞內(nèi)Ca離子特異結(jié)合，當(dāng)用488nm激發(fā)光激發(fā)時，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)游離Ca離子濃度成正比。方法（略）五、常用單細(xì)胞分離技術(shù) 指從細(xì)胞群體中分離出一個細(xì)胞使其在體外繁殖成新的細(xì)胞群體。 用于細(xì)胞純化及比較不同亞群的形態(tài)和功能。方法：有限稀釋法、平皿克隆分離法、軟瓊脂克隆分離法。1.有限稀釋法