1、實驗二酵母細(xì)胞固定化及乙醇發(fā)酵一、實驗?zāi)康囊?、掌握微生物細(xì)胞固定化的原理和基本技術(shù)2、學(xué)習(xí)酵母乙醇發(fā)酵過程二、實驗原理（一）固定化細(xì)胞（immobilized cell）固定化細(xì)胞技術(shù)是指用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催 化活性、反復(fù)使用的方法。近十余年來生物工程研究的重點領(lǐng)域之一；固定化細(xì)胞與固定化酶技術(shù) 一起組成了現(xiàn)代的固定化生物催化劑技術(shù)。優(yōu)點：細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強、產(chǎn)物分離容易、可反復(fù)使用、能實現(xiàn)連續(xù) 操作，可大大提高生產(chǎn)能力。應(yīng) 用：已涉及到食品、化學(xué)、醫(yī)藥、化學(xué)分析、環(huán)境保護、能源開發(fā)等領(lǐng)域。用于生產(chǎn)各種 胞外產(chǎn)物，包括酒精酒類、氨

2、基酸、有機酸、酶、輔酶、抗生素、甾體轉(zhuǎn)化、廢水處理；用于制造 微生物傳感器（二）制備方法：吸附法；包埋法；共價結(jié)合法；交聯(lián)法；1、吸附法：又叫載體結(jié)合法，依據(jù)帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電、表面張力和黏附力 的作用，使細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部；簡便，活力損失??；但細(xì)胞與載體作用力小，易脫落2、包埋法：分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。凝膠包埋法是將細(xì)胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中而使細(xì)胞固定；半透膜包埋法是將細(xì)胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)。簡單，條件溫和，穩(wěn)定性好，包埋細(xì)胞容量高。3、共價結(jié)合法：細(xì)胞表面上功能團和固相支持物表面的反應(yīng)基團之間形成化學(xué)共價鍵連接， 從而形成為固定化細(xì)胞。細(xì)

3、胞與載體結(jié)合緊密，不易脫落；但制備較難，且活力損失較大。4、交聯(lián)法：利用雙功能或多功能試劑，直接與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團（如氨基酸、羥基、咪唑 基等）發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞，其結(jié)合力是共價鍵。此法制備麻煩，活力損失較大；但細(xì)胞與載體結(jié)合較緊。（三）載體多糖類：纖維素、瓊脂、葡萄糖凝膠、藻酸鈣、K-角叉膠、DEAE-纖維素等蛋白質(zhì)：骨膠原、明膠等無機載體：氧化鋁、活性炭、陶瓷、磁鐵、二氧化硅、高嶺土、磷酸鈣凝膠等合成載體：聚丙稀酰胺、聚苯乙烯、酚醛樹脂等海藻酸鹽是一種廣泛應(yīng)用的固定化介質(zhì)，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、無毒、包埋效率高且價格低廉等 優(yōu)點。但是海藻酸鈣包埋細(xì)胞時，凝膠顆粒易

4、發(fā)生破損、軟化等問題，凝膠顆粒的穩(wěn)定性和機械強 度較差，不利于固定化細(xì)胞的多次利用。三、實驗步驟第一階段酵母菌培養(yǎng)1、培養(yǎng)基配制及分裝豆芽汁蔗糖培養(yǎng)基：黃豆芽100g （煮開10min后過濾取汁），蔗糖（或葡萄糖）50g,水 1000ml, pH自然； 或 YPD培養(yǎng)基：酵母膏10g、蛋白豚20g、葡萄糖20g、H2O 1000ml； pH5.5 分裝：配制500ml，分裝4個500ml三角瓶，每瓶100ml； 0.08Mpa,滅菌20min2、接種及培養(yǎng)：菌種：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）；接種量：5%搖瓶培養(yǎng)條件：200rpm, 28C, 48h第二階段：

5、細(xì)胞固定化3、發(fā)酵液3000rpm離心10min；菌體沉淀用滅菌水洗一次。4、將菌體沉淀懸于15ml無菌水制成濃懸液。5、向菌懸液中加入5ml 6%海藻酸鈉溶液，充分混勻。吸入滅菌針筒內(nèi)，插上5#8#針頭。6、 將針頭通過棉塞插入裝有50ml滅菌的0.05mol/L CaCl2溶液的小三角瓶內(nèi)；一手均速搖動 三角瓶，另一手輕推注射器，令液滴勻速滴入CaCl2溶液中。（如圖1）7、滴完后將三角瓶移入22C水浴，放置1h。8、傾去溶液，加入100ml無菌去離子水，洗圖1圖29、重新加入50ml 0.05 mol/L CaCl2溶液，4C平衡過夜。第三階段：固定化酵母的乙醇發(fā)酵10、發(fā)酵培養(yǎng)基配制及

6、分裝配方：白糖（蔗糖）80g、（NH4）2SO4 2.0g、KH2PO4 1.0g、H2O 1000ml； pH 自然分裝：每組一瓶（250ml注射液用瓶），裝200ml，棉塞或8層紗布；0.08Mpa，25min11、將4C平衡過夜的固定化細(xì)胞懸液的CaCl2溶液傾去，倒入部分發(fā)酵培養(yǎng)基，搖起后再倒回發(fā) 酵瓶；塞上滅菌的橡皮塞；將頭皮針針頭插入橡皮塞，另端浸在裝有滅菌水的三角瓶中（如上圖2）。12、28 C靜止培養(yǎng)48h。13、酒精生成的檢驗1）打開發(fā)酵瓶塞子，嗅聞有無酒精味2）取發(fā)酵液5ml加入試管，加10% H2SO4溶液2ml；向試管中滴入1% K2Cr2O7溶液1020 滴；如管內(nèi)由橙黃色變?yōu)辄S綠色，證明有酒精生成。2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH 一 3CH3COOH + 2K2SO4 + 2Cr2（SO4）3 （黃綠色）+ 11H2O四、實驗結(jié)果酵母搖瓶培養(yǎng)生長情況；生長量固定化細(xì)