1、關(guān)于酶的固定修飾與改造第一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月游離酶的缺點1. 酶是蛋白質(zhì)，在水溶液中（細胞外）穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機溶劑對其有影響）；2. 不能回收，一般不能反復使用，常使產(chǎn)物中混雜酶蛋白，不易與產(chǎn)物分離，不利于產(chǎn)物的提純和精制；3. 酶活性不夠高；4. 分離純化困難；5. 具有抗原性。第二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 固定化酶與固定化細胞一、酶的固定化二、細胞的固定化三、輔酶的固定化第三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、酶的固定化（一）概念及其優(yōu)缺點 固定化酶(immobilized enzyme): 是指將水溶性酶經(jīng)過化學或物

2、理手段處理，固定在載體上，在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復和連續(xù)使用的（不溶于水）酶。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶固定化的基本要求 盡可能的保持酶的活性和專一性； 固定化載體應(yīng)該與酶結(jié)合較為牢固，不與底物、產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，達到多次回收和反復使用； 酶固定化后產(chǎn)生的位阻應(yīng)該較小，不妨礙酶與底物接近； 成本盡可能低。第五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點：（1）可多次使用；（2）可以裝塔連續(xù)化生產(chǎn)（反應(yīng)）；（3）不溶于水，易于與產(chǎn)物分離，純化簡單；（4）穩(wěn)定性好，提高產(chǎn)物質(zhì)量；（5）提供了研

3、究酶動力學的良好模型。（6）應(yīng)用范圍廣。缺點：（1）首次投入成本高；（2）大分子底物較困難；（3）固定化過程中往往會引起酶的失活。第六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）酶固定化的方法固定化方法吸附法共價結(jié)合（偶聯(lián)）法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子交換吸附物理吸附法 無載體固定法多方法聯(lián)用第七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月各類固定化方法的特點比較比較項目吸附法共價結(jié)合法 交聯(lián)法

4、包埋法物理吸附共價鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合 制備難易易難易 較難較難固定化程度弱強中等 強強活力回收率較高低高 中等高載體再生可能不可能可能 不可能不可能費用低高低 中等低底物專一性不變可變不變 可變不變適用性酶源多較廣廣泛 較廣小分子底物、藥用酶第十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 吸附法 根據(jù)吸附劑的特點分:物理吸附法和離子交換吸附法（1）物理吸附法（physical adsortion）：通過酶與載體之間的范德華力、氫鍵、疏水作用力等將酶與載體聯(lián)系起來的方法。第十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附法作用力：范德華力、氫鍵、疏水作用力選擇載體的原則：有機載體和無機

5、載體。 要有巨大的比表面積； 要有活潑的表面； 便于裝柱進行連續(xù)反應(yīng)。常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、骨膠原、火棉膠、淀粉等。第十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附法的類型根據(jù)吸附劑的特點分: 物理吸附法和離子交換吸附法（2）離子交換吸附(結(jié)合)法（ion binding）： 通過離子效應(yīng)，將酶分子固定到含有離子交換基團的固相載體上的固定化方法。 作用力：離子鍵 常用載體：DEAE-Cellulose （二乙氨乙基-纖維素）；DEAE-dextran gel （ 二乙氨乙基 -葡聚糖凝膠）；CM-cellulose （羧甲基纖維素；car

6、boxymethyl cellulose）。第十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月吸附法的優(yōu)缺點優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。第十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 包埋法定義：將酶或含酶菌體用物理的方法包埋在各種具有特定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（多孔）載體（高聚物）中，使酶固定化的方法稱為包埋法。第十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月包埋法的類型分為：凝膠包埋法和微膠囊包埋法（1）凝膠包埋法（網(wǎng)格型包埋法）：將酶包埋在交聯(lián)的水不溶的高分子凝膠細微網(wǎng)格中。 常用的凝膠可分為天然凝膠和人工凝膠。如海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉

7、膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等合成凝膠。第十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月凝膠包埋法的種類聚丙烯酰胺凝膠包埋法：將酶包埋在聚丙烯酰胺凝膠中。海藻酸鈣包埋法：凝膠包埋法常用的載體有利用海藻提取物海藻酸鈉制成凝膠。瓊脂糖凝膠包埋法：利用熔化的瓊脂在溫度低于50凝固的特性來包埋酶。第十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月使用的多孔載體及其特點凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂;海藻酸鈣;角叉菜膠;明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應(yīng)部分失活高第二十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）微膠囊包埋法（半透膜包埋法） 微膠囊包埋即

8、將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。 半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。 半透膜孔徑小于酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進出，被稱為“人工細胞”。 它使酶存在于類似細胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。 常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。第二十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）纖維素包埋法 常用于大規(guī)模生產(chǎn)。通過多孔噴絲頭形成中空纖維，將酶包埋在纖維內(nèi)。第二十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月包埋法的優(yōu)缺點 優(yōu)點： 在于它是一種反應(yīng)條件溫和、很少改變酶結(jié)構(gòu)但

9、是又較牢固的固定化方法。 缺點： 只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過高聚物網(wǎng)架擴散，對那些底物和產(chǎn)物是大分子的酶并不適合。 這是由于高聚物網(wǎng)架會對大分子物質(zhì)產(chǎn)生擴散阻力導致固定化酶動力學行為改變，使活力降低。第二十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 共價結(jié)合（偶聯(lián)法）（Covalent binding or covalent coupling） 共價結(jié)合（偶聯(lián)）法是目前研究中最為活躍的方法。（1）原理：酶蛋白分子上的功能基團與載體（固相支持物）表面上的反應(yīng)基團之間以共價鍵的作用而實現(xiàn)結(jié)合的固定化方法。（借助共價鍵將酶的非活性必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶連）。（2）載體選擇的要求

10、： 盡量選擇親水性強的載體； 載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機械強度； 載體必須有在溫和條件下與酶共價結(jié)合的功能基團； 載體沒有或很少有非專一性吸附； 載體容易獲得，能反復使用。第二十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月共價結(jié)合（偶聯(lián)法）（3）酶蛋白可以形成共價鍵的基團： 游離氨基、游離羧基、 巰基、 咪唑基、 酚基、 羥基、 甲硫基、 吲哚基、二硫鍵。 酶蛋白N末端的- 氨基或賴氨酸殘基的- 氨基。 酶蛋白C末端的- 羧基、天門冬氨酸殘基的-羧基以及谷氨酸殘基的-羧基。 半胱氨酸殘基的巰基。 絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。 組氨酸殘基的咪唑基。 色氨酸殘基的吲哚基。 苯丙氨酸

11、和酪氨酸殘基的苯環(huán)。第二十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月共價結(jié)合（偶聯(lián)法）（4）常用的載體： 天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體。親水載體優(yōu)于疏水載體。 天然高分子衍生物: 纖維素、瓊脂糖、葡聚糖凝膠；親和性好，機械性能差。 合成聚合物： 聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龍；機械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)。第二十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月共價結(jié)合（偶聯(lián)法）（5）載體活化（偶聯(lián)）的方法： 溴化氰法：即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。 疊氮法：即載體活化生成疊氮化合物，再與

12、酶分子上的相應(yīng)基團偶聯(lián)成固定化酶。 烷基化反應(yīng)法：以鹵素為功能團的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。 重氮法：重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方法，是共價鍵法中使用最多的一種。 硅烷化法：可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些中間分子（如二氯硫化碳）進一步和酶分子發(fā)生連接反應(yīng)。第二十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 交聯(lián)法 交聯(lián)法（cross-linking）是利用雙功能或多功能試劑在酶分子之間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的酶固定化方法。 由于酶蛋白的功能團

13、，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶活力的提高。 此法與共價結(jié)合（偶聯(lián)）法利用的均是共價鍵，不同之處是什么？ 交聯(lián)法不使用載體！第二十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月交聯(lián)法常用試劑 戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、N,N-乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺和N,N-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等。 其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它的兩個醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff base) ，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。第二十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6

14、月共價交聯(lián)法的四種形式（1）酶直接交聯(lián)法：（2）酶輔助蛋白交聯(lián)： 當可得到的酶量有限，可以使用第二個“載體”蛋白來增加蛋白質(zhì)濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯(lián)的方法。第三十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月共價交聯(lián)法的四種形式（3）吸附交聯(lián)法： 此法先將酶吸附在硅膠、藻土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。（4）載體交聯(lián)法： 用多功能試劑的一部分功能基團化學修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團偶聯(lián)酶蛋白。第三十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月四種固定化酶制備方法的特點小結(jié)指標物理吸附包埋法

15、共價結(jié)合法共價交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強強強酶活力回收高，易流失高高中中底物專一性無變化無變化無變化有變化有變化再生可能可能不可能不可能不可能固定化費用低低中高中第三十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）固定化酶的評價(一) 固定化酶(細胞)的活力測定 固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。 (二) 蛋白總量測定 1.雙辛可寧酸法(Bicinchoninic acid;BCA法) 2.考馬斯亮藍法:(三) 偶聯(lián)率及比（相對）活力測定第三十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）固定化酶的評價(

16、四) 固定化酶的操作半衰期 在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標。(五) 相對酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。第三十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）固定化酶的性質(zhì)和影響因素1. 固定化酶的形狀 固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。 其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進行批式攪拌反應(yīng)； 薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學；酶管機械強度較大，適用于工業(yè)生產(chǎn)。第三十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)

17、作于2022年6月（四）固定化酶的性質(zhì)和影響因素2. 固定化對反應(yīng)體系造成的效應(yīng) 酶經(jīng)過固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學性質(zhì)的影響。（1）構(gòu)象效應(yīng)：酶分子在固定化過程中，酶分子與載體相互作用使得酶的活性中心或變構(gòu)中心構(gòu)象發(fā)生變化。（2）屏蔽效應(yīng)：酶經(jīng)固定化后，載體會成為底物或者其他效應(yīng)物結(jié)合到活性中心或者變構(gòu)中心的空間障礙，可以通過加入連接臂的方式進行改善。第三十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶的性質(zhì)和影響因素（3）微擾效應(yīng)：酶固定化后，載體固有的性質(zhì)會引起緊鄰固定化酶的微環(huán)境的變化，使酶的催化能力及酶對效應(yīng)物作出調(diào)節(jié)

18、反應(yīng)的能力發(fā)生改變。（4）分配效應(yīng)：由于載體的親水或者疏水特性以及帶電特征使底物、產(chǎn)物或其他效應(yīng)物在每所處的微環(huán)境和宏觀體系間發(fā)生不等分配，改變了酶反應(yīng)體系的組成平衡。（5）擴散限制效應(yīng)：指底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物在酶的微環(huán)境區(qū)與宏觀體系之間遷移和運轉(zhuǎn)速度受到限制的一種效應(yīng)。第三十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 固定化酶（細胞）性質(zhì)的改變 （1）固定化酶的活力在大多數(shù)情況下比天然酶下降，其專一性也會受到影響發(fā)生改變。 活力下降的原因： 酶分子在固定化過程中，由于構(gòu)象效應(yīng)或調(diào)節(jié)中心空間構(gòu)象發(fā)生變化或者屏蔽效應(yīng)造成酶的空間構(gòu)像發(fā)生了變化，活性中心無法與底物結(jié)合； 部分活性中心的氨

19、基酸殘基參與了與載體的結(jié)合，導致部分酶完全喪失了活性； 固定化后的空間障礙效應(yīng)的影響； 內(nèi)擴散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻； 包埋法時被高分子物質(zhì)半透膜包圍。第三十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶（細胞）性質(zhì)的改變（2）固定化后酶穩(wěn)定性提高 穩(wěn)定性提高的原因： 固定化后的酶與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形； 酶活力的緩慢釋放； 反應(yīng)開始只有部分酶起作用，其余部分僅在開始起作用的酶變性后才起作用； 抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。第三十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶（細胞）性質(zhì)的改變（3）固定化酶（細胞）的最適pH變化 酶固定化后，對底物

20、的最適pH曲線常常發(fā)生偏移。 變化規(guī)律： 一般來說，帶負電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值較游離酶偏高；反之，若使用帶正電荷載體的話，其最適pH值較游離酶偏低，即向酸性偏移。 原因：一是酶本身電荷在固定化前后發(fā)生變化；二是由于載體電荷性質(zhì)的影響致使固定化酶分子內(nèi)外擴散層的氫離子濃度產(chǎn)生差異；三是由于酶催化反應(yīng)產(chǎn)物導致固定化酶分子內(nèi)部形成帶電荷微環(huán)境。一般來說，產(chǎn)物為酸性時固定化酶的最適pH比游離酶高一些；產(chǎn)物為堿性時，固定化酶的最適pH比游離酶低一些，產(chǎn)物為中性時，最適pH一般不改變。第四十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶（細胞）性質(zhì)的改變（4）固定化酶（細胞）的最適溫度

21、的變化 固定化酶的最適反應(yīng)溫度多數(shù)較游離酶高，如色氨酸酶經(jīng)共價結(jié)合后最適溫度比固定前提高515，但也有不變甚至降低的。固定化酶的作用最適溫度會受固定化方法以及固定化載體的影響。 酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。因為固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是很有利的結(jié)果。第四十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶（細胞）性質(zhì)的改變（5）酶固定后動力學參數(shù)(米氏常數(shù)；Km)的變化 米氏常數(shù)Km反映了酶與底物的親和力。酶經(jīng)固定化后，酶蛋白分子的高級結(jié)構(gòu)的變化以及載體電荷的影響可導致底物和酶的親合力的變化。固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化

22、。 簡單說，由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。而這種Km變化又受到溶液中底物離子強度影響：離子強度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。第四十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶（細胞）性質(zhì)的改變（6）固定化酶底物特異性發(fā)生變化 固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關(guān)系。 一般來說，當酶的底物為小分子化合物時，固定化酶的底物特異性大多數(shù)情況下不發(fā)生變化。例如，氨基?；?、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶等，固定化前后的底物特異性沒有變化；而當酶的底物為大分子化合物時，如蛋白酶、-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特異

23、性往往會發(fā)生變化。 這是由于載體引起的空間位阻作用，使大分子底物難以與酶分子接近而無法進行催化反應(yīng)，酶的催化活力難以發(fā)揮出來，催化活性大大下降。第四十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、細胞的固定化1. 概念： 固定化細胞（immobilized cell）：固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行生命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。第四十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、細胞的固定化2. 固定化細胞（原生質(zhì)體）的意義： (1) 使用固定化細胞省去了酶的分離手續(xù)，可顯著降低成本。 (2) 固定化細胞為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。 (3) 細胞固定化后對不利環(huán)境的耐受性

24、增加，細胞可重復利用，簡化了細胞培養(yǎng)過程。 (4) 保持酶在細胞內(nèi)的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。 (5)細胞生長快而且多，可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊排出發(fā)酵液，一邊進行培養(yǎng)，排除了產(chǎn)物抑制和消耗。 (6) 固定化細胞（原生質(zhì)體）去除了細胞壁的擴散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。第四十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化細胞同時也存在些缺點 (1) 必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產(chǎn)品純度。 (2) 必須防止細胞內(nèi)蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內(nèi)其他酶的活性防止副產(chǎn)物的形

25、成。 (3) 細胞膜、細胞壁會阻礙底物滲透和擴散。第四十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）植物細胞固定化 植物細胞比菌體細胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。 1. 吸附法：吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或吸附于中空纖維外壁上。 2. 包埋法： 包埋法是將植物細胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中。第四十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）動物細胞固定化 動物細胞比菌體細胞、植物細胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化方法。目前,動物細胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。 1. 吸附法：由于大多數(shù)動物細胞屬于附

26、著細胞，它們在培養(yǎng)過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細胞。主要載體及固定方法有： （1）轉(zhuǎn)瓶法：轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成。 （2）微載體法：微載體是指直徑為100 200 um，相對密度接近于1.0 的顆粒固定化載體。它是由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。 （3）中空纖維法：中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。第四十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）動物細胞固定化2. 包埋法： 包埋法根據(jù)載體與方法不同，亦有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。 （1）凝膠包埋法：用于動物細胞固定化的凝膠主要有瓊脂糖

27、凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖蛋白等。 （2）半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊形固定化動物細胞。第四十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、輔酶的固定化 由于輔酶與酶的結(jié)合不牢固，必須考慮將輔酶固定化。 1. 原因： （1）有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應(yīng)； （2）有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生； （3）有機輔因子價格昂貴 工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機輔因子的保留和再生。 2 . 固定化方法與酶相似，一般采用載體結(jié)合法和包埋法。如利用溴化氰法、碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M行適當?shù)幕瘜W修飾后固定在超濾器中。

28、 3. 輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。第五十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月輔酶NAD+在瓊脂糖凝膠上的固定化第五十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 化學酶工程一、酶分子的化學修飾二、模擬酶三、抗體酶四、印跡酶第五十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月生物酶工程與化學酶工程 1. 生物酶工程 (1) 采用基因重組技術(shù)，利用微生物、動植物細胞作為生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)酶。 (2) 通過基因工程技術(shù)，使酶基因發(fā)生定位突變，產(chǎn)生遺傳性修飾酶(突變酶)。 (3) 設(shè)計新酶基因，合成自然界不曾有的新

29、酶。 2. 化學酶工程 (1) 自然酶：是指由生物材料中分離出來的酶。 (2) 化學修飾酶又稱“生物分子工程” ：是通過對酶分子實行“手術(shù)”以達到改構(gòu)和改性的目的。 (3) 固定化酶：是將酶分子通過吸附、交聯(lián)、包埋及共價鍵結(jié)合束縛于某種特定支持物上而發(fā)揮酶的作用。具有能反復使用、產(chǎn)物易純化、可用微電腦控制，實行自動化連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)點。 (4) 人工合成酶：模擬酶的催化功能，用化學方法合成具有專一性的催化劑。第五十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、酶分子的化學修飾 通過各種方法可使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子的修飾。 通常把把改變酶蛋白一

30、級結(jié)構(gòu)的過程稱為改造，把側(cè)鏈基團的共價變化稱為修飾。（一）酶分子化學修飾的定義： 通過對主鏈的 “切割”、“剪切” 和側(cè)鏈基團的 “化學修飾” 對酶蛋白進行分子改造，以改變酶分子的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物活性，這種應(yīng)用化學方法對酶分子進行種種 “手術(shù)” 的技術(shù)，稱為酶分子的化學修飾。第五十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶分子的化學修飾（二）酶分子修飾的意義 1. 改變活性部位的構(gòu)象； 2. 提高酶的生物活力 （activity）； 3. 增強酶的穩(wěn)定性（ stability）； 4. 降低或消除酶類藥物的抗原性 （immunological property）； 5. 改變酶學性質(zhì)

31、：研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響（ structure ）。第五十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）酶化學修飾的原理、方法及修飾劑1. 酶化學修飾的原理 對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。 （1）酶的穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。 （2）被修飾的酶：活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。 （3）修飾條件的選擇：修飾反應(yīng)盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。 pH與離子強度

32、：pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。 修飾反應(yīng)的溫度與時間：嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。 反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：第五十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶化學修飾的原理、方法及修飾劑 （4）修飾劑的選擇：選擇修飾劑時要求具有較大的相對分子量，對蛋白質(zhì)的吸附具有良好的生物相容性和水溶性，修飾劑表面有較多的活性基團，還要考慮修飾劑上的反應(yīng)基團的活化方式和活化條件，以及修飾后酶活性的半衰期。 修飾劑的選擇在很大程度上使依據(jù)修飾目的而定。 修飾劑的大小也是選擇時要考慮的。第五十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作

33、于2022年6月酶化學修飾的原理、方法及修飾劑2. 酶化學修飾的方法：（1）酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾： 氨基的化學修飾： 來源：Lys, Arg, His, Gln。 修飾反應(yīng)：?；c烷基化。 ?；揎梽? 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）。 烷基化修飾劑：2,4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等。 羧基的化學修飾： 修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測定酶分子中羧基的數(shù)目。第五十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶化學修飾的原理、方法及修飾劑 巰基的化學修飾 來源：Cys 修飾反應(yīng):烷基化 修飾劑：碘乙酸(I

34、AA)、碘乙酰胺(IAM)、N-乙基馬來酰亞胺(NEM)(常用的專一修飾巰基試劑)。 咪唑基的化學修飾 來源：His 修飾反應(yīng):酰基化與烷基化 酰基化修飾劑:常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）； 烷基化修飾劑：碘乙酸。第六十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶化學修飾的原理、方法及修飾劑 胍基的化學修飾 來源：Arg 修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對氨基酰基化。 修飾劑：二羰基化合物 丁二酮、 1,2環(huán)己二酮、苯乙二醛。 吲哚基的化學修飾 來源：Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N-溴代琥珀酰亞胺 酚羥基的化學修飾 來源：Tyr 修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng) 修飾

35、劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷） 甲硫氨酸殘基的化學修飾：第六十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶化學修飾的原理、方法及修飾劑（2）酶分子表面的化學修飾 聚乙二醇對酶的修飾：聚乙二醇(PEG)用得最多的是分子量在500020,000范圍內(nèi)的修飾劑，因為該類分子既能溶于水，又可以溶于大多數(shù)有機溶劑，是兩親分子，無免疫原和毒性，體內(nèi)不殘留。 實際使用過程中多采用單甲基聚乙二醇(MPEG)的衍生物。如MPEG均三嗪類、MPEG的琥珀酰亞胺類、MPEG氨基類衍生物。 右旋糖酐及右旋糖苷硫酸酯對酶的修飾：是由葡萄糖通過-1,6 -糖苷鍵形成的多糖，具有較好的水溶性和生物相容性，可作代血漿用。

36、第六十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶化學修飾的原理、方法及修飾劑 糖肽對酶的修飾：是纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解纖維蛋白或球蛋白獲得。 具有生物活性的大分子對酶的修飾：常用的是肝素。是一種含硫酸酯的黏多糖。 蛋白質(zhì)或其它大分子對酶的修飾：主要是血清蛋白質(zhì)。第六十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）修飾酶的化學性質(zhì)1. 修飾酶的穩(wěn)定性得到提高；2. 修飾酶的抗原性得到降低；3. 修飾酶的最適pH值變化得更有應(yīng)用價值；4. 修飾酶的動力學性質(zhì)：通常Km值改變。第六十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、模擬酶第一節(jié) 模擬酶概論第二節(jié) 模擬酶的理論基礎(chǔ)和策

37、略第三節(jié) 模擬酶的分類和制備第六十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 模擬酶概論 模擬酶：根據(jù)酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的化合物。 1. 模擬酶的金屬輔基：模擬酶研究的重要內(nèi)容之一就是模擬酶分子中的金屬輔基的作用。 2. 模擬酶的活性功能基：模擬活性中心的幾個活性功能基團。 3. 模擬酶的高分子作用方式：利用高分子化合物作為模型化合物的骨架，引入活性功能基來模擬酶的高分子作用方式。 4. 模擬酶與底物的作用：利用合成的化合物來模擬酶的空間結(jié)構(gòu)。如冠醚化合物空穴。 5. 模擬酶的形狀：第六十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月

38、第二節(jié) 模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略1. 模擬酶的酶學基礎(chǔ) 酶的作用機制：過渡態(tài)理論 模擬酶的設(shè)計：一方面基于酶的作用機制；另一方面要基于對簡化的人工體系中識別、結(jié)合和催化的研究。第六十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略2. 超分子化學基礎(chǔ) 主-客體化學：主體和客體在結(jié)合部位的空間及電子排列的互補。 超分子：該分子形成源于底物和受體的結(jié)合，這種結(jié)合基于非共價鍵相互作用，當接受體與絡(luò)合離子或分子結(jié)合形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的實體，形成超分子。 功能：分子識別、催化、選擇性輸出。第六十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 模擬酶的理論基礎(chǔ)和策略3.

39、 設(shè)計要點（1）設(shè)計前： 酶活性中心-底物復合物的結(jié)構(gòu)； 酶的專一性及其同底物結(jié)合方式的能力； 反應(yīng)的動力學及各中間物的知識。 （2）設(shè)計中： 為底物提供良好的微環(huán)境； 催化基團必須相對于結(jié)合點盡可能同底物的功能團相接近； 應(yīng)具有足夠的水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性。第六十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 模擬酶的分類和制備一. 根據(jù)Kirby分類法 1. 單純酶模型：化學方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性。 2. 機理酶模型：通過對酶作用機制諸如識別、結(jié)合和過渡態(tài)穩(wěn)定化的認識，來指導酶模型的設(shè)計和合成。 3. 單純合成的酶樣化合物：化學合成的具有酶樣催化

40、活性的簡單分子。二. 按照模擬酶的屬性 主-客體酶模型；膠束酶模型；肽酶； 抗體酶；分子印跡酶模型；半合成酶。第七十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月膠束酶模型第七十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月水解酶模型模擬唯鐵氫化酶模型第七十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、抗體酶（一）抗體酶的概念： 抗體酶（abzyme）又稱催化抗體（catalytic antibody），是指通過一系列化學與生物技術(shù)方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應(yīng)免疫學性質(zhì)，還類似于酶，能催化某種活化反應(yīng)。將這類具催化能力的免疫球蛋白稱為催化抗體，即抗體酶。 它是利用現(xiàn)代生物學

41、、化學的理論與技術(shù)交叉研究的成果，是一種對其 可變區(qū)賦予了酶的屬性的具有催化功能的抗體分子，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物。第七十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月抗體與酶的異同 相同點：都是蛋白質(zhì)，都有特異性。 不同點：（1）抗體無催化活力，酶有催化活力。（2）本質(zhì)差別：酶是能與反應(yīng)過渡態(tài)選擇結(jié)合的催化物質(zhì)，抗體是和基態(tài)緊密結(jié)合的物質(zhì)。（3）酶的活性和合成受到代謝調(diào)節(jié)，種類有限。 抗體只有在抗原存在時才產(chǎn)生，種類無限。第七十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）抗體酶的催化特性 1. 抗體酶的理論基礎(chǔ) 過渡態(tài)理論認為，酶與底物的結(jié)合經(jīng)歷了一個易于

42、形成產(chǎn)物的過渡態(tài)，實際上是降低了反應(yīng)所需的活化能。第七十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）抗體酶的催化特性 利用抗體能與抗原特異結(jié)合的原理，以過渡態(tài)類似物作為半抗原來誘導與其互補構(gòu)象的抗體，使其具有催化活性; 這樣產(chǎn)生的抗體能特異地識別反應(yīng)過程中真正的過渡分子，可觀察到抗體催化相應(yīng)底物發(fā)生化學反應(yīng)，降低反應(yīng)的活化能達到催化反應(yīng)的目的。第七十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 抗體酶的特點（1）與天然酶相比抗體酶的特點 能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)： 有更強的專一性和穩(wěn)定性：催化抗體作為一種具有酶和抗體雙重功能的新型生物大分子，用作分子識別元件，具有優(yōu)于酶和抗

43、體的突出特點。 催化作用機制不同：目前不太清楚。第七十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）抗體酶和非催化性抗體作用的比較 更高的反應(yīng)特異性： 反應(yīng)的可逆性： 反應(yīng)的量效關(guān)系：抗原與抗體結(jié)合需要比例合適，任何一種過多都不利于反應(yīng)；抗體酶與底物結(jié)合，在其它條件均合適的情況下，增加抗體濃度顯著加速酶反應(yīng)。 反應(yīng)過程：均可分為結(jié)合階段和反應(yīng)階段。第一階段無差別，第二階段抗體酶催化底物分解，底物分子有變化。第七十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）抗體酶的催化機理（1）過渡態(tài)理論與抗體酶：（2）抗體酶催化的三種重要反應(yīng)機制 水解作用機制： 基團轉(zhuǎn)移： 連續(xù)反應(yīng)機制：（3）

44、抗體酶催化反應(yīng)的介質(zhì)效應(yīng) 酯解反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ： 抗體酶在有機溶劑中具穩(wěn)定性。 脫羧反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ：有機溶劑引起脫羧反應(yīng)速率增加。 ?；D(zhuǎn)移反應(yīng)中介質(zhì)效應(yīng) ：在疏水溶劑中，活性較高。第七十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）抗體酶催化反應(yīng)的類型1. 轉(zhuǎn)酰基反應(yīng):2. 水解反應(yīng):3. Claisen重排反應(yīng):烯丙基醚在高溫下重排成鄰烯丙基酚的反應(yīng)。4. 酰胺合成反應(yīng):5. Diels-Alder反應(yīng):又名雙烯加成，由共軛雙烯與烯烴或炔烴反應(yīng)生成六元環(huán)的反應(yīng)，是有機化學合成反應(yīng)中非常重要的碳碳鍵形成的手段之一，也是現(xiàn)代有機合成里常用的反應(yīng)之一。 6. 轉(zhuǎn)酯反應(yīng):7. 光誘導反應(yīng):

45、8. 氧化還原反應(yīng):9. 脫羧反應(yīng):10. 順反異構(gòu)化反應(yīng):第八十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（五）抗體酶的制備方法 將抗體轉(zhuǎn)變?yōu)槊缚赏ㄟ^誘導法、拷貝法、引入法、化學修飾法等途徑。 1. 誘導法是利用反應(yīng)過渡態(tài)類似物為半抗原制作單克隆抗體，篩選出具高催化活性的單抗即抗體酶。 2. 拷貝法主要根據(jù)抗體生成過程中抗原-抗體互補性來設(shè)計的。 3. 引入法則借助基因工程和蛋白質(zhì)工程將催化基因引入到特異抗體的抗原結(jié)合位點上，使其獲得催化功能。 4. 化學修飾法對抗體進行化學修飾，使抗體與催化基團相連。第八十一張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（六）抗體酶的應(yīng)用前景1. 將不可能

46、發(fā)生的反應(yīng)變?yōu)榭赡埽?. 使苛刻條件下的反應(yīng)變?yōu)闇睾蜅l件下的反應(yīng)；3. 可選擇性的催化平行反應(yīng)中的某一反應(yīng)，大大增加產(chǎn)品的產(chǎn)率；4. 用于快速分析氨基酸序列；5. 用病毒蛋白水解過程中的過渡肽類似物誘導抗體酶，可作為藥學上的接種疫苗；6. 指導未知酶的尋找；7. 抗體酶在幫助戒毒方面的應(yīng)用 ：用人工抗體酶的被動免疫也許能阻斷可卡因上癮，達到戒毒目的 ；8. 抗體酶用于腫瘤治療：目前正在發(fā)展一種稱為抗體介導前藥治療（ADEPT）技術(shù)，即將能水解前藥【前藥( prodrug)是指由具有生物活性的藥物經(jīng)化學修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)轶w外無活性的化合物。】釋放出腫瘤細胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯(lián)，這樣酶就會通過

47、和腫瘤結(jié)合的抗體而存在于細胞的表面。抗體酶就會將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物，從而提高腫瘤細胞局部藥物濃度，增強對腫瘤的殺傷力，達到提高腫瘤化療效果的目的。第八十二張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月印跡酶1分子印跡概念： 制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。第八十三張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月印跡酶2分子印跡技術(shù)過程：（1）選定印跡分子和功能單體，使二者發(fā)生互補反應(yīng)；（2）在印跡分子-單體復合物周圍發(fā)生聚合反應(yīng)；（3）用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。3分子印跡酶：（1）通過分子印跡技術(shù)可以產(chǎn)生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用，并可以在結(jié)合部位的

48、空腔內(nèi)誘導產(chǎn)生催化基團，并與底物定向排列。（2）性質(zhì)：遵循米氏方程，催化活力依賴反應(yīng)速度常數(shù)。第八十四張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月印跡酶4. 表面分子印跡：（1）無機物為載體的表面印跡：（2）固體材料的表面修飾：（3）蛋白質(zhì)的表面印跡：第八十五張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 生物酶工程一、酶基因的克隆和表達二、酶分子的改造三、融合酶第八十六張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、酶基因的克隆和表達第八十七張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶基因克隆的操作過程培養(yǎng)含有用酶的生物質(zhì)粒等基因工程載體目的酶基因克隆載體重組載體宿主細胞轉(zhuǎn)化子目的基因

49、克隆獲取選擇導入培養(yǎng)篩選、鑒定第八十八張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月“ 縱 向 ” 體 系“橫向”體系電泳層析離心分光光度基因操作其它分（分離目的基因）切（切割目的基因和載體）接（連接目的基因和載體）轉(zhuǎn)（轉(zhuǎn)化宿主細胞）篩（篩選陽性克?。┍恚ū磉_目的基因）構(gòu)建基因文庫（DNA文庫和cNDA文庫）；PCR法；化學人工合成法；從mRNA中獲得。利用限制性內(nèi)切酶特異性切開載體和目的基因。利用DNA連接酶連接目的基因和載體。重組DNA導入原核和真核細胞不一樣：制備感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。1. 利用載體的選擇標記來篩選，如藍白斑；2. 利用PCR法來鑒定導入片段與目的基因片段長度的一致；

50、3. 利用核酸雜交法；4. 利用目的基因的表達蛋白與轉(zhuǎn)化細胞的表達蛋白是否一致。（一）酶基因克隆的主要操作步驟第八十九張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）酶基因常用的克隆方法1. 根據(jù)已知序列克隆基因：2. 根據(jù)已知探針克隆基因：3. 未知序列的基因打靶：（1）隨機引物PCR；（2）差別顯示PCR（DD-PCR）;（3）代表性差式分析PCR（RAD-PCR；一種差減雜交）。第九十張，PPT共一百零五頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）酶的異源表達1. 酶基因在原核生物中的表達（1）原核生物基因表達系統(tǒng)的特點 只有一種RNA聚合酶； 表達是以操縱子為單位的； 轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)，是連續(xù)進行的； 一般不含內(nèi)含子； 基因表達控制主要在轉(zhuǎn)錄水平； 大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上含有真核生物缺乏的轉(zhuǎn)譯起始密碼子及SD序列。（2）原核生物基因表達載體：（3）影響原核生物基因表達系統(tǒng)表達效率的因素：很多；如啟動子結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)譯起始序列、啟動子同克隆基因間