1、關(guān)于基因組測序技術(shù)第一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一些主要模式生物基因組測序概況1995年 7月，第一個(gè)基因組流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）的全序列發(fā) 表，大小為1.8 Mb； 1996年 10月，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 的基因組全部測序完成； 1997年 9月，大腸桿菌（Escherichia coli）基因組全部測 序完成，全長5 Mb； 2001年 12月，線蟲（Caenorhabditis ele gans）基因組測序完成. 第二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一些主要模式生物基因組測序

2、概況2000年：3月，Celera公司完成果蠅（Drosophila me lanogaster）基因組（180 Mb）的全部測序工作，在當(dāng)時(shí)所有已測序的基因組中是最大的 ，同時(shí)這也證明了“全基因組鳥槍法”的可行性； 2000年 12 月，第一個(gè)植物基因組擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組被全部測序 ，大小為125 Mb. 第三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、測序流程1.構(gòu)建生物基因組文庫或cDNA文庫 DNA的提取和制備酶切制備克隆用DNA片段 與載體連接轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 篩選鑒定擴(kuò)增培養(yǎng)。2. 從基因組文庫中提取DNA大片段，進(jìn)行測序： 將DNA用超聲波

3、（或限制性內(nèi)切酶）切成能夠測序的小片斷(200-500bp)小片斷和載體結(jié)合，植入細(xì)菌中進(jìn)行擴(kuò)增（或用PCR擴(kuò)增） 從細(xì)菌中提取出繁殖好的質(zhì)粒 酶切，制取測序的DNA片段3. 測序：上測序儀測序 。4. 利用重疊技術(shù)，排出DNA大片段的序列。第四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、DNA測序的方法雙脫氧鏈終止法測序化學(xué)降解法測序自動(dòng)化測序非常規(guī)DNA測序第五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）Sanger的雙脫氧鏈末端終止法 1.基本原理: 通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來讀取待

4、測DNA分子的順序。第六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Cambridge的F. Sanger在1977年發(fā)明用雙脫氧鏈終止法測定單鏈DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能夠用單鏈DNA作為模板，合成準(zhǔn)確的DNA互補(bǔ)鏈；該酶能夠用2，3-雙脫氧核苷三磷酸作底物并將其聚合到新生寡核苷酸鏈的3-末端，從而終止其延伸反應(yīng)。在DNA測序反應(yīng)中，加入模板DNA，引物（特異性引物），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一種ddNTP。常用Klenow大片段，無53外切酶活性?；驹?第七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2.技術(shù)路線與要求制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段

5、引物退火 加入DNA多聚酶 4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳 根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列 A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性B M13克隆單鏈DNAC 噬?？寺NAD PCR產(chǎn)生單鏈DNAA 高酶活性B 無53外切酶活性C 無35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基第八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5PP 53HOOH 35POH 3P32 55POH 3HODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制備單鏈D

6、NA加放射性引物第九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月ddGTPddATPddTTPddCTP5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G聚合產(chǎn)物分別在4個(gè)泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列第十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）Maxam-Gilb

7、ert的化學(xué)降解法1.基本原理 是用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割并產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈降解產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影之后，可直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。 第十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2 技術(shù)路線 將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記,以便顯示DNA條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序第十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Maxam-Gilbert測序法的特異斷裂32P32PATCGATCG32PATCGATATC

8、GATSpecific Reaction to G 化學(xué)法無放射線片段不能顯像斷裂處斷裂處ATCGATCGAT第十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù)第十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5PP 53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC堿性磷酸單酯酶除去 5磷酸基 多核苷酸磷酸激酶-32P-ATP分離單鏈DNA分別在4個(gè)試管中進(jìn)行特異斷裂第十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月GG+AT+CC5 32P -GTCATGT

9、GCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G斷裂產(chǎn)物分別在4個(gè)泳道電泳從下到上依次讀出DNA片段的核苷酸序列第十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)法測序?qū)嵗哙さ谑藦?，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月改進(jìn)的特異化學(xué)切割反應(yīng)第十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）自動(dòng)化測序1.基本原理 與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的

10、熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光, ddGTP標(biāo)記黃色熒光, ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基.第二十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四） 非常規(guī)測序1. 毛細(xì)管電泳 用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳,節(jié)省時(shí)間,加快測序進(jìn)程,其他程序同鏈終止法或化學(xué)測序法.2. 光點(diǎn)測序 脫氧三磷酸核苷酸連接到DNA 3-末端時(shí)會(huì)釋放1個(gè)焦磷酸(PPi) ,焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)化為化學(xué)能,并發(fā)出光亮.由此,往反應(yīng)液中每次只加入

11、1種核苷酸,當(dāng)加入的核苷酸結(jié)合時(shí),反應(yīng)液發(fā)出亮點(diǎn),并記錄核苷酸種類;當(dāng)核苷酸未結(jié)合時(shí),反應(yīng)液中的核苷酸酶迅速分解此核苷酸,由此來測定DNA序列. 第二十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3. DNA芯片測序 基本原理 將各種排列順序的寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上, 每個(gè)點(diǎn)播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會(huì)在確定位置發(fā)出信號(hào),然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.第二十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月利用基因芯片進(jìn)行雜交測序的原理第二十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年

12、6月三、測序及序列的組裝的策略（一） 隨機(jī)測序與序列組裝 隨機(jī)測序也稱”鳥槍法”. 第二十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月ABC小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP錯(cuò)裝第二十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)例:流感嗜血桿菌基因組的測序及順序組裝超聲波打斷純化的基因組DNA 瓊脂糖電泳收集1.62.0Kb的區(qū)段、純化 構(gòu)建到質(zhì)粒載體中 隨機(jī)挑選19687個(gè)克隆,進(jìn)行28643次測序,得到可讀順序?yàn)?1 631 485 bp 組裝成140個(gè)覆蓋全基因組范圍的獨(dú)立的順序重疊群, 第二十七張，PPT共

13、一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 各重疊群間仍有間隙 順序間隙 物理間隙 載體或宿主菌 選用不當(dāng)而被丟失的順序測序時(shí)遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫第二十八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月序列組裝原理:直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆,然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.優(yōu)點(diǎn):不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝第二十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）限制測序 限制測序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA 順序進(jìn)行組裝. 一些已繪制了遺傳圖與物理圖

14、的微生物基因組測序中也采用這一方法. 如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據(jù)克隆重疊群,先進(jìn)行各個(gè)BAC克隆的隨機(jī)測序,再進(jìn)行序列組裝； 水稻基因組測序計(jì)劃采取得策略與此相同.第三十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（三） 指導(dǎo)測序與序列組裝 建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測序”。 在人類基因組進(jìn)入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下: A 構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序; B 構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序,讀取2個(gè)端部順序; C 參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點(diǎn),進(jìn)行序列組裝，排成重疊克

15、隆群.第三十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb), 利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig), 分別測序后拼裝. 這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝第三十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月兩種策略的比較鳥槍法策略 指導(dǎo)測序策略不需背景信息 構(gòu)建克隆群 (遺傳、物理圖譜)時(shí)間短 需要幾年的時(shí)間 需要大型計(jì)算機(jī)得到的是草圖(Draft) 得到精細(xì)圖譜第三十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（四） 其他測序路線1.重要區(qū)域優(yōu)先測序 人

16、們對感興趣的基因或與疾病相關(guān)的基因優(yōu)先測序.如:人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)位于第6號(hào)染色體,與人類免疫系統(tǒng)有關(guān)，因而優(yōu)先測序.第三十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. EST (Expressed sequence tag) 測序 EST是一種重要的基因組圖分子標(biāo)記,以EST為探針很容易從 cDNA文庫中篩選全基因,又可從BAC克隆中找到其基因組的基因序列. 優(yōu)點(diǎn): A mRNA 可直接反轉(zhuǎn)錄成cDNA,而且cDNA文庫也比較容易構(gòu)建; B 對cDNA文庫大量測序,即可獲得大量EST的序列; C EST為基因的編碼區(qū),不包括內(nèi)含子和基因間區(qū)域,一次測序的結(jié)果足以鑒定所代表的基因

17、;第三十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人類基因組計(jì)劃 人類基因組計(jì)劃（Human genome project）于1990年啟動(dòng)，我國于1999年加入該計(jì)劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號(hào)染色體短臂上約30Mb的測序任務(wù)。 第三十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 人類基因組計(jì)劃的目的闡明人類基因組30億個(gè)堿基對的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類基因，并搞清其在染色體上的位置;破譯人類全部遺傳信息，使人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識(shí)自我;解碼生命、了解生命的起源、了解生命體生長發(fā)育的規(guī)律;認(rèn)識(shí)種屬之間和個(gè)體之間存在差異的起因、認(rèn)識(shí)疾病產(chǎn)生的機(jī)制以及長壽與衰老等生命現(xiàn)象

18、、為疾病的診治提供科學(xué)依據(jù)。第三十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 人類基因組草圖的完成 2000年6月26日是人類歷史上值得紀(jì)念的一天。人類基因組的工作草圖已經(jīng)繪制完畢并于這天向全世界公布。最終完成圖要求測序所用的克隆能忠實(shí)地代表常染色體的基因組結(jié)構(gòu)，序列錯(cuò)誤率低于萬分之一。第三十八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成第三十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月美國國家人類基因組研究所所長弗朗西斯柯林斯在介紹情況。 第四十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月人類基因組草圖基本信息由31.6

19、5億bp組成含33.5萬基因與蛋白質(zhì)合成有關(guān) 的基因占2%人類基因組人類蛋白質(zhì)61%與果蠅同源43%與線蟲同源46%與酵母同源第四十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2000年6月公共領(lǐng)域測序計(jì)劃工作框架圖第四十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2001 年2月16日 人類基因組“精細(xì)圖”完成，(99%),2003年4月14日 人類基因組序列圖亦稱“完成圖”（99.99%），提前繪制成功第四十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月A. Celera Genomics 人類基因組的測序策略3.人類基因組測序策略第四十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022

20、年6月采集5個(gè)自愿者的DNA樣品構(gòu)建3種不同插入子大小的基因組文庫2Kb, 10Kb和50Kb完成約2700萬次插入子末端測序,總長14800MbGeneBank下載104018個(gè)BAC末端順序PFP發(fā)表的公開數(shù)據(jù)主要為BAC克隆的順序,共4443.3Mb隨機(jī)測序與序列組裝方法和指導(dǎo)測序與序列組裝方法相結(jié)合進(jìn)行序列組裝第四十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月B 國際人類基因組測序策略構(gòu)建BAC克隆 限制性酶處理獲得指紋 根據(jù)指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群 根據(jù)STS標(biāo)記,將BAC克隆重疊群標(biāo)定在物理圖上 每個(gè)BAC克隆內(nèi)部采用鳥槍法測序,組裝 將BAC插入順序與BAC克隆指紋極

21、重疊群對比,將已閱讀的順序錨定到物理圖上第四十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4.人類基因組測序結(jié)果基因數(shù)是3萬、4萬還是10萬 人類遺傳基因數(shù)量比原先估計(jì)的少很多。目前研究表明，人類基因組中約有3萬至4萬個(gè)蛋白編碼基因，僅僅是果蠅基因數(shù)目的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個(gè)。此結(jié)論是由兩大科研小組的數(shù)據(jù)是從DNA水平上得出的；而“人類有10萬多個(gè)基因”則是從RNA水平上得出的結(jié)論。所以，這些數(shù)據(jù)不能推翻“人類有10萬個(gè)基因”的說法。第四十八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月人類基因組研究的驚人發(fā)現(xiàn) 19號(hào)染色

22、體是含基因最豐富的染色體，而13號(hào)染色體含基因量最少目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能人類基因組中存在“熱點(diǎn)”和大片“荒漠”。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無用DNA” 不包含或含有極少基因的成分。基因組上大約有14的區(qū)域沒有基因的片段。 353的基因包含重復(fù)的序列。這說明那些原來被認(rèn)為是“垃圾”的DNA也起重要作用，應(yīng)該被進(jìn)一步研究。第四十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是單核苷酸多態(tài)性 人類999的基因密碼是相同的，而差異不到01，不同人群僅有140萬個(gè)核苷酸差異。這些差異是由“單一核苷酸多樣性”（SN

23、P）產(chǎn)生的，它構(gòu)成了不同個(gè)體的遺傳基礎(chǔ)，個(gè)體的多樣性被認(rèn)為是產(chǎn)生遺傳疾病的原因。在整個(gè)基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別。 第五十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5.人類基因組計(jì)劃的意義 隨著人類基因組逐漸被破譯，一張生命之圖將被繪就，人們的生活也將發(fā)生巨大變化。人類基因研究的意義在于它可以支持和推動(dòng)生命科學(xué)中一系列重要的基礎(chǔ)性研究。如基因組遺傳語言的破譯，基因的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，生命的起源和進(jìn)化，細(xì)胞發(fā)育、生產(chǎn)、分化的分子機(jī)理，疾病發(fā)生的機(jī)理等。第五十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）確定人類基因組中約5

24、萬個(gè)編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。第五十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。（4）研究空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來研究真核基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。第五十

25、三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對研究人類基因組的遺傳與進(jìn)化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。第五十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類基因

26、組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后的影響，可能指導(dǎo)人類有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。第五十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（8）研究染色體和個(gè)體之間的多態(tài)性。這些知識(shí)可被廣泛用于基因診斷、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類學(xué)的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進(jìn)程、人類在地球上的分布與遷移以及人類與其他物種之間的比較。第五十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月以人類基因組和擬南芥基因組為例說明你對生物基因組全序測定工作的科學(xué)意義與社會(huì)意義的認(rèn)識(shí)（8分） 中國科學(xué)院2002

27、年 碩士學(xué)位研究生入學(xué)分子遺傳學(xué)試題第五十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6. 人類基因組計(jì)劃的倫理學(xué)A 個(gè)人DNA順序的隱私權(quán). 如:”次等”基因攜帶者可能受到岐視,職業(yè)限制,醫(yī)療保險(xiǎn)等問題;B 基因?qū)＠麊栴}第五十八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月7. 后人類基因組計(jì)劃 伴隨著人類基因組計(jì)劃的迅速進(jìn)展，基因的全序列逐步被完整的測出，會(huì)出現(xiàn)大量的不知道任何功能信息的序列。因此，在HGP完成之后，即全部人類基因被定序之后，還需要：破解貯存于基因組之中的遺傳語言;識(shí)別、分離、鑒定和克隆所有基因；搞清每個(gè)基因的功能及基因之間的相互作用和相互關(guān)系。第五十九張，PPT共一百

28、二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻的基因組 2002年我國科學(xué)家完成了水稻基因組定序和初步分析。出人意表的是，水稻的基因竟比人類基因還要多得多。人類基因大約有3-4萬個(gè)，水稻有46022-55615個(gè)基因。因此水稻基因組可說是繼人類基因組之后，完成定序的最大基因組，也是至今已知最大的植物基因組。由于水稻是全球半數(shù)以上人口的主食，對解決全球糧食問題具有重要意義。第六十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組學(xué)概述基因組（genome），又稱染色體組一個(gè)物種單倍體的染色體數(shù)目，物種全部遺傳信息的總和物種遺傳信息的“總詞典”控制發(fā)育的“總程序”生物進(jìn)化歷史的“總檔案”第六十一張，PPT共

29、一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組學(xué)（genomics）1986年提出，至今20年，已經(jīng)發(fā)展成為遺傳學(xué)中最重要的分支學(xué)科。對物種的所有基因進(jìn)行定位、作圖、測序和功能分析第六十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組學(xué)研究的最終目標(biāo) 獲得生物體全部基因組序列 鑒定所有基因的功能 明確基因之間的相互作用關(guān)系 闡明基因組的進(jìn)化規(guī)律第六十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月經(jīng)典遺傳學(xué) 在20世紀(jì)初，遺傳學(xué)剛剛誕生的時(shí)候，遺傳學(xué)家的工作主要是鑒別感興趣的基因，確定這些基因在染色體上的位置。 第一個(gè)環(huán)節(jié)：尋找自發(fā)突變體，或者利用物理、化學(xué)因素誘發(fā)突變。 第二個(gè)環(huán)節(jié)：通過連鎖

30、分析確定新基因與已知基因的相互關(guān)系，繪制遺傳連鎖圖。第六十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月幾個(gè)代表物種的基因組大小第六十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月CREDIT: JOE SUTLIFF Science, Vol 291: 1221.Fishing in a More Effective Way!第六十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組學(xué)的研究內(nèi)容 結(jié)構(gòu)基因組學(xué) 功能基因組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)第六十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics） 基因定位 基因組作圖 測定核苷酸序列第六十八

31、張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月功能基因組學(xué)（functional genomics） 又稱后基因組學(xué)（postgenomics) 基因的識(shí)別、鑒定、克隆 基因結(jié)構(gòu)、功能及其相互關(guān)系 基因表達(dá)調(diào)控的研究第六十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月人類基因組計(jì)劃1990，美國國立衛(wèi)生研究所和能源部投資30億，啟動(dòng)了人類基因組計(jì)劃，預(yù)計(jì)15年時(shí)間完成人類基因組全部序列的測定1996，完成標(biāo)記密度為0.6cM的人類基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類基因組圖譜的修訂版2002，完成測序工作第七十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022

32、年6月基因組圖譜的構(gòu)建基因組計(jì)劃的主要任務(wù)是獲得全基因組序列但是，現(xiàn)在的測序方法每次只能測8001000bp大量的測序片段要拼接要知道序列在Chr上的位置才能正確拼接基因組計(jì)劃的第一個(gè)環(huán)節(jié)： 構(gòu)建基因組圖譜第七十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組圖譜遺傳圖譜（genetic map）物理圖譜（physical map）第七十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜（genetic map） 采用遺傳分析的方法將基因或其它DNA序列標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。第七十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳標(biāo)記有可以識(shí)別的標(biāo)記，才能確定目標(biāo)的方位及彼此

33、之間的相對位置。構(gòu)建遺傳圖譜就是尋找基因組不同位置上的特征標(biāo)記。包括： 形態(tài)標(biāo)記 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 生化標(biāo)記 DNA分子標(biāo)記第七十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月多態(tài)性（polymophism）所有的標(biāo)記都必須具有多態(tài)性！ 花色：白色、紅色 株高：高、矮 血型：A、B、O型 淀粉：糯、非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結(jié)果！第七十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月形態(tài)標(biāo)記形態(tài)性狀：株高、顏色、白化癥等又稱表型標(biāo)記數(shù)量少很多突變是致死的受環(huán)境、生育期等因素的影響第七十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 最早建立的果蠅連鎖圖，就是利用控制果蠅眼睛的形狀、顏色，軀體的

34、顏色、翅膀的形狀等形態(tài)性狀作為標(biāo)記，分析它們連鎖關(guān)系及遺傳距離，繪制而成的。 控制性狀的其實(shí)是基因，所以形態(tài)標(biāo)記實(shí)質(zhì)上就是基因標(biāo)記。第七十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月果蠅連鎖圖第七十八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞學(xué)標(biāo)記明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征 染色體的核型 染色體的帶型 染色體的結(jié)構(gòu)變異 染色體的數(shù)目變異優(yōu)點(diǎn)：不受環(huán)境影響缺點(diǎn)：數(shù)量少、費(fèi)力、費(fèi)時(shí)、對生物體的生長發(fā)育不利第七十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月生化標(biāo)記 又稱蛋白質(zhì)標(biāo)記 就是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記。 如：同工酶、貯藏蛋白 優(yōu)點(diǎn)：數(shù)量較多，受環(huán)境影響

35、小 缺點(diǎn)：受發(fā)育時(shí)間的影響、有組織特異性、只反映基因編碼區(qū)的信息第八十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA分子標(biāo)記簡稱分子標(biāo)記以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)： 不受時(shí)間和環(huán)境的限制 遍布整個(gè)基因組，數(shù)量無限 不影響性狀表達(dá) 自然存在的變異豐富，多態(tài)性好 共顯性，能鑒別純合體和雜合體第八十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP） DNA序列能或不能被某一酶酶切，相當(dāng)于一對等位基因的差異。 如有兩個(gè)DNA分子（一對染色體），一個(gè)具有某一種酶的酶切位點(diǎn)，而另

36、一個(gè)沒有這個(gè)位點(diǎn)，酶切后形成的DNA片段長度就有差異，即多態(tài)性。 可將RFLP作為標(biāo)記，定位在基因組中某一位置上。人類基因組中有105個(gè)RFLP位點(diǎn)，每一位點(diǎn)只有兩個(gè)等位基因。第八十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月RFLP分析第八十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月RFLP標(biāo)記位共顯性標(biāo)記第八十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記微衛(wèi)星又稱為簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）。這種重復(fù)序列的重復(fù)單位很短，常常只有2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)核苷酸如一條染色體TCTGAGAGAGACGC 另

37、一染色體TCTGAGAGAGAGAGAGAGACGC，就構(gòu)成了多態(tài)性。第八十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜的構(gòu)建方法 理論基礎(chǔ): 連鎖與交換 基本方法: 兩點(diǎn)測驗(yàn)法和三點(diǎn)測驗(yàn)法第八十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月植物遺傳圖譜的構(gòu)建 選擇研究材料（親本） 構(gòu)建分離群體 遺傳標(biāo)記檢測 標(biāo)記間的連鎖分析第八十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月選擇親本 要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異大 但又不能相差太大以導(dǎo)致引起子代不育。 對備選材料進(jìn)行多態(tài)(差異)性檢測，綜合測定結(jié)果，選擇有一定量多態(tài)性的一對或幾對材料作為遺傳作圖親本。第八十八張，PPT共一百二十

38、二頁，創(chuàng)作于2022年6月構(gòu)建作圖群體 第八十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳標(biāo)記的染色體定位 利用遺傳學(xué)方法或其它方法將少數(shù)標(biāo)記錨定在染色體上，作為確定連鎖群的參照系。 常用的方法： 單體分析 三體分析 代換系分析 附加系分析第九十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記間的連鎖分析利用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性的標(biāo)記分析分離群體中所有個(gè)體的基因型根據(jù)連鎖交換的情況，確定標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系和遺傳距離有計(jì)算機(jī)軟件可以應(yīng)用第九十一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月水稻遺傳圖 1994年，水稻第一張高密度遺傳圖譜 927個(gè)位點(diǎn)， 1383個(gè)標(biāo)記 1998年，11

39、57個(gè)位點(diǎn)，2275個(gè)標(biāo)記 2000年，3267個(gè)標(biāo)記 高密度的遺傳圖譜為基因組測序和遺傳研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。第九十二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月人類遺傳圖譜的構(gòu)建 不可能根據(jù)需要選擇親本，設(shè)計(jì)雜交組合，構(gòu)建分離群體！ 只能檢測現(xiàn)存家庭連續(xù)幾代成員的基因型 家系分析法 資料有限、必須借助于統(tǒng)計(jì)學(xué)方法第九十三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月現(xiàn)有的人類遺傳圖譜 122號(hào)染色體 8個(gè)家系134個(gè)成員 X染色體，12個(gè)家系170個(gè)成員 5364個(gè)SSR標(biāo)記 2335個(gè)位點(diǎn) 標(biāo)記間的平均距離599kb第九十四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月物理圖譜的構(gòu)建

40、用分子生物學(xué)方法直接檢測DNA標(biāo)記在染色體上的實(shí)際位置繪制成的圖譜稱為物理圖譜。 有遺傳圖譜為什么還要構(gòu)建物理圖譜？ 第九十五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜的缺陷 分別率有限 人類只能研究少數(shù)減數(shù)分裂事件，不能獲得大量子代個(gè)體 測序要求每個(gè)標(biāo)記的間隔小于100kb 實(shí)際是599kb第九十六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月遺傳圖譜的缺陷精確性不夠經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，交換是隨機(jī)發(fā)生的基因組中有些區(qū)域是重組熱點(diǎn)倒位、重復(fù)等染色體結(jié)構(gòu)變異會(huì)限制交換重組第九十七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母遺傳圖與物理圖比較A 遺傳圖B 物理圖第九十八張，PPT共一

41、百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月物理作圖的方法1、限制酶作圖2、依靠克隆的基因組作圖3、熒光原位雜交4、序列標(biāo)簽位點(diǎn)作圖第九十九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月限制酶作圖（restriction mapping）第一百張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月限制酶作圖（restriction mapping）第一百零一張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）第一百零二張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交（fluorescent in situ hybrid

42、ization，F(xiàn)ISH）第一百零三張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）第一百零四張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）第一百零五張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月人類基因組物理圖 1987年，RFLP圖譜，403個(gè)標(biāo)記，10Mb 1994年，5800個(gè)標(biāo)記，0.7Mb 1996年，17000多個(gè)標(biāo)記，100kb 完全適應(yīng)全基因組測序的要求第一百零六張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2

43、022年6月遺傳圖與物理圖的整合有些標(biāo)記既是遺傳標(biāo)記，又是物理標(biāo)記 RFLP標(biāo)記 SSR標(biāo)記 某些基因序列借助這些標(biāo)記可以將遺傳圖和物理圖整合起來第一百零七張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組測序策略有了高密度的基因組圖譜，就可以開始全基因組測序了測序的技術(shù)飛速發(fā)展，現(xiàn)在可以全自動(dòng)化測序的策略有兩個(gè)： 鳥槍法 克隆重疊群法第一百零八張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月鳥槍法（shotgun sequencing）第一百零九張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2022年6月鳥槍法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 不需要高密度的圖譜 速度快、簡單、成本低缺點(diǎn)： 拼接組裝困難，尤其在重復(fù)序列多的區(qū)域主要用于重復(fù)序列少、相對簡單的原核生物基因組第一百一十張，PPT共一百二十二頁，創(chuàng)作于2