1、【摘 要】目的：采用固相抗體包被方法，建立血管緊張素放射免疫分析方法。方法：通過對抗體包被步驟、抗體稀釋濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)體積等條件進行選擇，建立新的分析方法，并進行方法學(xué)鑒定。結(jié)果：本項工作所建立的分析方法測量范圍為100-7800pg/ml，靈敏度為42.2 pg/ml。批內(nèi)、批間變異均小于10%，回收率為90.3%102.2%。結(jié)論：本項工作所建立的固相抗體方法與原有分離試劑分析方法相比，具有操作步驟少、反應(yīng)時間短等優(yōu)點，更加方便臨床檢測。【關(guān)鍵詞】血管緊張素 固相抗體法 放射免疫分析1引言采用固相抗體包被聚苯乙烯試管，并對抗體包被條件進行了研究，建立了血管緊張素放射免疫分析法。結(jié)果表

2、明在28下過夜包被，抗體滴度在1：9萬 時，制備的包被管用于血管緊張素放射免疫分析，結(jié)合達到最大；不同滴度下包被，包被溫度和時間對制備的包被管的影響不同；不同的反應(yīng)時間以及125iai和標(biāo)準(zhǔn)品加樣量的不同也會對包被管的結(jié)合產(chǎn)生影響。血管緊張素包被管法放射免疫分析靈敏度為（42.2pg/ml）；回收率為（90.3%102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%9.0%）和（8.3%10.2%）。2實驗材料血管緊張素多克隆抗體由原子高科醫(yī)學(xué)二部提供；聚苯乙烯六角試管（mmmm）為（哪個）塑料廠產(chǎn)品；125iai及ai藥盒標(biāo)準(zhǔn)品由原子高科醫(yī)學(xué)二部提供；蛋白g填料親合層析柱由美國進口；牛血清白蛋白

3、（bsa）為上海生物制品廠產(chǎn)品。對照藥盒由原子高科股份有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字：）。其他試劑均為分析純。3實驗方法3.1兔igg的純化采用蛋白g柱進行親合層析純化，純化后igg濃度由紫外分光光度法測定。用包被緩沖液（0.1m ph9.5碳酸緩沖液）將兔igg配制10g /ml?；旌暇鶆蚝?50？l /管包被，然后放28過夜，棄去包被管中第一層包被液，各管用500？l洗滌液（0.02 mol/l，ph7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第二層（兔二抗）用。3.2用驢抗兔二抗進行第二層包被用0.05 mol/l，ph7.4磷酸緩沖液（含1%bsa）將兔二抗配成合適的濃度后250？l /管包被，然后放2

4、8過夜，棄去包被管中第二層包被液，各管用500？l洗滌液（0.02 mol/l，ph7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第三層（兔一抗）用。3.3不同滴度兔抗（一抗）包被實驗將兔抗用封閉液配制成1：2萬，1：4萬，1：6萬，1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬，1：16萬不同的滴度，分別加250？l于已經(jīng)包有兔二抗的包被管中，每個滴度做雙復(fù)管，之后在每管中加入100？l 125iai，然后放28靜置過夜；棄去管中溶液，各管用500？l洗滌液清洗3次后測量各管放射性計數(shù)，計算其結(jié)合率，選擇合適的抗體滴度作為工作稀釋度。3.4溫度，時間對抗體包被的影響用封閉液將兔抗（一抗）稀釋成不同滴度（1：

5、2萬，1：4萬， 1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬），分別在不同溫度和時間下包被，實驗中抗體加入體積均為250？l，各管均加入100？l 125iai，將不同條件下制備的包被管進行放射免疫結(jié)合分析，并對結(jié)果進行比較。3.5抗體包被管的制備每管加250？l兔igg溶液（10g /ml），28靜置過夜，棄溶液，各管加500？l洗滌液清洗1次后加入250？l驢抗兔二抗溶液，28靜置過夜，棄溶液，各管加500？l洗滌液清洗1次后加入250？l兔一抗溶液（1：9萬），28過夜，棄溶液，各管加500？l洗滌液清洗1次，棄溶液，自然晾干，密閉，于28下保存。3.6體系反應(yīng)時間，溫度的選擇設(shè)計不同的

6、反應(yīng)條件為371h，373h，415h，424h。3.7加樣量的選擇設(shè)計4組不同的加樣量為：第一組125iai加100？l，標(biāo)準(zhǔn)品加100？l；第二組：125iai加100？l，標(biāo)準(zhǔn)品加50？l；第三組125iai加50？l，標(biāo)準(zhǔn)品加100？l；第四組125iai加50？l，標(biāo)準(zhǔn)品加50？l。3.8放射免疫分析程序標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品、質(zhì)控血清）100？l和標(biāo)記物100？l加于包被管中，混勻，然后放28靜置過夜（1524h），棄溶液，加500？l洗滌液清洗23次，測各管放射性計數(shù)。3.9方法學(xué)考核靈敏度：以20個零標(biāo)準(zhǔn)管的計數(shù)平均值2s對應(yīng)的劑量值表示。準(zhǔn)確度：任取一份血漿標(biāo)本，測定基值后分別加入0

7、pg/ml ，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，再次測定，計算回收率。精密度：測定批內(nèi)和批間變異系數(shù)（cv%）。健全性：將一份高濃度樣品稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分別測定其含量。經(jīng)回歸處理后成一條直線，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。4結(jié)果與討論4.1不同滴度的兔抗（一抗）包被實驗不同滴度抗體包被實驗結(jié)果列于表1，表1結(jié)果表明，當(dāng)抗體滴度為1：16萬1：8萬時，隨著抗體滴度的減小，包被管的結(jié)合率逐步升高；當(dāng)抗體滴度為1：8萬1：2萬時，包被管的結(jié)合率沒有出現(xiàn)明顯升高，基本保持同一水平。所以在不影響放免

8、藥盒靈敏度的前提下，選擇1：9萬作為抗體的工作稀釋度，用于包被。（該處可以作圖，不列表）4.2包被時間，包被溫度對包被的影響結(jié)果列于表2由表2可知，包被溫度和包被時間對包被管免疫結(jié)合的影響依賴于包被時加入抗體的濃度。當(dāng)加入抗體的滴度為1：2萬和1：4萬時，升高包被溫度使包被管的免疫結(jié)合增加，而延長包被時間對包被管的免疫結(jié)合無顯著影響；當(dāng)加入抗體滴度為1：14萬 和1：16萬時，升高包被溫度包被管的免疫結(jié)合顯著減少，原因可能是抗體在低濃度時較不穩(wěn)定，包被過程中較高的溫度使抗體的活性損失；當(dāng)加入抗體滴度為1：8萬和1：9萬時，包被溫度對包被管的免疫結(jié)合影響減少，且包被時間從3h延長到24h，包被管

9、的免疫結(jié)合有所增加。此結(jié)果提示，在較高溫度下，采用較大抗體濃度，只需要較短的包被時間，即可獲得具有較高免疫結(jié)合的抗體包被管。但考慮到實際生產(chǎn)中低成本和包被工藝簡便性的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇抗體滴度為1：9萬，28過夜（1524h）作為包被條件。4.3體系反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度的選擇結(jié)果列于表3，由表3可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在37時，延長反應(yīng)時間從1 h到3 h，免疫分析的最大結(jié)合s0%從46.4%增加到59.2%，但是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點的抑制不好，分別為371 h為16.1%；373 h為14.6%，這可能是反應(yīng)不充分造成的。而反應(yīng)溫度在28時，延長反應(yīng)時間從1524h，免疫反應(yīng)的幾個

10、指標(biāo)都比較好，同時也克服了37反應(yīng)曲線抑制不好的問題，所以在考慮實際操作簡便，節(jié)省時間的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇反應(yīng)條件為28過夜。4.4加樣量對免疫分析的影響結(jié)果列于表4由表4可知，當(dāng)加入標(biāo)記物的量都是50？l時，加入100？l標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的免疫分析主要指標(biāo)最大結(jié)合s0%，曲線的抑制都好于加入50？l標(biāo)準(zhǔn)品的包被管免疫分析主要指標(biāo)，加50？l標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的曲線抑制不好，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點的b/b0%為94.1%，最高濃度點的b/b0%為14.6%。但是考慮到加50？l標(biāo)記物的各管計數(shù)都比較低，還有計數(shù)器的效率等問題，所以標(biāo)記物的加樣量就不采用50？l加樣。當(dāng)加入標(biāo)記物的量都

11、是100？l時，加入100？l標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的免疫分析主要指標(biāo)最大結(jié)合s0%，曲線的抑制都很好，并且各管的放射性計數(shù)也比較高，各種因素對測量的影響也相對較小。當(dāng)加入50？l標(biāo)準(zhǔn)品時，標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)倒勾現(xiàn)象，曲線的最低濃度點b/b0%為101%，出現(xiàn)這種情況就是因為標(biāo)準(zhǔn)曲線的各包被管中加入 的非標(biāo)記抗原的量不夠造成的。所以通過對數(shù)據(jù)的比較，選擇比較合適的加樣量為標(biāo)記物加100？l，標(biāo)準(zhǔn)品加100？l。4.6方法學(xué)鑒定（1）靈敏度。以20個零標(biāo)準(zhǔn)管計數(shù)的平均值-2s對應(yīng)的劑量值表示，靈敏度為（42.2pg /ml）pg/ml。（2）準(zhǔn)確度 已知量的一份血漿樣品中分別加入4種不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)品進行測定，結(jié)果列于表5。由表5可知本法回收率為90.3%102.2%，說明本法準(zhǔn)確性較好。（3）精密度采用本方法對3份含有不同濃度的人血漿樣品重復(fù)測定，計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果列于表6。由表6可知，批內(nèi)變異系數(shù)為（5.1%9.0%）；批間變異系數(shù)為（8.3%9.5%）。（4）健全性（同質(zhì)性）。將一份較高濃度的血漿樣品倍比稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，測定結(jié)果列于表7。由表中數(shù)據(jù)計算其相關(guān)方程為：y=1.000 x +0.4673，r=1.000實驗結(jié)果表明研制的血管緊張素放射免疫分析法（固相抗體