1、角膜急性堿燒傷新穎羊膜移植后的組織病理學(xué)及超微構(gòu)造觀察【摘要】理解角膜堿燒傷急性期治療中新穎羊膜移植促進(jìn)角膜上皮愈合和抑制基質(zhì)浸潤(rùn)及瘢痕形成的作用。方法：從15只正常新西蘭大白兔中隨機(jī)選取3只兔做正常對(duì)照，其余12只兔制作雙眼角膜堿燒傷模型，右眼行羊膜移植，左眼為對(duì)照。分別于術(shù)后14，30d取材角膜進(jìn)展PN多形核白細(xì)胞計(jì)數(shù)，光鏡及透射電鏡觀察。結(jié)果：在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，角膜上皮細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、排列及成纖維細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)構(gòu)造方面，新穎羊膜移植組均優(yōu)于堿燒傷組。結(jié)論：新穎羊膜移植在角膜堿燒傷急性期治療中具有較強(qiáng)的促進(jìn)上皮愈合和抑制炎癥及瘢痕形成的作用?！娟P(guān)鍵詞】羊膜移植0引言眼部堿燒傷是常見的眼外傷

2、之一，傳統(tǒng)的治療方法效果不佳，目前羊膜移植治療眼外表疾病成為一個(gè)新的方向。本實(shí)驗(yàn)以兔雙眼角膜堿燒傷為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，右眼施行早期新穎羊膜移植術(shù)治療，同期比照觀察雙眼的角膜組織構(gòu)造改變。1材料和方法1.1材料安康新西蘭大白兔15只，體質(zhì)量2.02.5kg，雌雄不限，眼表未見異常。隨機(jī)選取3只共6眼作正常對(duì)照，余12只兔制作雙眼堿燒傷模型，隨機(jī)分為兩組14d組和30d組，24h后右眼行新穎羊膜移植，左眼為對(duì)照。1.2方法新穎羊膜取自安康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤組織，產(chǎn)前血清學(xué)檢查排除乙肝、丙肝、梅毒及獲得性免疫缺陷綜合征，取材均在無菌操作下完成。產(chǎn)后立即將胎盤羊膜面用無菌生理鹽水沖洗干凈,自羊膜與絨毛膜之間的潛

3、在空隙鈍性剝離羊膜，使其與絨毛膜別離，后置于4U/L慶大霉素生理鹽水中，放入4冰箱中備用。所制羊膜均于取材后12h內(nèi)使用。倍諾喜眼外表麻醉，置開瞼器，充分暴露眼前段外表，棉簽拭去眼表過多水分，以浸有1l/LNaH溶液直徑為6的單層圓濾紙片置于兔雙眼角膜外表，60s后取下，建立角膜重度堿燒傷模型，立即用生理鹽水沖洗眼外表及結(jié)膜囊。24h后右眼行羊膜移植，左眼為對(duì)照。氯胺酮50g/kg和異丙嗪25g/kg11比例混合背部皮下注射4L進(jìn)展全身麻醉。沿角膜緣360?觷環(huán)形剪開結(jié)膜，將備好的羊膜片上皮面朝上平鋪于眼外表，其邊緣超出角膜緣2，用10-0無損傷縫線連續(xù)縫合，固定于淺層鞏膜使羊膜緊貼于角膜創(chuàng)面

4、，然后將球結(jié)膜縫回至角膜緣，減去周邊多余羊膜，術(shù)畢結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。2.5g/L氯霉素眼藥水點(diǎn)眼，4次/d，于瞼緣縫合2針閉合眼瞼。正常對(duì)照組兔于實(shí)驗(yàn)開場(chǎng)時(shí)即通過氣體栓塞法處死。實(shí)驗(yàn)兔分別于羊膜移植術(shù)后14，30d采取同法處死，取材角膜組織，分別固定于甲醛或戊二醛固定液中，經(jīng)相應(yīng)處理后在普通光學(xué)顯微鏡下或H-600透射電鏡下觀察并照相。2結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)觀察角膜堿燒傷后立即出現(xiàn)灰白色境界清楚的圓形灼傷區(qū)，部分水腫混濁，次日擴(kuò)展到整個(gè)角膜。堿燒傷組炎癥反響較重,分泌物多,角膜外表粗糙不光滑,有較多壞死組織。角膜緣重度睫狀充血，35d后角膜緣即出現(xiàn)新生血管,其后生長(zhǎng)迅速，11d新生血管生長(zhǎng)旺盛,

5、其頂端分叉,部分交織呈網(wǎng)狀，14d新生血管密集侵入角膜緣內(nèi)約2.650.49，30d已達(dá)角膜中央，約5.330.49，角膜呈灰白色血管膜樣改變。角膜上皮愈合緩慢,熒光素染色面積大。新穎羊膜移植組粘性分泌物較少,睫狀充血較輕,手術(shù)后5d，始出現(xiàn)新生血管芽，個(gè)別眼僅見血管輕度擴(kuò)張，其后緩慢生長(zhǎng)，7d可見新生血管管徑細(xì)，血管透明，14d新生血管侵入角膜緣約2.430.74，30d新生血管侵入角膜緣內(nèi)約4.720.42。角膜上皮愈合較快，熒光素染色面積較堿燒傷組校2.2光鏡觀察正常對(duì)照組：角膜上皮45層，排列規(guī)那么，基質(zhì)層膠原纖維排列整齊，無新生血管浸潤(rùn)。術(shù)后14d：堿燒傷組眼外表及角膜基質(zhì)中有大量的

6、PN浸潤(rùn)，可見單層角膜上皮細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面，但其排列疏松、紊亂，且形狀不規(guī)那么，前彈力層不清；基質(zhì)層膠原纖維排列紊亂，粗細(xì)不均，纖維間出現(xiàn)明顯間隙，可見大量成熟新生血管,管腔擴(kuò)大，管壁由單層平滑肌構(gòu)成，管腔內(nèi)有成熟紅細(xì)胞。新穎羊膜移植組：角膜外表及基質(zhì)層內(nèi)少量PN浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞增至23層；膠原排列相對(duì)整齊,已形成雙層的角膜上皮，其排列較規(guī)那么，角膜淺基質(zhì)層內(nèi)可見新生毛細(xì)血管，由單層內(nèi)皮細(xì)胞圍繞，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞，且管徑較小，分布較稀疏。術(shù)后30d：堿燒傷組仍可見較多的PN浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞雖已增至45層，但排列仍不規(guī)那么，基質(zhì)層膠原纖維增生明顯，形成瘢痕；新穎羊膜移植組角膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)少，上皮排列較規(guī)

7、那么，膠原纖維排列整齊。2.3PN計(jì)數(shù)在Q550全自動(dòng)圖像分析儀上進(jìn)展。在20倍物鏡下進(jìn)展PN計(jì)數(shù),每張切片從周邊到中央隨機(jī)取淺基質(zhì)層的5個(gè)視野100002，并取其均值進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析配對(duì)t檢驗(yàn)。結(jié)果顯示：14d，羊膜移植組較堿燒傷組有顯著性差異P0.022；30d，羊膜移植組較堿燒傷組有非常顯著差異P0.001，表1。2.4透射電鏡結(jié)果2.4.1正常對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞4或5層，細(xì)胞核無崩解變形，細(xì)胞間連接嚴(yán)密。基質(zhì)層大多為成熟的纖維細(xì)胞，呈梭形，膠原纖維粗細(xì)均勻，呈板層排列整齊，層內(nèi)平行排列，層間互相垂直。2.4.2羊膜移植術(shù)后14d堿燒傷組可見單層角膜上皮細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面，細(xì)胞水腫，排列不整齊，細(xì)

8、胞間隙增大，細(xì)胞核腫脹，前彈力膜消失，半橋粒數(shù)量較少；角膜基質(zhì)層膠原纖維排列紊亂且出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，基質(zhì)中成纖維細(xì)胞豐富，細(xì)胞核較正常組大，常染色質(zhì)豐富，少量異染色質(zhì)沿核膜分布，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，高爾基復(fù)合體豐富，線粒體腫脹。羊膜移植組可見23層上皮細(xì)胞，細(xì)胞連接較疏松，但優(yōu)于堿燒傷組。成纖維細(xì)胞數(shù)量少于燒傷組，但較正常角膜多，羊膜移植組中膠原纖維斷裂的情況和成纖維細(xì)胞從靜止型向分泌型轉(zhuǎn)化的情況明顯較對(duì)照組少。2.4.3羊膜移植術(shù)后30d堿燒傷組可見角膜上皮細(xì)胞已有3或4層，細(xì)胞水腫較14d組明顯減輕，但細(xì)胞形態(tài)仍不規(guī)那么且排列疏松?；啄ば纬桑胁贿B續(xù)現(xiàn)象，角膜基質(zhì)層膠原纖維增生明顯。羊膜移植組

9、角膜上皮細(xì)胞形態(tài)較規(guī)那么，接近正常角膜上皮細(xì)胞，且細(xì)胞排列密集。上皮細(xì)胞間可見橋粒連接，上皮基內(nèi)幕胞于基底膜之間可見半橋粒。基質(zhì)層膠原纖維排列較整齊，成纖維細(xì)胞數(shù)量較14d明顯減少，成纖維細(xì)胞相對(duì)成熟，靜止的纖維細(xì)胞相對(duì)較多。3討論近年來，臨床觀察發(fā)現(xiàn)，羊膜移植用于堿燒傷的眼外表后，減輕了部分炎癥反響，促進(jìn)了角膜上皮的再生，阻止了角膜血管化，瘢痕化，為臨床治療提供了一條有效途徑1-4。本文旨在將兔角膜堿燒傷后行羊膜移植，觀察其療效，并從形態(tài)學(xué)找尋根據(jù)。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示：羊膜移植組較堿燒傷組炎癥反響輕,分泌物少，新生血管生長(zhǎng)慢并且密度也較小，角膜熒光素染色顯示羊膜能明顯促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。P

10、N計(jì)數(shù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理得出，同期羊膜移植組較堿燒傷組炎性細(xì)胞少，并具有顯著性差異。這是因?yàn)檠蚰ぞ哂醒娱L(zhǎng)上皮生發(fā)細(xì)胞的壽命及維持其克隆增殖才能，增強(qiáng)基底上皮細(xì)胞的粘附，以及促進(jìn)上皮細(xì)胞分化和阻止上皮細(xì)胞調(diào)亡的作用5。其上皮細(xì)胞分泌的HGF、bFGF、EGF、KGF等生長(zhǎng)因子以及KGFR、HGFR等受體6，也促進(jìn)了上皮的修復(fù)。同時(shí)，羊膜基底面與去除表層壞死角膜組織后較安康基質(zhì)較為嚴(yán)密的接觸、封閉，可以顯著減少通過淚膜侵入基質(zhì)的大量多形核白細(xì)胞；羊膜基質(zhì)能促使白細(xì)胞凋亡而消除炎癥；其上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子能抑制PN活化，減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生及抑制其活化7。透射電鏡的結(jié)果說明，正常對(duì)照組角膜上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)那

11、么，連接嚴(yán)密。堿燒傷組角膜上皮細(xì)胞水腫，排列不整齊，細(xì)胞間隙增大，上皮細(xì)胞與前彈力膜的聯(lián)接疏松，半橋粒數(shù)量較少，與嚴(yán)軍等8的結(jié)果一致。該組胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器變化表現(xiàn)為，基質(zhì)中纖維細(xì)胞被激活為成纖維細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有的區(qū)域還可看到高爾基復(fù)合體，這是因?yàn)樾碌牡鞍踪|(zhì)的合成和分泌離不開上述細(xì)胞器；同樣時(shí)相段內(nèi)細(xì)胞核中，常染色質(zhì)豐富，這是細(xì)胞代謝功能代償性增強(qiáng)的結(jié)果，異染色質(zhì)可能部分轉(zhuǎn)化為常染色質(zhì)并螺旋化，以加快核內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄效率，但損傷后細(xì)胞中的線粒體卻不興旺，并且出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，這可能是堿性物質(zhì)對(duì)線粒體等細(xì)胞器的作用進(jìn)展了破壞和抑制9。以上現(xiàn)象充分說明，堿燒傷后激活了靜止的纖維細(xì)胞，使其成

12、為成纖維細(xì)胞，從而大量分泌膠原纖維，促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)。纖維組織增生雖然是眼表傷口愈合的必經(jīng)過程，但過多的膠原分泌必將在眼表形成瘢痕，破壞角膜的透明度，對(duì)視功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。而同期的羊膜移植組的成纖維細(xì)胞數(shù)目低于堿燒傷組。這可能是因?yàn)檠蚰ひ浦灿谘郾砗螅紫绕鸬搅艘粋€(gè)機(jī)械性的保護(hù)作用，防止基質(zhì)層膠原組織暴露溶解；上皮細(xì)胞的修復(fù)，也使成纖維細(xì)胞處于細(xì)胞周期的G1期，抑制了其在角膜受損后的活潑功能，從而抑制了膠原的分泌及瘢痕的形成。另有研究證實(shí)，TGF-1是一種在傷口愈合過程中調(diào)整成纖維細(xì)胞活性的纖維生長(zhǎng)原型細(xì)胞因子，而羊膜具有抑制TGF-1RNA表達(dá)的作用10。本次實(shí)驗(yàn)通過兔眼堿燒傷模型的建立，證實(shí)了

13、新穎羊膜移植對(duì)堿燒傷急性期有較好的治療作用，為我們的臨床工作提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)根據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1王峰,孫乃學(xué),熊全臣,郭絨霞,楊建剛.新穎羊膜移植治療早期重癥眼部燒傷.眼科新進(jìn)展,2022;23(4):278-2792張勐,趙平,江新利,張均.羊膜移植治療兔早期角膜堿燒傷IA-1的表達(dá).國(guó)際眼科雜志,2022;4(1):77-803劉肖藝,劉慶淮.兔角膜緣上皮細(xì)胞培養(yǎng)自體移植修復(fù).國(guó)際眼科雜志,2022;5(1):83-854鄭曉汾,馮克孝,李冰,楊紀(jì)忠,葛京京.兔角膜堿燒傷后不同時(shí)期的組織病理學(xué)變化.國(guó)際眼科雜志,2022;5(3):449-4505Park,TsengSG.Teperaturelingredueskeratytedeathinexierlaserablatedrnealandskinunds.InvestphthallVisSi,1998;39(1):4496KizuiNJ,InatiTJ,StznJ.GrthfatrRNAandprtEininpreservedhuananitiebrane.urrEyeRes,2000;20(3):1