1、第四組液相色譜法測(cè)定對(duì)位紅第1頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二 目前對(duì)于食品中的對(duì)位紅測(cè)定方法主要采用薄層色譜法“液相色譜分析法”列和液相色譜質(zhì)譜分析法等，其中法定檢測(cè)方法包括歐盟委員會(huì)規(guī)定的辣椒粉中蘇丹紅測(cè)定的高效液相色譜法測(cè)定和我國(guó)質(zhì)檢總局頒布的食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法高效液相色譜法(GBT196812005)，但這兩類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中存在一定的技術(shù)缺陷，如樣品本底干擾定性結(jié)論、固體萃取柱的活性難于控制、均未涉及對(duì)“對(duì)位紅”的檢測(cè)方法建立、對(duì)檢測(cè)的干擾等。本方案針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施過(guò)程中可能出現(xiàn)的復(fù)雜問(wèn)題，探討了在提取、分析方面的條件優(yōu)化，使液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀能滿(mǎn)足日常的檢

2、測(cè)工作的需要。第2頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二一、對(duì)位紅的簡(jiǎn)介對(duì)位紅亦稱(chēng)對(duì)硝苯胺紅，常溫下呈固態(tài)，密度1.50g/cm3,熔點(diǎn)248-252。是一種常用的紅色顏料，屬于重氮系列化工合成染色劑，主要應(yīng)用于機(jī)油，蠟，油彩，汽油等工業(yè)產(chǎn)品。對(duì)位紅的熔點(diǎn)即已達(dá)到250 ，明顯不能采用氣相色譜法來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，因?yàn)闃悠泛茈y汽化。所以我們采用液相色譜法來(lái)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。第3頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二 物化性質(zhì)1、物理性質(zhì)： 對(duì)位紅亦稱(chēng)對(duì)硝苯胺紅，常溫下呈固態(tài)，密度1.50g/cm3,熔點(diǎn)248-252。是一種常用的紅色顏料，屬于重氮系列化工合成染色劑，主

3、要應(yīng)用于機(jī)油，蠟，油彩，汽油等工業(yè)產(chǎn)品。2.化學(xué)性質(zhì) 它和引發(fā)英國(guó)有史以來(lái)最大一起食品召回行動(dòng)的“蘇丹紅”染料相似，都是工業(yè)上使用的化學(xué)物質(zhì)，都被禁止在食品染色劑中使用。據(jù)牛津大學(xué)物理與理論化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的化學(xué)品安全信息介紹，“對(duì)位紅”對(duì)眼睛、皮膚和呼吸系統(tǒng)有刺激性，但其毒性尚在研究中，沒(méi)有明確的結(jié)論。第4頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二二、對(duì)位紅檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法一、液相色譜法 1.高效液相色譜法 2.凝膠凈化液相色譜法 3.反相高效液相色潽法二、分光光度法-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)第5頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二二、檢測(cè)方法1、1 高效液相色譜法實(shí)

4、驗(yàn)室操作方案儀器：天美液相色譜儀、超聲清洗器、無(wú)油真空泵及溶劑過(guò)濾裝置、濾膜過(guò)濾器、平頭微量進(jìn)樣器試劑：乙腈（色譜純）、冰醋酸。色譜條件： 色譜柱選用C18柱（柱長(zhǎng)15cm）；柱溫： 30；進(jìn)樣量： 20 L；樣品運(yùn)行時(shí)間： 15 min； VWD 波長(zhǎng)選用485 nm，作為對(duì)位紅的檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相為乙腈:水/ 90:10，不需要緩沖第6頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二 步驟：（1）取乙腈400ml，用0.45um的有機(jī)濾膜過(guò)濾后置于原瓶。取16ml冰醋酸溶于100ml蒸餾水中，用0.45um的水相濾膜過(guò)濾后置于乙腈瓶中，貼上標(biāo)簽。超聲波清洗器脫氣15min。將配置好的

5、流動(dòng)相置于色譜儀旁的籃筐內(nèi)，放入流動(dòng)相吸液管。（2）準(zhǔn)確稱(chēng)取1-（4-硝基苯基偶氮）-2-萘酚10mg，用經(jīng)過(guò)濾及脫氣后的乙腈定容至100ml，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，濃度為100ug/ml。分別吸取該儲(chǔ)備液0.10、0.20、0.40、0.80、1.00ml置于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即配成對(duì)位紅濃度分別為0.10、0.20、0.40、0.80、1.00ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液第7頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二（3）準(zhǔn)確稱(chēng)取對(duì)位紅樣品10.0mg，用經(jīng)過(guò)濾及脫氣后的乙腈定容至100ml，從中取1ml再用乙腈稀釋至100ml。（4）打開(kāi)液相色譜儀電源開(kāi)關(guān)，開(kāi)高壓輸液

6、泵開(kāi)關(guān)。設(shè)定流動(dòng)相A通道流量為100%，設(shè)流動(dòng)相流速為1ml/min。（5）啟動(dòng)泵開(kāi)關(guān)，打開(kāi)紫外檢測(cè)器電源開(kāi)關(guān)。設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為480nm（6）打開(kāi)液相色譜工作站，選擇通道。（7）觀察基線(xiàn)狀態(tài)，當(dāng)基線(xiàn)走直后，即可進(jìn)樣。（8）開(kāi)始進(jìn)樣：平頭微量注射器用乙腈清洗5次，廢液排到濾紙上。將進(jìn)樣閥柄置于“l(fā)oad”位置。第8頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二（9）在注射器中吸入標(biāo)樣或試樣60ul，注入進(jìn)樣口，重復(fù)3次，此時(shí)對(duì)定量管進(jìn)行了清洗。（10）吸入標(biāo)樣60ul。將標(biāo)樣注入進(jìn)樣口，順時(shí)針旋動(dòng)進(jìn)樣閥至“inject”位置。此時(shí)工作站開(kāi)始自動(dòng)計(jì)時(shí)。（11）數(shù)據(jù)采集：從計(jì)算機(jī)顯示屏上可

7、以看到樣品的流出過(guò)程和分離狀況，待所有的色譜峰流出完畢后，按“stop“鍵停止分析。記錄保留時(shí)間及色譜峰面積。（12）結(jié)束工作：所有樣品分析完畢后，讓流動(dòng)相繼續(xù)流動(dòng)1020min。關(guān)閉色譜工作站、關(guān)閉檢測(cè)器電源、關(guān)閉液相色譜儀電源開(kāi)關(guān)。第9頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二數(shù)據(jù)處理：（1）繪制工作曲線(xiàn)：以對(duì)位紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(xiàn)（2）從曲線(xiàn)上直接查的未知試樣對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。數(shù)據(jù)處理：保留時(shí)間：4.521峰高：210123峰面積：221456第10頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二1.2凝膠凈化液相色譜法優(yōu)點(diǎn)：操作

8、簡(jiǎn)單，填充完凝膠柱后可重復(fù)使用，實(shí)際用量少于歐盟及國(guó)標(biāo)方法，并且用淋洗液替代劇毒而又昂貴的乙腈進(jìn)行提取，自制凝膠柱凈化富集避免了歐盟方法用乙腈直接萃取進(jìn)樣對(duì)色譜柱壽命的影響及雜質(zhì)峰的干擾，也避免了國(guó)標(biāo)方法中采用氧化鋁柱凈化活度難以控制的麻煩，一次進(jìn)樣可同時(shí)檢測(cè)食品中對(duì)位紅、蘇丹紅的含量應(yīng)用范圍：食品及調(diào)味品中對(duì)位紅、蘇丹紅的檢測(cè)儀器及試劑：Agilent 1100 高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器)層析柱 1. 6 cm 50 cm ,填充Bio2Beads S2X3凝膠。蘇丹紅、及對(duì)位紅標(biāo)準(zhǔn)品,純度均大于95 % ,配制時(shí)用少量三氯甲烷溶解,乙腈定容為0. 500 0

9、g L - 1 儲(chǔ)備液(按實(shí)際含量折算) ,使用時(shí)用乙腈稀釋至所需濃度。第11頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二色譜條件色譜柱Zorbax SB2C18 ( 4. 6 mm 250 mm ,5m) ;流動(dòng)相:乙腈(A) + 酸性水溶液(用乙酸調(diào)至約p H 4. 0) ; 洗脫程序: 0 9 min A 90 %; 9 12 min ;A 線(xiàn)性變化到100 % ,保持5 min 后回到初始比例;流速1. 0 mL min - 1 ;柱溫35 ;進(jìn)樣量20L ;二極管陳列檢測(cè)器,程序可變波長(zhǎng)見(jiàn)表1 。第12頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二1.3反相高效

10、液相色潽法簡(jiǎn)介：在推薦參考方法的基礎(chǔ)上,對(duì)分離和色譜條件加以改進(jìn)、優(yōu)化、選擇,用于幾種含對(duì)位紅食品采用擬定的方案進(jìn)行分離檢測(cè)。結(jié)果:方法的檢出限為011g/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)( r) 019999,在014-116g/ml添加水平間,加標(biāo)的回收率95% 105% , RSD 019% 911%。改進(jìn)的方法準(zhǔn)確可靠,檢測(cè)效率高,具有實(shí)際應(yīng)用意義。應(yīng)用：測(cè)定食品中對(duì)位紅的殘留量第13頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二儀器、試劑及色譜條件儀器設(shè)備Waters 2695 型高效液相色譜儀。Waters、996型二極管陣列紫外檢測(cè)器。MilliQ p lus型超純水器,美

11、國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。超聲波清洗器。試劑對(duì)位紅標(biāo)準(zhǔn)品(95% ,Acros Organics, USA) ;乙腈(分析純和色譜純) 。色譜條件色譜柱,MERCK L ichrocart 250 - 4 L ichrospher100 RP -18, 4 250 mm, 5m; 流動(dòng)相: 水+乙腈( 5 + 95 ) ; 流速:110 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng): 485 nm;進(jìn)樣量: 10l。第14頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二2.1 .分光光度法-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)應(yīng)用范圍：1.檢定物質(zhì) 根據(jù)吸收光譜圖上的一些特征吸收，特別是最大吸收波長(zhǎng)雖ax和摩爾吸收系數(shù)是

12、檢定物質(zhì)的常用物理參數(shù)。這在藥物分析上就有著很廣泛的應(yīng)用。在國(guó)內(nèi)外的藥典中，已將眾多的藥物紫外吸收光譜的最大吸收波長(zhǎng)和吸收系數(shù)載入其中，為藥物分析提供了很好的手段。 2.與標(biāo)準(zhǔn)物及標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照 將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測(cè)定紫外可見(jiàn)吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)完全一致。如果沒(méi)有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo) 準(zhǔn)譜圖對(duì)照進(jìn)行比較。這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測(cè)定條件要相同。 3.比較最大吸收波長(zhǎng)吸收系數(shù)的一致性 4.純度檢驗(yàn) 5.推測(cè)化合物的分子結(jié)構(gòu) 6.氫鍵強(qiáng)度的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強(qiáng)度也不同，這可以利用紫外光譜來(lái)判斷化合

13、物在不 同溶劑中氫鍵強(qiáng)度，以確定選擇哪一種溶劑 。 7.絡(luò)合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定 8.反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究9.在有機(jī)分析中的應(yīng)用 第15頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二簡(jiǎn)介 在分光光度計(jì)中，將不同波長(zhǎng)的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí)，便可得到與眾不同波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的吸收強(qiáng)度。如以波長(zhǎng)（）為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線(xiàn)。利用該曲線(xiàn)進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱(chēng)為分光光度法，也稱(chēng)為吸收光譜法。用紫外光源測(cè)定無(wú)色物質(zhì)的方法，稱(chēng)為紫外分光光度法。第16頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二三、對(duì)位紅檢測(cè)方案的確定結(jié)論：選用高效液相色譜法理由：對(duì)位紅的熔點(diǎn)為248-252度，很難汽化，明顯不能用氣相色譜法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。 以高效液相色譜法的檢測(cè)為基礎(chǔ)的方法成本相對(duì)較低，且應(yīng)用廣泛。 根據(jù)學(xué)校實(shí)驗(yàn)室器材選擇的要求可知，選用高效液相色譜法滿(mǎn)足要求。第17頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)31分，星期二測(cè)定所需儀器：UV7504型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，比色皿，材料與試劑：對(duì)位紅標(biāo)準(zhǔn)品，乙醇，對(duì)位紅樣品。操作步驟：1、對(duì)位紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制