1、第四章 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)通論二、肽三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能五、肽與蛋白質(zhì)的人工合成2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省一、蛋白質(zhì)通論蛋白質(zhì)(Protein)是生物體的基本組成成份。在人體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量很多，約占人體固體成分的45%，它的分布很廣，幾乎所有的器官組織都含蛋白質(zhì)，并且它又與所有的生命活動密切聯(lián)系。 機體新陳代謝過程中的一系列化學反應(yīng)幾乎都依賴于生物催化劑酶的作用，而酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)；調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝的激素有許多也是蛋白質(zhì)或它的衍生物；其它諸如肌肉的收縮，血液的凝固，免疫功能，組織修復(fù)以及生長、繁殖等主要功能無一不與蛋白質(zhì)

2、相關(guān)。近代分子生物學的研究表明，蛋白質(zhì)在遺傳信息的控制、細胞膜的通透性、神經(jīng)沖動的發(fā)生和傳導(dǎo)以及高等動物的記憶等方面都起著重要的作用。 2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄒ唬┑鞍踪|(zhì)的化學組成和分類單純蛋白質(zhì)的元素組成為C 5055%、H 6%7%、O 19%24%、N 13%19%，除此之外還有S 04%。有的蛋白質(zhì)含有P、I。少數(shù)含F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn、Co、Mo等金屬元素。 各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16%。由于體內(nèi)組織的主要含氮物是蛋白質(zhì)，因此，只要測定生物樣品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白質(zhì)大致含量： 蛋白質(zhì)含量蛋白氮6.25 （凱氏(Kjedah

3、l)定氮法的計算基礎(chǔ)）2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省單純蛋白質(zhì)（simple protein)：僅由氨基酸組成，不含其它化學成分。綴合蛋白質(zhì)(conjugated protein)：除含有氨基酸外的各種化學成分作為其結(jié)構(gòu)的一部分。非蛋白質(zhì)部分稱為輔基(prosthetic group)或配體(ligand)。 單純蛋白質(zhì) （按溶解度分類）清蛋白球蛋白谷蛋白谷醇溶蛋白組蛋白魚精蛋白硬蛋白 綴合蛋白質(zhì) （按非氨基酸 成分分類）糖蛋白脂蛋白核蛋白磷蛋白金屬蛋白血紅素蛋白黃素蛋白組成2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省單純蛋白質(zhì)分類2005-12-14

4、臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省 蛋白質(zhì)（按生物學功能分類）酶調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)運蛋白貯存蛋白收縮和游動蛋白結(jié)構(gòu)蛋白支架蛋白保護和開發(fā)蛋白異常蛋白2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ǘ┑鞍踪|(zhì)的形狀和大小形狀纖維狀球狀膜蛋白球狀蛋白質(zhì)globular protein 分子對稱性佳，外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。 Eg.血紅蛋白、血清球蛋白。纖維狀蛋白質(zhì)fibrous protein 對稱性差，分子類似纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)肌球蛋白。和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)膠原、彈性蛋白 膜蛋白質(zhì)membrane protein細胞的各

5、種膜系統(tǒng)結(jié)合而存在，與膜內(nèi)的非極性相相互作用，疏水側(cè)鏈伸向外側(cè)，親水氨基酸殘基較胞質(zhì)少。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省蛋白質(zhì)分子量的上下限是人為規(guī)定的，因為這決定于蛋白質(zhì)和分子量概念的定義。有些寡聚蛋白質(zhì)的分子量可高達數(shù)百萬甚至數(shù)千萬。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄈ┑鞍踪|(zhì)構(gòu)象和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次一級結(jié)構(gòu)(primary structure)：多肽鏈的氨基酸序列。二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)：多肽鏈中主鏈原子的局部空間排布即構(gòu)象，不涉及側(cè)鏈部分的構(gòu)象。三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)：蛋白質(zhì)的多

6、肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進一步盤曲或折迭形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)(quarternary structure)：具有二條或二條以上獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，其多肽鏈間通過次級鍵相互組合而形成的空間結(jié)構(gòu)。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省四、蛋白質(zhì)功能的多樣性 蛋白質(zhì)的序列異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和物種特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的生物學功能：1.催化；2.調(diào)節(jié)；3.轉(zhuǎn)運；4.貯存；5.運動；6.結(jié)構(gòu)成分；7.支架作用；8.防御與進攻；9.異常功能； 蛋白質(zhì)（protein）是生活細胞

7、內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動和生命過程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學最基本的命題。 生物體最主要的特征是生命活動，而蛋白質(zhì)是生命活動的體現(xiàn)者，具有以下主要功能：2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省二、肽肽是氨基酸的線性聚合物，常稱多肽鏈（peptide chain）。蛋白質(zhì)是由一條或多條具有確定的氨基酸序列的多肽鏈構(gòu)成的大分子。（一）肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中氨基酸連接的基本方式是肽鍵。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省肽鍵肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用。組成肽鍵的原子處于同

8、一平面。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省由于羰基碳-氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結(jié)構(gòu)（resonance structure），碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質(zhì)，由CO-NH構(gòu)成的肽單元呈現(xiàn)相對的剛性和平面化，肽鍵中的4個原子和它相鄰的兩個-碳原子多處于同一個平面上。多肽鏈可以看成由C串聯(lián)起來的無數(shù)個酰胺平面組成2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省肽鍵肽鍵中的C-N鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。在大多數(shù)情況下，以反式結(jié)構(gòu)存在。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省肽基的C、O和N原子間的共振相互作用共振產(chǎn)生的重要結(jié)果：限制繞肽

9、鍵的自由旋轉(zhuǎn) 形成酰胺平面 產(chǎn)生鍵的平均化 肽鍵呈反式構(gòu)型sp2sp2sp2sp3共振雜化體2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ǘ╇牡奈锢砗突瘜W性質(zhì)短肽的晶體是離子品格，在水溶液中以偶極離子存在。在pH0-14范圍內(nèi)，肽鍵中的亞氨基不能解離。小肽的滴定曲線和氨基酸的滴定曲線很相似。肽的化學反應(yīng)也和氨基酸一樣，游離的氨基、羧基和R基可以發(fā)生與氨基酸中相應(yīng)的基團類似的反反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應(yīng)。一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和，但較長的肽或蛋白質(zhì)的旋光度則不能這樣簡單相加。2005-12-14臺州學院生命

10、科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄈ┨烊淮嬖诘幕钚噪纳矬w內(nèi)游離存在著很多活性肽，具有各種特殊的生物學功能。激素：腦啡肽、催產(chǎn)素、加壓素、舒緩激肽抗生素：短桿菌肽、多粘菌素E、放線菌素D蕈的劇毒毒素：鵝膏蕈堿還原型谷胱甘肽鵝肌肽、肌肽天然肽中含有蛋白質(zhì)中不存在的-肽鍵、丙氨酸和D型氨基酸。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省牛催產(chǎn)素 牛加壓素2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省環(huán)狀八肽鵝膏蕈屬中的劇毒毒素2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中的氨基酸序列。（一）蛋白質(zhì)測序的策略 (1)

11、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 (2)拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。 (3)測定多肽鏈的氨基酸組成。 (4)分析多肽鏈的N末端和C末端殘基。 (5)斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。 (6)多肽鏈斷裂成肽段。 (7)測定各個肽段的氨基酸順序。 (8)確定肽段在多肽鏈中的次序。 (9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省將肽段順序進行疊聯(lián)以確定完整的順序 將肽段分離并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)順序測定基本方法路線2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ǘ㎞

12、-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定1.N-末端分析（1）DNFB法；（2）DNS法（3）PITC法（4）氨肽酶法2.C-末端分析（1）肼解法；（2）還原法（3）羧肽酶法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省Sanger法。2,4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進行鑒定。N 末端基氨基酸測定二硝基氟苯（DNFB）法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端

13、氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質(zhì)，檢測靈敏度可以達到110-9mol。N 末端基氨基酸測定丹磺酰氯法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端的肽鍵速度最大。N 末端基氨基酸測定氨肽酶(amino peptidases)法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省此法是

14、多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。C 末端基氨基酸測定肼解法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省此法是多肽鏈C-末端氨基酸分析法。多肽與LiBH4在無水條件下加熱，C-端氨基酸被還原為醇即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則不變。醇很容易與其余氨基酸分離。C 末端基氨基酸測定LiBH4法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個的水解AA。根據(jù)不同的反應(yīng)時間測出酶水解所釋放出的氨

15、基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C-末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。C 末端基氨基酸測定羧肽酶(carboxypeptidase)法2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄈ┒驑虻臄嗔褦嗔讯驑虻闹饕椒ㄊ沁^甲酸氧化法和巰基化合物還原法。ssHCOOOHSO3HSO3H2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省SSSSSS胰島素HO-CH2-CH2-SHSHSHSHSHSHS

16、HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HSCH2C00HICH2COOH2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省作用：這些反應(yīng)可用于巰基的保護。巰基（-SH）的保護2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省還可用碘乙酸ICH2COO- 保護，在多肽鏈中引入負電荷。亦可用碘乙酰胺ICH2CONH2 保護。如用乙撐亞胺保護巰基，生成氨乙基半胱氨酸AECys，在肽鏈中引入胰蛋白酶的酶切位點。巰基（-SH）的保護2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省（四）氨基酸組成的分析用于蛋白的氨基酸組成測定的水解方法主

17、要是酸水解，同時輔以堿水解。氨基酸分析儀圖譜2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省酸水解常用6 mol/L的鹽酸或4 mol/L的硫酸在105-110條件下進行水解，反應(yīng)時間約20小時。此法的優(yōu)點是不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈的酰胺基被水解成了羧基。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省堿水解一般用5 mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產(chǎn)率不高。部分的水解產(chǎn)物發(fā)生消旋化。主要用來測定色氨酸含量2005-12

18、-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄎ澹┒嚯逆湹牟糠至呀夂碗亩位旌衔锏姆蛛x純化1.酶裂解法目前用于蛋白質(zhì)肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。如：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶應(yīng)用酶水解多肽，不會破壞氨基酸，也不會發(fā)生消旋化，色氨酸在水解中也不受破壞。水解的產(chǎn)物為較小的肽段。 最常見的蛋白水解酶有以下幾種：2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省胰蛋白酶(trypsin) 這是最常用的蛋白水解酶，專一性強，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。得到的是以Arg或Lys

19、為C-末端殘基的肽段，肽段數(shù)目等于多肽鏈中Arg和Lys總數(shù)加1。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省為了減少胰蛋白酶的作用位點，可以通過化學修飾將其側(cè)鏈基因保護起來。用馬來酸酐可以保護Lys殘基側(cè)鏈上的NH2，胰蛋白酶就不會水解Lys竣基參與形成的肽鍵，只能斷裂Arg羧基所形成的肽鍵；反之，如果用1，2環(huán)己二酮修飾Arg的胍基，則胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽鍵。如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點，可以用丫丙啶處理多肽鏈樣品，這時Cys殘基側(cè)鏈被修飾成類似Lys的側(cè)鏈，也具有NH2。這樣胰蛋白酶便能斷裂Cys羧基端的肽鍵。R1=Lys和Arg側(cè)鏈（專一性較強，水解

20、速度快）。R2=Pro 水解受抑。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它斷裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團是堿性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力將減弱。肽鏈水解位點R1=Phe, Trp,Tyr時水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro 水解受抑。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省肽鏈水解位點胃蛋白酶(pepsin) 它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外與糜蛋白酶不同的是酶作用

21、的最適pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，因此確定二硫鍵位置時，常用胃蛋白酶來水解。R1和R2Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快。R1=Pro 水解受抑。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省肽鏈水解位點嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）:常用于斷裂較短的多肽鏈。R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性強的氨基酸水解速度較快。R2=Pro或Gly 水解受抑。R1或R3=Pro 水解受抑。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省葡萄球菌蛋白酶（Staphyl

22、ococcal protease) 當裂解在磷酸緩沖液(pH7.8)中進行的，它能在Glu殘基和Asp殘基的羧基側(cè)斷裂肽鍵。如果改用碳酸氫銨緩沖液(pH7.8)或醋酸銨緩沖液(pH4.0)時，則只能斷裂Glu殘基的羧基側(cè)肽鍵。梭菌蛋白酶（clostripain） 專門裂解Arg殘基的羧基所形成的肽鍵。即使在6mol/L尿素中20小時內(nèi)仍具活力，這樣對不溶性蛋白質(zhì)的長時間裂解將是很有效的。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省消化道內(nèi)幾種蛋白酶的專一性（Phe.Tyr.Trp）（Arg.Lys）（脂肪族）胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶彈性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶（Phe. Tr

23、p）2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2. 化學裂解法 溴化氰只斷裂由Met殘基的羧基參加形成的肽鍵。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省羥胺能專一性地斷裂Asn-Gly之間的肽鍵。但專一性不很強，如Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分裂解。肽段的分離提純 多肽鏈用上述方法斷裂后，所得的肽段混合物通常使用凝膠過濾、凝膠電泳、離子交換纖維素和離子交換萄聚糖柱層析、高效液相色譜、高效薄層層析等方法進行分離提純。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省1.Edman化學降解（六）肽段氨基酸序列的測定2005-12-14臺州學院生命科

24、學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2.酶降解法 蛋白水解酶中有一類是肽鏈外切酶或稱外肽酶（exopeptidases)，例如氨肽酶和羧肽酶，它們分別從肽鏈的N端和C端逐個地向里切。因此，原則上只要能跟隨酶水解的過程分別定量測出釋放的氨基酸，便能確定肽的順序。然而這種方法實際上有許多困難，局限性很大，它只能用來測定末端附近很少幾個殘基的順序。二肽氨肽酶可從肽鏈的N端開始，每隔二個切斷肽鍵，得到一系列二肽片段，利用部分重迭法，拼湊出整條肽鏈的氨基酸順序。 ab cd ef gh ij kl mn op qr st uv wx yz a bc de f

25、g hi jk lm no pq rs tu vw xy z abcdefghijklmnopqrstuvwxyz2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省4.根據(jù)核苷酸序列的推定法推定的依據(jù)是“中心法則”。推定法仍需與直接的氨基酸序列分析相配合，如果沒有必需的部分氨基酸序列分析，就不可能找到正確的密碼讀框。3.質(zhì)譜法質(zhì)譜法一次能測的氨基酸殘基一般10個左右，但質(zhì)譜法具有樣品用量少，分析速度快的優(yōu)點。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄆ撸╇亩卧诙嚯逆溨写涡虻臎Q定 示例(十肽的水解)A法水解得到四個小肽： A1 Ala-Phe A2 Gly-Lys-As

26、n-Tyr A3 Arg-Tyr A4 His-ValB法水解得到四個小肽： B1 Ala-Phe-Gly-Lys B2 Asn-Tyr-Arg B3 Tyr- His-Val重疊法： Ala-Phe-Gly-LysAsn-Tyr-ArgTyr-His-Val2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省（八）二硫橋位置的確定一般采用胃蛋白酶處理含有二硫鍵的多肽鏈(切點多；酸性環(huán)境下防止二硫鍵發(fā)生交換)。將所得的肽段利用Brown及Hartlay的對角線電泳技術(shù)進行分離。+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay對角線電泳圖解pH6.5圖中a、b兩個斑點是由一個二硫鍵斷裂產(chǎn)

27、生的肽段2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省對角線電泳對角線電泳2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ň牛┑鞍踪|(zhì)序列數(shù)據(jù)庫由于測定克隆基因的核苷酸序列比測定蛋白質(zhì)氨基酸的序列更快、更有效，現(xiàn)在大多數(shù)蛋白質(zhì)序列是從核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。要確定一個新序列，研究者所作的第一件事就是將它與數(shù)據(jù)庫中的其它已知的序列進行比較，確定其中是否存在同源性。2005-12-14臺州學院生命科學

28、與醫(yī)藥化工學院 柯世省四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化1.同源蛋白質(zhì)在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)稱為同源蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性稱為序列同源性。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省同源蛋白質(zhì)一般具有幾乎相同長度的多肽鏈，它們的氨基酸序列與那些提取它們的物種的親緣關(guān)系具有同一性。10/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省不同生物來源的細胞色素c中不變的AA殘基14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysG

29、lyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素細胞色素c分子的空間結(jié)構(gòu)不變的AA殘基 35個不變的AA殘基，是Cyt C 的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構(gòu)象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別”并結(jié)合細胞色素還原酶和氧化酶。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省不同種屬氨基酸殘基的差異數(shù)目分歧時間(百萬年)人-猴150-60人-馬1270-75人-狗1070-75豬-牛-羊0馬-牛360-65哺乳

30、類-雞10-15280哺乳類-猢17-21400脊椎動物-酵母43-481,100細胞色素C分子中氨基酸殘基的差異數(shù)目及分歧時間 2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省細胞色素c肽鏈中27個位置的氨基酸殘基對所有已測試的種屬都是相同的，表明這些殘基是規(guī)定細胞色素c的生物活性所必需。例如第14和第17位置上的Cys殘基可能保證與輔基血紅素連接的必要位置，第70到80位置上的不變肽段可能是細胞色素c與酶相結(jié)合的部分。肽鏈中的可變殘基可能是一些“填充”或間隔的區(qū)域，氨基酸的變換不影響蛋白質(zhì)的功能。在不同種屬來源的細胞色素c中，可以變換的氨基酸殘基數(shù)目與這些種屬在系統(tǒng)發(fā)生上的位置有

31、密切關(guān)系，即在進化位置上相距愈遠，則氨基酸順序之間的差別愈大。細胞色素c的氨基鼓順序分析資料已被用來核對各個物種之間的分類學關(guān)系，以及繪制進化樹(evolutionary tree)即系統(tǒng)發(fā)生樹(phylogenetic tree)。根據(jù)進化樹不僅可以研究從單細胞有機體到多細胞有機體的生物進化過程，而且可以粗略估計現(xiàn)存的各類種屬生物的分歧(divergence)時間。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省生物 與人不同的AA數(shù)目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、豬、羊、狗 11馬 12雞、火雞 13響尾蛇 14海龜 15金槍魚 21角餃 23小蠅 25蛾 31小麥 3

32、5粗早鏈孢霉 43酵母 44 不同生物與人的Cytc的AA差異數(shù)目根據(jù)細胞色素 C的順序種屬差異建立起來的進化樹圓圈代表進化中的分歧點，支干旁的數(shù)字是結(jié)定有機體譜系的細胞色素c與其祖先差異的殘基數(shù)2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省（二）同源蛋白質(zhì)具有共同的進化起源1.氧合血紅素蛋白肌紅蛋白、血紅蛋白鏈和鏈是珠蛋白，它們有很高的序列同源。這種同源關(guān)系表明隨機突變一級結(jié)構(gòu)方面氨基酸取代和分歧或趨異事件的進化順序。2.絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶顯示足夠的序列同源性，它們是經(jīng)過祖先絲氨酸蛋白酶基因的復(fù)制而來。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學

33、院 柯世省3.一些功能差異很大的蛋白質(zhì)溶菌酶和乳清蛋白的功能很少相似，但它們的三級結(jié)構(gòu)卻十分相似。根據(jù)它們的序列同源性可以推論出它們的進化關(guān)系具有共同的起源。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世?。ㄈ┭耗膛c氨基酸序列的局部斷裂在動物體內(nèi)的某些生物化學過程中，蛋白質(zhì)分子的部分肽鏈必須先按特定的方式斷裂，然后才呈現(xiàn)生物活性。蛋白質(zhì)分子的這一特性具有它的重要生物學意義。它是在生物進化過程中發(fā)展起來的，是蛋白質(zhì)分于的結(jié)構(gòu)與功能具有高度統(tǒng)一性的表現(xiàn)。1.血液凝固的生物化學原理血液凝固是一系列復(fù)雜的生物化學過程。這一過程的主要環(huán)節(jié)有二：一是血漿中的凝血酶原受到血漿和血小板中一些因

34、子的激活而形成凝血酶(thrombin)；二是血漿中的纖維蛋白原在凝血酶的激活下轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白(fibrin)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使血液變成凝膠。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省凝血酶原是一種糖蛋白。在凝血酶原致活物的催化下，凝血酶原分子中的二個肽鍵(Arg274-Thr275和Arg323-Ile324）發(fā)生斷裂，釋放出分子量力32000的氨基末端片段形成有活性的凝血酶。凝血酶由二條肽鏈通過一個二硫鍵交聯(lián)而成，一條肽鍵（A鏈)含49個殘基，另一條肽鍵含259個殘基。2005-12-14臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院 柯世省纖維蛋白原分子長46nm，分子量為340 000，屬纖維狀蛋白質(zhì)。每一分子含6條肽鏈，這6條肽鏈兩兩相同，分三種類，分別稱為鏈(含6