1、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)的研究方法顯微技術(shù) 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù) 細(xì)胞分離技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交一、顯微技術(shù) 顯微鏡是觀察細(xì)胞的主要工具。根據(jù)光源不同，可分為光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。 普通光學(xué)顯微鏡 光鏡樣本制作顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關(guān)。分辨率是指區(qū)分開兩個質(zhì)點間的最小距離熒光顯微鏡 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡可對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究。光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡。是目前在光鏡水平用于特異

2、蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位最有力的工具。 熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色） 藍(lán)色為細(xì)胞核綠色為微管 激光共聚焦掃描顯微鏡用激光作掃描光源，由于激光束的波長較短，光束很細(xì)，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學(xué)顯微鏡的3倍。 調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機(jī)內(nèi)，通過計算機(jī)分析和模擬，就能顯示細(xì)胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。 暗視野顯微鏡照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。 微分干涉差顯微鏡（D

3、IC) 優(yōu)點是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進(jìn)行。 倒置顯微鏡 用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞 透射電子顯微鏡 1932年Ruska發(fā)明了以電子束為光源，用電磁場作透鏡的電子顯微鏡 。電子顯微鏡的放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬倍 透射電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 RER的形態(tài) 顯微操作/注射儀 免疫細(xì)胞化學(xué)根據(jù)免疫學(xué)原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進(jìn)行定位測定的技術(shù)。如果將抗體結(jié)合上標(biāo)記物，再與組織中的抗原發(fā)生反應(yīng)，即可在光鏡或電鏡下顯示出該抗原存在于組織中的部位。

4、常用的標(biāo)記物有熒光素和酶。熒光素標(biāo)記的稱為免疫熒光法酶標(biāo)記的稱為酶標(biāo)免疫法顯微光譜分析技術(shù)細(xì)胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。例如，核酸的吸收波長為260nm，而蛋白質(zhì)的則為280nm。根據(jù)細(xì)胞成分所具有的這種特性，可利用顯微分光光度計對某些成分進(jìn)行定位、定性，甚至定量測定 放射自顯影術(shù)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機(jī)理、作用部位等等。原理是將放射性同位素（如14C和3H）標(biāo)記的化合物導(dǎo)入生物體內(nèi)，將標(biāo)本制成切片或涂片，涂上鹵化銀乳膠，組織中的放射性即可使乳膠感光。顯示還原的黑色銀顆粒，即可

5、得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量。 分子雜交技術(shù)具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術(shù)可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補(bǔ)關(guān)系。 Southern blotPCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用于在體外將微量的目標(biāo)DNA大量擴(kuò)增，以便進(jìn)行分析。 PCR Cycle：STEPSDenaturation: DNA strandsseparate.94oCAnnealing: Primers bind toDNA.65-40oCExten

6、sion: New DNA issynthesized.72oC人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交 最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標(biāo)記的抗體所識別，從而顯示出位置。 離心技術(shù)差速離心 在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。 速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀 用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份 A等速度沉降，B等密度沉降 離心技術(shù)密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)

7、胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。 用于精細(xì)組分或生物大分子的分離。流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計。 細(xì)胞電泳在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動的現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳

8、。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為電位。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞電荷量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同，因此可用來分離不同種類的細(xì)胞。在恒定的電場條件下，同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定，因而可通過測定電泳速度來推算出細(xì)胞的電位。電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異，因此在診斷疾病上有一定價值。四、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞雜交 細(xì)胞培養(yǎng) 選用最佳生存條件對活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù) 。細(xì)胞融合通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交 。動物細(xì)胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右） 基本原理1、細(xì)胞融合的概念：在自然條件下或用人工方法使兩個或兩個以上的細(xì)胞合并

9、成一個細(xì)胞的過程。2、人工誘導(dǎo)方法：應(yīng)用最廣泛的是聚乙二醇3、可能的作用機(jī)制：聚乙二醇可引起細(xì)胞膜中的磷脂的酰鍵及極性基團(tuán)兩者在結(jié)構(gòu)上發(fā)生重排。植物細(xì)胞培養(yǎng) 1、組織培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，如果條件適宜，可培養(yǎng)出再生植株。2、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：適合于進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。3、原生質(zhì)體培養(yǎng)：脫壁后的植物細(xì)胞稱為原生質(zhì)體。4、單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株，經(jīng)人為加倍后可得到完全純合的個體。 正常淋巴細(xì)胞具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。于是英國人Kohler和Milstein 1975將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。JEM-1011透射電子顯微鏡JEOL掃描電子顯微鏡圖2-3 熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍(lán)色）圖片來自/ 激光共聚焦掃描顯微鏡A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal epithelium seen with different types of LM.a)under bright-field;b)phase-contrast;