1、分子診斷在感染性疾病中的應(yīng)用 袁艷軍感染的慨念 感染是病原體在宿主的個(gè)體內(nèi)進(jìn)行有害的復(fù)制、繁殖過(guò)程 . 病原體:細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體、螺旋體、寄生蟲 條件致病菌微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體的DNA/RNA）：判斷有無(wú)感染是何種病原體感染常用方法：PCR 分子探針雜交完整性策略檢出病原體分型（分類）亞型耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測(cè)序分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用主要包括對(duì)病原生物進(jìn)行鑒定、分型、耐藥診斷和治療過(guò)程中的療效監(jiān)測(cè)等動(dòng)態(tài)、定量地檢測(cè)病原體核

2、酸，能對(duì)療效判斷和病情預(yù)后評(píng)價(jià)提供客觀的依據(jù)目前已經(jīng)應(yīng)用于一些重要的感染性疾病，如結(jié)核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等感染性疾病的分子診斷臨床價(jià)值一、感染性疾病的診斷和治療監(jiān)測(cè)（一）結(jié)核分枝桿菌（二）肝炎病毒（三）人類免疫缺陷病毒（五）SARS冠狀病毒（四）HPV病毒生物學(xué)主要特點(diǎn)：1.結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽腫3.抗酸染色陽(yáng)性結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)實(shí)驗(yàn)室診斷現(xiàn)狀現(xiàn)代分子生物學(xué)快速診斷基因結(jié)構(gòu)分子診斷共價(jià)封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu) 標(biāo)準(zhǔn)株結(jié)核分枝桿菌 基因組全長(zhǎng)4.4kb,包含4000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和50個(gè)RNA編碼基因 基因組特點(diǎn)

3、MDR早期診斷分枝桿菌分子診斷系統(tǒng)菌種鑒定篩查、鑒別診斷 實(shí)時(shí)熒光PCR 基因芯片快速檢測(cè)平臺(tái) 高 效： 同時(shí)檢測(cè) 17 種分枝桿菌（包括TB）快 速：4周（菌種鑒定） 6 小時(shí)靈 敏： 103 個(gè)菌/反應(yīng)檢測(cè)范圍：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜-膿腫、草、不產(chǎn)色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍、恥垢。14分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）通 量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥（MDR）速 度：8周（藥敏） 6 小時(shí)靈敏度：103 個(gè)菌/反應(yīng)基于rpoB（利福平）和katG/inhA（異煙肼）的基因突變，對(duì)耐多藥結(jié)核病做出快速診斷。15結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒乙型肝炎病毒（h

4、epatitis B virus, HBV）全世界有3.5億慢性攜帶者，75%在亞太地區(qū)每年有一百萬(wàn)人死于HBV感染，是全球范圍內(nèi)第9位死因中國(guó)：50%70%的人受過(guò)感染，8%10%是HBV攜帶者 世界其它地區(qū)亞太地區(qū)75%75%的長(zhǎng)期慢性攜帶者來(lái)自亞太地區(qū)HBV的形態(tài)特征 DNA 病毒 雙鏈（非環(huán)狀） DNA不等長(zhǎng) 正鏈（2/3） 負(fù)鏈 最常見的血清型為adw、adr和ayw 亞型的地區(qū)分布不同，我國(guó)以adr為主，adw次之，而ayw見于新疆、西藏和內(nèi)蒙古等地 HBV基因組結(jié)構(gòu) pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBc

5、Ag P DNAP X HBxAg編碼HBsAgpre-S2pre-S1S區(qū) C區(qū) P區(qū) X區(qū) 基因重疊急性感染時(shí)期HBV的標(biāo)志物HBV 檢測(cè)窗口期血清學(xué)（HBsAg）：56天PCR：33天縮短23天（平均6-15天）HBV分子診斷方法擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小(bp)P、X基因特異片段5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-32785-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3基因特異片段5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-34775-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3基因特異片段5-GCTTTGGGGCATGGACATTGA

6、CCCCTATAA-32585-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3HBV -DNA檢測(cè)（PCR）PCR 引物是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來(lái)設(shè)計(jì)。部分常用的引物序列1樣本處理（樣本處理區(qū)）2核酸擴(kuò)增2. 1 試劑配置（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）2. 2 加樣（樣本處理區(qū)）2. 3 PCR擴(kuò)增（檢測(cè)區(qū)）HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）試劑制備標(biāo)本處理擴(kuò)增檢測(cè)xxx支鏈DNA（bDNA）技術(shù) 一種核酸探針雜交標(biāo)志信號(hào)放大技術(shù) 。 優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單， 將待測(cè)病

7、毒裂解釋放核酸后變性為單鏈，即 可進(jìn)行檢測(cè) 。 缺點(diǎn)：敏感性較低、檢測(cè)范圍窄而不適用于低水平病 毒的檢測(cè) 。還可以用于乙肝病毒基因檢查的方法主要有：熒光PCR法、競(jìng)爭(zhēng)PCR法、PCR酶聯(lián)免疫吸附法、熒光標(biāo)記物法和PCR酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光等方法。 HBV耐藥突變類型及其核苷酸、氨基酸變化 46.91 54.64 50.74丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷1. 流行病學(xué)史：有輸血史、應(yīng)用血液制品史或明確的HCV暴露史。2. 臨床表現(xiàn)：全身乏力、食欲減退、惡心和肝區(qū)疼痛等，其他可有低熱，輕度肝腫大，脾腫大，黃疸。部分患者無(wú)明顯癥狀。3. 實(shí)驗(yàn)室檢查：ALT多呈輕度和中度升高，抗-HCV和HCV R

8、NA陽(yáng)性。約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無(wú)輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致 HCV血中HCV含量?jī)H為HBV的千分之一HCV的細(xì)胞培養(yǎng)尚未成功，病毒的分離極為困難HCV的變異性很高，使其診斷十分困難HCV的免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗HCV一項(xiàng)，且由感染至抗體產(chǎn)生大約需要70天，部分病人感染后始終都不形成抗體HCV分子診斷技術(shù)尤為重要HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒直徑約50nm有一脂質(zhì)包膜核心：?jiǎn)喂烧淩NA，全長(zhǎng)9.4 kb僅一個(gè)開放讀框（ORF），編碼一條含有3008 3037個(gè)氨基酸的病毒前體多肽 HCV基因分型的多樣性由于HCV的RNA聚合酶的忠實(shí)性不高，所以引起HC

9、V的基因型呈多樣性HCV分為6個(gè)主要基因型（Simmonds）， HCV亞型已超過(guò)50個(gè).HCV RNA基因分型有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個(gè)體化方案.HCV分子診斷HCV-RNA定性試驗(yàn)?zāi)孓D(zhuǎn)錄PCR 有許多因素影響著PCR方法，如標(biāo)本處理及儲(chǔ)存形式，引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增倍數(shù)、反應(yīng)條件、DNA產(chǎn)物的污染、擴(kuò)增后產(chǎn)物檢測(cè)系統(tǒng)等 嚴(yán)格的質(zhì)控、操作人員的熟練程度尤為重要 HCV RNA定性檢測(cè)的特異度在98%以上，只要一次病毒定性檢測(cè)為陽(yáng)性即可確證HCV感染一次檢測(cè)陰性不能完全排除HCV感染，應(yīng)重復(fù)檢查 HCV-RNA定量試驗(yàn) 估價(jià)血清中HCV-RNA水平 反映感染機(jī)體的病毒復(fù)制率及清除率

10、在未治療的慢性丙肝機(jī)體內(nèi)病毒負(fù)荷相對(duì)穩(wěn)定 目前有二種方法可定量HCV-RNA水平 -靶擴(kuò)增技術(shù)如定量PCR方法 -信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)如支鏈DNA法 HCV RNA定量（real-time RT-PCR）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果為陰性強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)小于等于30.0臨界陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)大于強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照的Ct值否則此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效結(jié)果判斷Ct值無(wú)數(shù)值的樣本為陰性樣本Ct值36.0的樣本為陽(yáng)性Ct值大于36.0的樣本建議重做，重做結(jié)果無(wú)數(shù)值者為陰性，否則為陽(yáng)性HCV RNA定量結(jié)果表示方法HCV RNA定量檢測(cè)法有兩種表示方法：拷貝/ml（羅氏公司Cobas V2.0）IU/ml（美國(guó)國(guó)立遺傳學(xué)研究

11、所的SuperQuant）兩者之間可以進(jìn)行換算，IU/ml與拷貝數(shù)/ml換算公式是：IU/ml=0.854拷貝數(shù)/ml + 0.538特別說(shuō)明應(yīng)注意HCV RNA檢測(cè)中的假陽(yáng)性和假陰性在HCV急性感染期，在血漿或血清中的病毒基因組水平可達(dá)到105107拷貝/ml在慢性感染者中，HCV RNA水平變化范圍在51045106拷貝/ml之間，同一患者血液中HCV RNA的水平相對(duì)穩(wěn)定HCV病毒載量的高低與疾病的嚴(yán)重程度和疾病的進(jìn)展并無(wú)絕對(duì)相關(guān)性，但可以作為抗病毒治療療效評(píng)估的觀察指標(biāo)（“評(píng)估”和“預(yù)測(cè)”） HCV基因型測(cè)定 檢測(cè)基因型方法一般分為二類 ： 檢測(cè)HCV基因的點(diǎn)突變的篩選試驗(yàn) 評(píng)估HCV

12、基因更大片段的驗(yàn)證性試驗(yàn) HCV基因型的篩選試驗(yàn)有 ： (1)對(duì)HCV高度保守的5-NC區(qū)域行限制性片段長(zhǎng)度多 型性分析（RFLP） (2)對(duì)HCV-5NC區(qū)域行逆轉(zhuǎn)錄斑點(diǎn)雜交分析，又名 LIPA方法 (3)用型特異的引物對(duì)HCV核心基因巢式PCR。 (4)病毒蛋白抗原性分型 評(píng)估HCV基因更大片段的驗(yàn)證性試驗(yàn)-序列分析 人類免疫缺陷病毒（ HIV ）全國(guó)累計(jì)報(bào)告HIV感染者地理分布1-100101-500501-10001001-50005001-1000010000HIV感染者數(shù)截至2005年12月底HIV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制Step 1: BindingStep 2: Reverse Tr

13、anscriptionStep 3: IntegrationStep 4: ReplicationStep 5: TranslationStep 6: Viral Assembly靶細(xì)胞：CD4+ T 細(xì)胞HIV基因組基因組為RNA雙分子，與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同其正鏈RNA分子大小為 HIV-1 9.3 kb 有3 組共8個(gè)基因 HIV-2 9.7 kb 有3 組共9個(gè)基因5端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)結(jié)構(gòu) HIV基因組第一組：逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復(fù)順序 gag（group of antigen)基因：編碼核心蛋白 pol （polymerase）基因：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，D

14、NA聚合酶 env（envelop）基因：編碼包膜蛋白LTRs：不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達(dá)，無(wú)種屬特異性第二組：參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因 tat（trans-acting transcriptional gene） rev（regulator of expression of viral protein） nef（negative regulator factor）第三組：負(fù)調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U） vpr（viral protein R）HIV基因組遺傳變異率高高度變異區(qū)

15、在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gp120的五個(gè)區(qū)段HIV疫苗研發(fā)難度大HIV-1感染后病毒標(biāo)志物的變化窗口期：檢測(cè)抗體 2-12周檢測(cè)p24抗原 2-3周 檢測(cè)RNA 11天HIV病毒載量（HIV RNA 定量）主要有三種技術(shù)：RT-PCR（最低檢測(cè)限為50copies/ml ）bDNA（最低檢測(cè)限為50copies/ml）NASBA（最低檢測(cè)限為20 copies/ml）NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）基于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 方法檢測(cè)范圍實(shí)驗(yàn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（lg）抗凝劑RT-PCR4102-5 0.15 0.33ACD/EDTAbDNA4102

16、-50.08 0.33EDTANASBA4102-50.13 0.33ACD/EDTA/HEP病毒基因組是雙鏈DNA.具有宿主和組織特異性：人是HPV惟一自然宿主傳播途徑：主要通過(guò)接觸感染經(jīng)性接觸傳播新生兒可經(jīng)產(chǎn)道感染不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同HPV的免疫防御機(jī)制尚不十分清楚HPV的致癌潛力分為高危型：主要包括HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52和58等（其中HPV 16和HPV 18與子宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)）低危型：主要包括HPV6和HPV11人乳頭狀瘤病毒（HPV）中國(guó)婦女人乳頭狀瘤病毒（HPV）感染和宮頸癌流行病學(xué)調(diào)查大規(guī)模的人群專項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)：我國(guó)城鄉(xiāng)

17、婦女高危型HPV感染率均較高，并在2024歲和4044歲兩個(gè)年齡段呈現(xiàn)感染高峰；以醫(yī)院為基礎(chǔ)、覆蓋7個(gè)地區(qū)的調(diào)查顯示：我國(guó)婦女83%的子宮頸浸潤(rùn)癌、84%的子宮頸鱗癌均有HPV 16型或18型引起；HPV 16型和18型是導(dǎo)致我國(guó)婦女患子宮頸癌的最主要原因HPVHPV檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室診斷分子生物學(xué)方法檢測(cè)HPV DNA在診斷同時(shí)確定型別：如斑點(diǎn)雜交、原位雜交，DNA印跡法（此法為最可靠的方法）以HPV基因型特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用特異性探針雜交法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物（此法特異、敏感、被廣泛采用）免疫印跡（Western blot）檢測(cè)病人血清中基因型特異性抗體SARS相關(guān)冠狀病毒2003年4月，香港研

18、究者Peiris等報(bào)告了50 例嚴(yán)重型急性呼吸道綜合征(serious acute respiratory syndrome, SARS) 病人的臨床表現(xiàn)和病毒學(xué)研究結(jié)果。一種新的冠狀病毒 (Coronavirus) 是SARS的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365)SARS冠狀病毒（SARS coronavirus）嚴(yán)重急性呼吸綜合癥（severe acute respiratory syndrome, SARS）SARS冠狀病毒（SARS CoV）是一種新的變種的冠狀病毒引起傳染性非典型肺炎，是一種急性呼吸系統(tǒng)感染疾病 SARA CoV基因組基因組為正鏈單鏈RNA

19、，全序列共約29KB有11個(gè)ORF，編碼：依賴于RNA的RNA聚合酶（rep）、4種結(jié)構(gòu)蛋白（S,E,M,N）、5種未知蛋白特點(diǎn)：RNA和RNA之間重組率非常高，重組改變了RNA序列，進(jìn)一步可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變，出現(xiàn)高變異spike proteinmembrane proteinsmall membrane proteinnucleocapsid proteinSARA CoV 檢測(cè)WHO推薦SARS-CoV特異性檢測(cè)方法：細(xì)胞分離培養(yǎng)：所需時(shí)間較長(zhǎng)，分離陽(yáng)性率不高 免疫學(xué)檢測(cè);難以在感染的窗口期對(duì)病毒感染進(jìn)行早期檢測(cè) 分子生物學(xué)檢測(cè)NASBA：反應(yīng)在42進(jìn)行，循環(huán)4到5次即可擴(kuò)增106倍，可以在2小時(shí)左右將模板RNA擴(kuò)增約109倍 RT-PCR、FQ-PCR：大約需要20次循環(huán)才能擴(kuò)增106倍。檢測(cè)標(biāo)本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺泡灌洗液 、 血漿、糞便。有報(bào)道顯示，在可能SARS病人中病毒的檢出 率為100%。在疑似SARS病人中的檢出率為23%。所有健康接觸者中未檢測(cè)到病毒。另一項(xiàng)研究顯示 檢測(cè)病毒的3種方法（血清學(xué)檢測(cè)、病毒分離、PCR技