簡(jiǎn)述基因的克隆和表達(dá)的步驟1）獲得目的基因和質(zhì)粒載體；2）形成重組質(zhì)粒；3）制備感受態(tài)細(xì)胞，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；4）培養(yǎng)大腸桿菌，讓重組質(zhì)粒及外源目的基因形成大量拷貝；5）篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞，進(jìn)行檢查或鑒定；6）表達(dá)目的蛋白。實(shí)驗(yàn)一：質(zhì)粒DNA的提取及鑒定1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用載體有哪些?它們的特點(diǎn)是什么?常用載體：大腸桿菌中的質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒、酵母人工染色體載體、動(dòng)植物病毒載體。特點(diǎn)：具有復(fù)制子（一段具特殊結(jié)構(gòu)的DNA序列，使與之結(jié)合的外源基因復(fù)制）、可檢測(cè)的遺傳表型、限制性內(nèi)切酶單一識(shí)別位點(diǎn)（便于外源基因插入）、適合的拷貝數(shù)（有利于載體制備；使細(xì)胞中克隆基因的劑量增加）2.分離基因組DNA和質(zhì)粒DNA有哪些異同點(diǎn)？相同：提取的步驟基本上都屬DNA的提取步驟，包括細(xì)胞裂解，DNA釋放，純化，最后沉淀溶解。不同：質(zhì)粒提取過程中，有一個(gè)DNA變性、復(fù)性的過程，這個(gè)與基因組提取完全不同，這是利用質(zhì)粒是以超螺旋結(jié)構(gòu)存在于大腸桿菌中的特殊狀態(tài)，分離純化質(zhì)粒時(shí)總是會(huì)利用這個(gè)特點(diǎn)來分離基因組DNA與質(zhì)粒DNA。3.核酸分離過程中，酚、氯仿、異戊醇的作用是什么？1）酚、氯仿作用是變性蛋白質(zhì)。酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。2）異戊醇是消泡劑。在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。4.在TE緩沖液中為什么要加入EDTA？EDTA是為了螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制Dnase5.純化的核酸如有酚和蛋白質(zhì)的污染，對(duì)它的后期操作有何影響？DNA制品中的蛋白質(zhì)、酚污染會(huì)降低內(nèi)切酶的活性，影響酶切效果。（好像還有什么的，想不起來了）6.有哪些因素影響核酸的沉淀？7.提質(zhì)粒時(shí)，溶液2為什么現(xiàn)配現(xiàn)用？溶液2中的主要成分是NaOH和SDS。NaOH是裂解細(xì)胞膜的主要成分，長(zhǎng)時(shí)間與空氣接觸會(huì)吸收二氧化碳，導(dǎo)致堿性下降，不利于破碎細(xì)胞，影響質(zhì)粒的產(chǎn)量。8.加入溶液3后產(chǎn)生的白色沉淀成分是什么？鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS。SDS專門和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。9.為什么用TE緩沖液懸浮和保存質(zhì)粒更好？TE是Tris-HCl和EDTA的簡(jiǎn)稱。在后續(xù)對(duì)質(zhì)粒的操作中,不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,其他緩沖液系統(tǒng)（如磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa=7.2）和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等）雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍,可作DNA的保存液,但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí),磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀。而Tris-HCL(pKa=8.0)緩沖系統(tǒng)使用緩沖對(duì)是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時(shí),大都采用Tris-HCL系統(tǒng),而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。不存在金屬離子，不產(chǎn)生干擾作用10.堿裂解法的原理和步驟（步驟見ppt）原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH12.0-12.5，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，質(zhì)粒DNA的氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍緊密結(jié)合。當(dāng)加入pH4.8的KAc高鹽緩沖液中和pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性慢，纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起絮狀沉淀下來而被除去。11.酚抽提的酚的兩個(gè)作用使蛋白質(zhì)變性沉降、抑制DNase活性實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定及電泳檢測(cè)1.對(duì)核酸進(jìn)行限制性酶切時(shí)應(yīng)注意什么？保證樣品純度（DNA制品中的污染蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等會(huì)影響內(nèi)切酶活性）對(duì)于酶切條件的控制（合適的酶反應(yīng)體積、酶作用單位、反應(yīng)時(shí)間）2.如何提高核酸電泳的分辨率？主要的是加大瓊脂糖凝膠的密度，還可以降低跑電泳的電壓，增大跑電泳的時(shí)間等.實(shí)驗(yàn)三、DNA片段的回收及連接反應(yīng)1.單酶切重組DNA有哪些弊端，如何避免？弊端:末端相同，可能發(fā)生自連，產(chǎn)生大量無效連接產(chǎn)物；插入片段沒有方向性避免方法：使用雙酶切；若用單酶切，可以將載體5’末端去磷酸化，并提高插入片段與載體的濃度比。2.在不計(jì)算DNA片段濃度的情況下，如何快速簡(jiǎn)便的估算連接片段的比例？3.DNA連接反應(yīng)的原理步驟、兩種常用的篩選方法（見ppt）4.質(zhì)粒重組的影響因素？反應(yīng)溫度；連接酶的用量；DNA末端的性質(zhì)；DNA濃度及兩種DNA分子數(shù)的比例5.連接時(shí)目的基因和載體的最佳摩爾比最佳比例是由構(gòu)造及末端的類型決定的，一般需要較高的插入片段與載體的摩爾比例，如2：1甚至5：1。6.DNA回收照膠紫外線使用短波還是長(zhǎng)波？應(yīng)使用長(zhǎng)波紫外燈。因?yàn)槎滩ㄗ贤饩€（254nm）會(huì)引起DNA鏈斷裂，或是造成基因突變。7.DNA連接反應(yīng)的原理步驟8.乙醇中為什么不加鹽？參考答案：洗的時(shí)候不加鹽是為了除鹽，做乙醇沉淀時(shí)加鹽是因?yàn)閱蝺r(jià)陽離子有利于聚沉DNA9．DNA連接酶兩個(gè)主要特點(diǎn)是什么；催化DNA5’磷酸基與3’羥基之間（切口）形成磷酸二酯鍵；DNA連接酶只能作用于雙鏈DNA分子而不能將二個(gè)單鏈DNA分子連接（這個(gè)算不算？）。10．連接反應(yīng)體系的加樣順序是什么ddH2O,10×T4緩沖液,DNA片段,最后加T4DNA連接酶11.在設(shè)計(jì)酶切和連接的時(shí)候，應(yīng)該特別注意什么？閱讀框的保證實(shí)驗(yàn)四、感受態(tài)細(xì)胞的制備與重組DNA的轉(zhuǎn)化1.如陰性對(duì)照中長(zhǎng)出菌，可能原因是什么？污染……2.菌的密度過高或培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，會(huì)在陽性菌的周圍長(zhǎng)出一些小的衛(wèi)星菌落，它們是非Kan抗性的，試分析原因。陽性菌能編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力。培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，β-內(nèi)酰胺酶使周圍抗生素的降解，使得不帶抗性的菌也能生長(zhǎng)，形成衛(wèi)星菌落。3.制作感受態(tài)細(xì)胞中最關(guān)鍵的操作？4.重組子兩種常用的篩選方法抗生素篩選法：菌株為某種抗性缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素（Ampr）抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（β-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割A(yù)mp的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌能力。）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。互補(bǔ)法：又稱藍(lán)白斑篩選法，質(zhì)粒上LacZ′基因編碼的α肽鏈與受體菌中編碼的β半乳糖苷酶C端突變體互補(bǔ)，形成有功能的β半乳糖苷酶，在特定培養(yǎng)基上顯藍(lán)斑，這種現(xiàn)象稱為α互補(bǔ)。如果有外源DNA片段插入質(zhì)粒上的LacZ′基因中，則β半乳糖苷酶失活，顯白斑。6.影響轉(zhuǎn)化效率的因素細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：大腸桿菌在對(duì)數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài)（OD值：0.3－0.5(5X107個(gè)/ml)）；試劑的質(zhì)量；化合物及無機(jī)離子（Rb+、Mn+、二甲亞砜等）；質(zhì)粒：大小、構(gòu)型；外源DNA（質(zhì)粒）與細(xì)胞的比例；器皿的潔凈度；污染（盡量所有打開器皿蓋的操作都在超凈臺(tái)中進(jìn)行）7.轉(zhuǎn)化效率計(jì)算轉(zhuǎn)化效率(每微克質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù))＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)(個(gè)轉(zhuǎn)化子)/加入質(zhì)粒DNA的量(μg)轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積）8.簡(jiǎn)述藍(lán)白斑檢測(cè)原理質(zhì)粒上LacZ′基因編碼的α肽鏈與受體菌中編碼的β半乳糖苷酶C端突變體互補(bǔ)，形成有功能的β半乳糖苷酶，在特定培養(yǎng)基上顯藍(lán)斑，這種現(xiàn)象稱為α互補(bǔ)。如果有外源DNA片段插入質(zhì)粒上的LacZ′基因中，則β半乳糖苷酶失活，顯白斑。實(shí)驗(yàn)五、重組克隆的鑒定（菌落PCR檢測(cè)），接種培養(yǎng)1.PCR變性，退火，延伸溫度（95℃預(yù)變性5min）94℃變性45sec50℃退火45sec72℃延伸45sec2．怎么計(jì)算PCR退火溫度Tm-53.PCR中如果出現(xiàn)非特異的條帶，可能是哪些方面出現(xiàn)問題，應(yīng)該如何調(diào)整？4.減少錯(cuò)摻的對(duì)策：加入Taq酶后迅速反應(yīng)，避免低溫下進(jìn)行的鏈延伸；酶濃度不可過大；dNTP不可過濃；Mg2+濃度適中實(shí)驗(yàn)六、重組克隆子的酶切鑒定1.比較菌落PCR和提質(zhì)粒酶切這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為什么需要兩次鑒定？菌落PCR快，靈敏，但是易出現(xiàn)假陽性，一般做初篩；提質(zhì)粒酶切結(jié)果可靠，但是耗時(shí)比較長(zhǎng)，一般做最終確定。實(shí)驗(yàn)七、大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞制備及重組DNA的轉(zhuǎn)化1.簡(jiǎn)述BL21感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化的步驟實(shí)驗(yàn)八、蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)1.BL21和DH5a的比較1）DH5a菌株DH5a是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?。E.coliDH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。DH5α質(zhì)?？截悢?shù)高,用于質(zhì)?？寺?、重組篩選、適合保存菌種,也可以表達(dá)某些蛋白2）BL21(DE3)菌株該菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）的基因。T7噬菌體RNA聚合酶位于λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合表達(dá)非毒性蛋白。2.IPTG的作用原理（ppt）3.如何通過調(diào)節(jié)IPTG的濃度和溫度來控制蛋白表達(dá)速度，從而提高蛋白的可溶性？4.在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響因素？5.原核表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)其遺傳圖譜明確，容易培養(yǎng)且費(fèi)用低，生產(chǎn)成本低廉。?細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因啟動(dòng)子?真核基因mRNA無SD序列，不能啟動(dòng)翻譯?缺乏轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，不能切除內(nèi)含子,cDNA,?表達(dá)的蛋白不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞?缺乏翻譯后加工體系?可能形成不溶性的包涵體6.誘導(dǎo)表達(dá)蛋白為什么要使用T4噬菌體的啟動(dòng)子而不用大腸桿菌自己的啟動(dòng)子？實(shí)驗(yàn)九、蛋白質(zhì)的純化1.在蛋白純化過程中，lysisbuffer，washbuffer和Elutionbuffer中所含有的咪唑的作用是什么？lysisbuffer，washbuffer中低濃度咪唑封閉多于結(jié)合位點(diǎn)，防止雜蛋白與鎳離子結(jié)合。Elutionbuffer中高濃度咪唑與目的蛋白競(jìng)爭(zhēng)鎳離子，將目的蛋白洗脫下來。實(shí)驗(yàn)十、誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS電泳檢測(cè)1.蛋白電泳上樣緩沖液的作用及煮沸的作用

蛋白電泳上樣緩沖液包括2%SDS,0.1%溴酚藍(lán)10%甘油,SDS是保證樣品中的所有蛋白帶電荷一致，減少電荷對(duì)電泳結(jié)果的影響。還原劑是讓二硫鍵處于斷開狀態(tài)，保證蛋白分子的線性.溴酚藍(lán)作用是指示上樣蛋白的跑膠時(shí)標(biāo)記的，甘油是增加上樣重量的，以免漂浮，煮沸是使蛋白變性的永久保存。2.SDS的應(yīng)用有哪些？1）蛋白質(zhì)純度分析；2）蛋白質(zhì)分析量的測(cè)定，根據(jù)遷移率大小測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量；3）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定；4）蛋白質(zhì)水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鑒定；6）免疫印跡的第一步；7）蛋白質(zhì)修飾的鑒定；8）分離和濃縮用于產(chǎn)生抗體的抗原；9）分離放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)；10）顯示小分子多肽。3.SDS電泳的原理和步驟（詳見ppt）（我就考到了這一題，原理我才提到三個(gè)效應(yīng)還沒解釋老師就讓我過了）4.不連續(xù)的SDS電泳過程中利用了哪些效應(yīng)？電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、濃縮效應(yīng)5.過硫酸銨的作用是什么引發(fā)劑點(diǎn)樣孔為什么是亮的？主要是蛋白質(zhì)污染，蛋白質(zhì)無法跑出膠孔，所以點(diǎn)樣孔周圍會(huì)很亮。也可能是基因組DNA污染。（拔梳子搓了據(jù)說也會(huì)照出反光效果）離心機(jī)的使用：離心管的對(duì)稱平衡；關(guān)好內(nèi)蓋及外蓋；設(shè)置離心速度和時(shí)間；轉(zhuǎn)頭完全停止后開蓋；“Short”鍵的使用。培養(yǎng)皿為什么要倒置？1）由于重力的作用使培養(yǎng)基表面及次層能富集微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，利于微生物生長(zhǎng)；2）防止空氣中微生物的污染培養(yǎng)基及培養(yǎng)物：倒置時(shí)平板內(nèi)的空氣是不流動(dòng)的,雜菌不會(huì)沉降到培養(yǎng)基表面,如果不倒置,很快平板周邊會(huì)長(zhǎng)起雜菌。3）倒置培養(yǎng)使瓊脂里水分不易蒸發(fā)出去，而充分的保持瓊脂的彈性與細(xì)菌容易繁殖和生存的環(huán)境。如果不倒置，大概3天左右培養(yǎng)基就會(huì)出現(xiàn)龜裂等水分散失的情況。而一些落菌等試驗(yàn)，需驗(yàn)證培養(yǎng)基無菌，就要