專題二細(xì)胞工程細(xì)胞工程是指應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，通過細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上的操作，按照人們的意愿來改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)或獲得細(xì)胞產(chǎn)品的一門綜合科學(xué)技術(shù)。按操作對象分類：植物細(xì)胞工程，動物細(xì)胞工程細(xì)胞工程是細(xì)胞水平或細(xì)胞器水平上的生物技術(shù)；基因工程是分子水平上的生物技術(shù)。一、植物細(xì)胞工程（一）植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.理論基礎(chǔ)（原理）：細(xì)胞全能性

=1\*GB3①概念：具有某種生物全部遺傳信息的任何一個細(xì)胞，都具有發(fā)育成完整生物體的潛能，即每個細(xì)胞都具有全能性。=2\*GB3②具有全能性原因：生物體的任一細(xì)胞都含有包含本物種的全部遺傳信息。=3\*GB3③在理論上，生物的任何一個細(xì)胞都具有發(fā)育成完整個體的潛能，但在生物的生長發(fā)育過程

中，細(xì)胞并不表現(xiàn)

全能性，而是分化成各種組織和器官。其原因是：在特定的時間和空間條

件下，細(xì)胞中的基因進(jìn)行了選擇性表達(dá)，使細(xì)胞分化成不同的組織和器官=4\*GB3④全能性表達(dá)的難易程度：受精卵＞生殖細(xì)胞＞干細(xì)胞＞體細(xì)胞；植物細(xì)胞＞動物細(xì)胞2.條件：離體、一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件。=1\*GB3①激素一般是生長素和細(xì)胞分裂素，當(dāng)生長素/細(xì)胞分裂素：比值高，有利于根分化，抑制芽的形成，比值低，有利于芽分化，抑制根形成，比例適中，有利于愈傷組織生長。=2\*GB3②其它外界條件包括無菌無毒，需不需要光照，空氣（氧氣），適宜的PH值和溫度等3.過程：脫分化再分化

離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織

胚狀體或叢芽植株=1\*GB3①脫分化:已分化細(xì)胞失去特有結(jié)構(gòu)功能成為未分化細(xì)胞=2\*GB3②愈傷組織：細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則,是一團無定形態(tài)具分生能力的薄壁細(xì)胞,=3\*GB3③再分化：未分化細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異4地位：是培育轉(zhuǎn)基因植物、植物體細(xì)胞雜交培育植物新品種的最后一道工序。5、注意事項①外植體的選擇與制備選擇外植體時，由于外植體的脫分化難易因植物種類、器官來源及生理狀況的不同而有很大差異，因此，選擇哪些作為外植體應(yīng)該注意。一般來講，煙草、胡蘿卜，植物的花和幼嫩的組織脫分化相對較易，而植物的莖、葉和成熟的老組織則較難。制備外植體首先要消毒，其次要選取有形成層的部分，因形成層細(xì)胞易脫分化。②植物組織培養(yǎng)注意的要點培養(yǎng)基包括所有操作工具都應(yīng)進(jìn)行消毒和滅菌，謹(jǐn)防雜菌污染；需在無菌條件下操作。③對于植物組織培養(yǎng)來說，光照條件非常重要，包括光照強度、時間和波長。但在由高度分化的組織形成愈傷組織的誘導(dǎo)階段往往要暗培養(yǎng)，而在分化形成試管苗的再生的過程中一定要有光照。誘導(dǎo)形成愈傷組織階段的暗培養(yǎng)有利于細(xì)胞的脫分化產(chǎn)生愈傷組織，如果在光照條件下容易分化產(chǎn)生維管等組織，不利于產(chǎn)生大量的愈傷組織。由愈傷組織經(jīng)細(xì)胞有絲分裂和分化形成試管苗的過程中需要光照，原因是葉中葉綠素的合成需要光照條件。（二）植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1、概念：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

概念：不同種植物的體細(xì)胞，在一定條件下融合成雜種細(xì)胞，并把雜種細(xì)胞培育成新的植物

體的技術(shù)。2、過程：

離體的細(xì)胞不同細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合→雜種細(xì)胞→雜種植株。

3、植物體細(xì)胞雜交步驟：=1\*GB3①去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體，目前最常用的去細(xì)胞壁的方法是酶解法，也就是

在溫和條件下用纖維素酶、果膠酶去除植物細(xì)胞的細(xì)胞壁。保證了原生質(zhì)體活性。=2\*GB3②

不同植物體細(xì)胞原生質(zhì)體融合，

必須通過物理法和化學(xué)法來誘導(dǎo)融合。

物理方法有：

離心、

振動、電激等促使原生質(zhì)體融合?；瘜W(xué)法是用聚乙二醇(PEG)作為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)融合。融合后再生出細(xì)胞壁。=3\*GB3③用植物組織培養(yǎng)方法進(jìn)行培育，可得到雜種植株。

4、在此過程中需要注意的問題有：

①植物體細(xì)

胞雜交過程中，

植物細(xì)胞融合所依據(jù)的生物

學(xué)原理是細(xì)胞膜的流動性；

植物組織培養(yǎng)的

理論基礎(chǔ)是細(xì)胞的全能性。

②體細(xì)胞融合成

功以后，既有AB型雜種細(xì)胞，還能形成AA

型和BB型兩種融合細(xì)胞，

但只有AB型細(xì)胞

是植物體細(xì)胞雜交所形成的雜種細(xì)胞，

因此

在雜種細(xì)胞形成后還應(yīng)有一個篩選過程。

③植物體細(xì)胞雜交技術(shù)兩個關(guān)鍵點：去細(xì)胞壁，原生質(zhì)體融合植物體細(xì)胞雜交完成的標(biāo)志是

新細(xì)胞壁的形成。④植物體細(xì)胞雜交過程仍以植物組織培養(yǎng)為前提，通過植物組織培養(yǎng)完成

雜種植株的培育過程。⑤植物體細(xì)胞雜交的最大突破是克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，但是目

前仍有許多理論和技術(shù)問題沒有解決，離推廣應(yīng)用仍有一定距離（二）植物細(xì)胞工程的應(yīng)用用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、作物新品種的培養(yǎng)、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。1、植物繁殖的新途徑=1\*GB3①人們形象地把用于快速繁殖優(yōu)良品種的植物組織培養(yǎng)技術(shù)叫做植物的微型繁殖技術(shù)也叫快速繁殖技術(shù)優(yōu)點:保持優(yōu)良品種的遺傳特性；高效快速地實現(xiàn)種苗的大量繁殖=2\*GB3②植物分生區(qū)附近病毒極少，甚至無病毒，因此目前采用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)來脫除病毒，提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)。=3\*GB3③人工種子就是以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)過人工薄膜包裝得到的種子。特點：后代無性狀分離；不受氣候、季節(jié)和地域的限制。2、作物新品種的培育=1\*GB3①單倍體育種優(yōu)點：后代穩(wěn)定遺傳，都是純合子；明顯縮短育種年限。過程：注意兩步，先花藥離體培養(yǎng)，再用秋水仙素加倍，所以結(jié)果不是單倍體=2\*GB3②突變體的利用：篩選對人們有利突變體，進(jìn)而培育新品種突變體產(chǎn)生的原因：在植物的組織培養(yǎng)過程中，由于培養(yǎng)細(xì)胞一直處于不斷的分生狀態(tài)，因此容易受到培養(yǎng)條件和外界壓力的影響而產(chǎn)生突變。3、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)，其中細(xì)胞產(chǎn)物包括蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、藥物、香料、生物堿等。例如人參皂甙，紫草和銀杏的細(xì)胞產(chǎn)物都實現(xiàn)了工廠化生產(chǎn)。注意只到愈傷組織階段，不需要培養(yǎng)成植株。附：答案和提示

2.1.1植物細(xì)胞工程的基本技術(shù)

（一）思考與探究

1.在組織培養(yǎng)實驗中，為什么要強調(diào)所用器械的滅菌和實驗人員的無菌操作？

提示：植物組織培養(yǎng)中用到的培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)成分，有利于培養(yǎng)物的生長，然而各種雜菌同樣也可以在上面迅速生長，所以植物組織培養(yǎng)過程中污染現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生。培養(yǎng)基一旦被污染，迅速生長的各種雜菌不但會和培養(yǎng)物爭奪營養(yǎng)，而且這些雜菌生長的過程中會生成大量對培養(yǎng)物有害的物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)物迅速死亡。

造成培養(yǎng)基污染的因素有很多，一般包括：外植體帶菌、培養(yǎng)瓶和各種器械滅菌不徹底、操作人員操作不規(guī)范等。所以在組織培養(yǎng)實驗中用到的植物材料和各種器械都要進(jìn)行徹底地滅菌，實驗人員操作一定要規(guī)范，避免帶入雜菌。

2.在本實驗中，切取胡蘿卜塊根時強調(diào)要切取含有形成層部分，原因是這部分容易誘導(dǎo)形成愈傷組織。請思考一下，胡蘿卜的其他部分（如莖、葉、花），是否也能培養(yǎng)成小植株，你能用實驗的方法進(jìn)行驗證嗎？

提示：胡蘿卜的其他部分（如莖、葉、花）也能培養(yǎng)再生形成小植株，只是誘導(dǎo)愈傷組織比較困難?？梢宰寣W(xué)生參考利用胡蘿卜根進(jìn)行組織培養(yǎng)的實驗，嘗試設(shè)計出利用胡蘿卜的莖、葉、花進(jìn)行組織培養(yǎng)的實驗流程。

3.請根據(jù)上面的實驗過程，概括出植物組織培養(yǎng)技術(shù)的流程簡圖。

提示：

2.1.2植物細(xì)胞工程的實際應(yīng)用

（一）思考與探究

1.通過查閱資料，請你再列舉出植物組織培養(yǎng)技術(shù)在我們生活中的另外一些應(yīng)用。

提示：a.拯救瀕危植物；

b.提供食品制作的原料；

c.利用愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作。

2.請查閱植物人工種子制備技術(shù)的詳細(xì)過程，設(shè)計出制備技術(shù)的主要流程圖。

提示：誘導(dǎo)植物愈傷組織

↓

體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)

↓

體細(xì)胞胚的成熟

↓

體細(xì)胞胚的機械化包裹

↓

貯藏或種植

3.請查閱相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計出一種植物花藥組織培養(yǎng)和染色體加倍的實驗流程。

提示：

花藥花粉細(xì)胞培養(yǎng)愈傷組織分化出小植物單倍體植株正常植株

（二）正文中討論題

1.人們利用植物的微型繁殖技術(shù)來進(jìn)行工廠化育苗生產(chǎn)，這是利用了該項技術(shù)的哪些特點？

提示：植物“微型”繁殖技術(shù)具有高效性和可以保持種苗的優(yōu)良遺傳特性的優(yōu)勢。工廠化大規(guī)模育苗生產(chǎn)正是利用了植物“微型”繁殖技術(shù)的這兩方面優(yōu)勢。利用植物“微型”繁殖技術(shù)我們可以在短時間中獲得大量的優(yōu)質(zhì)種苗。

2.人工種子之所以神奇，是由于它具有天然種子不可比擬的特點，想一想它們具有哪些優(yōu)點？

提示：人工種子的優(yōu)點：

（1）天然種子由于在遺傳上具有因減數(shù)分裂引起的重組現(xiàn)象，因而會造成某些遺傳性狀的改變；天然種子在生產(chǎn)上受季節(jié)限制，一般每年只繁殖1～2次，有些甚至十幾年才繁殖一次。而人工種子則可以完全保持優(yōu)良品種的遺傳特性，生產(chǎn)上也不受季節(jié)的限制。

（2）試管苗的大量貯藏和運輸也是相當(dāng)困難的。人工種子則克服了這些缺點，人工種子外層是起保護作用的薄膜，類似天然種子的種皮，因此，可以很方便地貯藏和運輸。

3.人工種皮是保證包裹在其中的胚狀體順利生長成小植株的關(guān)鍵部分，請?zhí)接懭斯しN皮中應(yīng)該具有的有效成分是什么？為了促進(jìn)胚狀體的生長發(fā)育，我們還可以向人工種皮中加入哪些物質(zhì)？

提示：針對植物種類和土壤等條件，在人工種子的包裹劑中還可以加入適量的養(yǎng)分、無機鹽、有機碳源以及農(nóng)藥、抗生素、有益菌等。為了促進(jìn)胚狀體的生長發(fā)育，還可以向人工種皮中加入一些植物生長調(diào)節(jié)劑。

4.高效抗癌的藥物紫杉醇，雖然能造福人類，但卻為瀕危的紅豆杉帶來一場滅頂之災(zāi)。以“我們能否利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)大量生產(chǎn)紫杉醇，從而拯救紅豆杉”為題，與同學(xué)展開討論，說出植物組織培養(yǎng)技術(shù)在節(jié)約資源、保護環(huán)境方面的重要意義。

提示：可以利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)來大量生產(chǎn)紫杉醇。現(xiàn)在國內(nèi)外的科學(xué)家們正在研究利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來大量培育紅豆杉細(xì)胞，希望利用這種方法來大量生產(chǎn)紫杉醇。國內(nèi)外許多實驗室開展了用組織培養(yǎng)法生產(chǎn)紫杉醇的研究，紅豆杉屬的11種植物現(xiàn)都在進(jìn)行組織培養(yǎng)。ESCAgenetics公司宣布他們用細(xì)胞培養(yǎng)法所得紫杉醇的含量是樹皮的2～5倍。國內(nèi)外在分化細(xì)胞株系和培養(yǎng)條件方面做了不少工作，摸索了外植體、光照、培養(yǎng)基組成等因素對細(xì)胞培養(yǎng)及紫杉醇生成的影響?，F(xiàn)在工藝條件已基本摸清，正研究反應(yīng)的放大技術(shù)等，有望實現(xiàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的目標(biāo)。

二、動物細(xì)胞工程（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)1、概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖.2、原理：細(xì)胞增殖3：過程：胚胎或幼齡動物器官組織=1\*GB3①原代培養(yǎng)：人們通常剪碎將動物組織消化后的初次單個細(xì)胞培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。細(xì)胞懸液原代轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（貼壁生長長成培養(yǎng)單層細(xì)胞。有接觸抑制現(xiàn)象）細(xì)胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附接觸抑制：當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時,細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制②傳代培養(yǎng)：當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處于接觸抑制后,用胰蛋白酶處理,使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來,然后加入新的培養(yǎng)液,將細(xì)胞分離稀釋,并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi),這個過程稱傳代培養(yǎng).（分瓶培養(yǎng)的過程）細(xì)胞系、細(xì)胞株（了解即可，老課本體系）細(xì)胞株：傳代細(xì)胞一般能傳到40-50代，遺傳物質(zhì)一般不會發(fā)生改變，叫細(xì)胞株。細(xì)胞系：傳代50代以后不能再傳下去，部分細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能連續(xù)傳代，獲得不死性，叫細(xì)胞系。剪碎用胰蛋白酶處理=3\*GB3③總結(jié)：動物細(xì)胞培養(yǎng)過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官剪碎用胰蛋白酶處理原代培養(yǎng)特點：細(xì)胞貼壁、接觸抑制加培養(yǎng)液稀釋原代培養(yǎng)單個細(xì)胞原代培養(yǎng)特點：細(xì)胞貼壁、接觸抑制加培養(yǎng)液稀釋原代培養(yǎng)傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。配置細(xì)胞懸液傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。細(xì)胞株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶細(xì)胞株傳代10-50代左右，增長緩慢以至于完全停止，部分細(xì)胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質(zhì)可能改變）傳代10-50代左右，增長緩慢以至于完全停止，部分細(xì)胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質(zhì)可能改變）傳代培養(yǎng)10代細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細(xì)胞獲得不死性，細(xì)胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細(xì)胞。細(xì)胞系40-50代細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細(xì)胞獲得不死性，細(xì)胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細(xì)胞。細(xì)胞系無限傳代4.動物細(xì)胞培養(yǎng)的條件:=1\*GB3①無菌無毒的環(huán)境：對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具無菌處理；培養(yǎng)液中添加抗生素防止培養(yǎng)過程中污染；定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產(chǎn)物，防止對培養(yǎng)細(xì)胞造成危害。=2\*GB3②營養(yǎng)：液體合成培養(yǎng)基：（糖、氨基酸）、促生長因子、（水、無機鹽、微量元素）等；通常還需加入血漿、血清等天然成分。=3\*GB3③溫度和pH：適宜的溫度：人和哺乳動物細(xì)胞最適溫度為36.5±0.5℃。適宜的酸堿度：PH：7.2-7.4=4\*GB3④氣體環(huán)境：95％空氣+5％CO2”的混合氣體培養(yǎng)箱。氧氣是細(xì)胞代謝必須的；CO2維持培養(yǎng)液的PH。5、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用:=1\*GB3①蛋白質(zhì)生物制品的生產(chǎn)如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體=2\*GB3②應(yīng)用于基因工程主要用于作為受體細(xì)胞=3\*GB3③檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性=4\*GB3④細(xì)胞的生理、藥理、病理研究如用于篩選抗癌藥物（二）核移植1、定義：動物核移植是將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核,移入一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.2、原理：動物細(xì)胞核具有全能性3、分類：胚胎核移植、體細(xì)胞核移植動物體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)其全能胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易性十分困難4、體細(xì)胞核移植過程-=1\*GB3①供體細(xì)胞的采集與培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)=2\*GB3②受體卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)=3\*GB3③顯微操作去除卵母細(xì)胞中的核=4\*GB3④將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞核移植=5\*GB3⑤用物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂進(jìn)程。=6\*GB3⑥電刺激促融使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎。=7\*GB3⑦胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)胚胎移植=8\*GB3⑧妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)相同的犢牛實施細(xì)胞工程時，所需受體細(xì)胞大多采用卵母細(xì)胞的原因：體積大，易操作；含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。5、應(yīng)用前景在畜牧業(yè)生產(chǎn)方面：①利用體細(xì)胞克隆技術(shù)可以加速家畜遺傳改良進(jìn)程，促進(jìn)優(yōu)良畜群繁育；②在保護瀕危物種方面：利用體細(xì)胞核移植技術(shù)增加這些動物的存活數(shù)量，挽救瀕危物種。在醫(yī)藥方面：①利用轉(zhuǎn)基因克隆動物生產(chǎn)珍貴的醫(yī)用蛋白；②利用轉(zhuǎn)基因克隆動物細(xì)胞、組織器官作為異種移植的供體，治療疾病；③利用人的核移植胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化，形成相應(yīng)的組織、器官，用于組織器官的移植；在科研領(lǐng)域方面：①研究克隆動物和克隆細(xì)胞，從而更深入地了解胚胎發(fā)育及衰老過程；②利用克隆動物做疾病模型，使人們更好的追蹤研究疾病的發(fā)展過程，從而治療疾病。6、存在的問題盡管體細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)在許多種動物中獲得成功，但=1\*GB3①其成功率仍然非常低，產(chǎn)下的活克隆動物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%?？寺〖夹g(shù)的各個環(huán)節(jié)也有待進(jìn)一步改進(jìn)。此外，絕大多數(shù)克隆動物還存在=2\*GB3②健康問題，許多克隆動物表現(xiàn)出=3\*GB3③遺傳和生理缺陷。對④克隆動物食品的安全性也存有爭議。（三）動物細(xì)胞融合1、定義：指用自然或人工方法使兩個或多個不同的細(xì)胞融合成一個細(xì)胞的過程。細(xì)胞雜交：不同基因型的細(xì)胞之間的融合就是細(xì)胞雜交。雜交細(xì)胞：融合后形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞成為雜交細(xì)胞。2、原理：細(xì)胞膜的流動性3、誘導(dǎo)融合的因素生物法：滅活的病毒誘導(dǎo)融合.(利用滅活仙臺病毒是動物細(xì)胞融合所特有的。這是由于病毒的磷脂外衣與動物細(xì)胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些=1\*GB3①糖蛋白可能還有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。)=2\*GB3②化學(xué)法：聚乙二醇PEG誘導(dǎo)融合.③物理法：電激融合4、動物細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用=1\*GB3①細(xì)胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。=2\*GB3②利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。（四）單克隆抗體的制備——動物細(xì)胞融合的成功應(yīng)用

1、人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法：將抗原注入動物體,然后從動物血清中提取抗體這種方法的缺點是：效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動物抗體注入人體可能產(chǎn)生嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。2、單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。由于B淋巴細(xì)胞在體外不能無限增殖，所以不能用單個B淋巴細(xì)胞通過克隆形成的細(xì)胞群來產(chǎn)生單一類型的抗體3方案：將能夠產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞和具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合在一起，形成雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞既能在體外無限增值，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體——單克隆抗體4、過程=1\*GB3①動物特異性免疫=2\*GB3②分離B淋巴細(xì)胞（B）；找到骨髓瘤細(xì)胞（G）。注意B淋巴細(xì)胞是一個系列。（B1,B2,B3,---Bn）③細(xì)胞融合——三種融合方式:（BB;BG;GG）④第一次篩選：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選雜交瘤細(xì)胞（只有BG雜交瘤細(xì)胞存活。但BG雜交瘤細(xì)胞也是一個系列：如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）⑤第二次篩選：在“多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞系列，每孔只放一個雜交瘤細(xì)胞?！翱寺』囵B(yǎng)”每個雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行“單一抗體檢測”，“檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細(xì)胞。=6\*GB3⑥選擇所需要的雜交瘤克隆細(xì)胞群，體外培養(yǎng)或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。=7\*GB3⑦提取單克隆抗體。注：核心步驟是兩次篩選，即第1次篩選得到雜交瘤細(xì)胞（多種）；第2次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞群。本過程利用的原理：免疫原理、細(xì)胞融合原理和動物細(xì)胞培養(yǎng)原理5、單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，可大量制備。6、單克隆抗體的應(yīng)用=1\*GB3①作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等,與常規(guī)抗體相比,具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速特點.=2\*GB3②用于治療疾病和運載藥物：主要用于癌癥治療。生物導(dǎo)彈：抗癌細(xì)胞的單克隆抗體+放射性同位素+化學(xué)藥物或細(xì)胞毒素。（單克隆抗體：導(dǎo)向。準(zhǔn)確找到癌細(xì)胞位置，原位殺死癌細(xì)胞。）附：答案和提示

2.2.1動物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)

（一）思考與探究

1.幼齡與老齡動物的組織細(xì)胞比較，分化程度低的與分化程度高的組織細(xì)胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？

提示：細(xì)胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關(guān)系，細(xì)胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物細(xì)胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細(xì)胞比老年動物的組織細(xì)胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細(xì)胞的分化程度越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。

2.動物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？

提示：脫分化又稱去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過程。植物的任何一部分，甚至單個細(xì)胞都具有長成完整植株的能力。但要發(fā)育成完整植株，必須先脫分化，脫分化的細(xì)胞具有發(fā)育成任何組織的能力，然后進(jìn)行再分化，形成完整植株。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于農(nóng)林生產(chǎn)中的作物、苗木育種，快速繁育種苗、培育無病毒植株等，這就要求植物的組織或細(xì)胞先進(jìn)行脫分化。動物細(xì)胞的培養(yǎng)有各種用途，一般而言，動物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細(xì)胞也就沒有類似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。

3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達(dá)（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀(jì)錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。

（1）能利用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)嗎？請說明理由。

提示：可以用體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)。盧辛達(dá)的產(chǎn)奶量很高，說明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達(dá)的體細(xì)胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進(jìn)程。

但同時需注意，該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。

（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達(dá)的任務(wù)交給你，你將如何對它進(jìn)行克隆？

提示：首先從盧辛達(dá)耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細(xì)胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細(xì)胞的核，再將耳細(xì)胞注入卵母細(xì)胞，用電刺激方法使卵母細(xì)胞與體細(xì)胞融合，這時供體核就進(jìn)入了受體卵母細(xì)胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。

4.體細(xì)胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。

提示：在研究方面，克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。

在應(yīng)用上，生產(chǎn)克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離。

（二）正文中討論題

【討論1】

多細(xì)胞動物和人體的細(xì)胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識，思考并討論以下問題：

1.體外培養(yǎng)細(xì)胞時需要提供哪些物質(zhì)？

提示：充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。

2.體外培養(yǎng)的細(xì)胞需要什么樣的環(huán)境條件？

提示：無菌、無毒的環(huán)境。

【討論2】

1.在體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到受體卵母細(xì)胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細(xì)胞的核？

提示：為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細(xì)胞，在供體細(xì)胞的細(xì)胞核移至受體細(xì)胞之前，必須將受體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)去掉或?qū)⑵淦茐摹?/p>

2.用于核移植的供體細(xì)胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞，想一想，這是為什么？

提示：培養(yǎng)的動物細(xì)胞一般當(dāng)傳代至10～50代左右時，部分細(xì)胞核型可能會發(fā)生變化，其細(xì)胞遺傳物質(zhì)可能會發(fā)生突變，而10代以內(nèi)的細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在體細(xì)胞核移植中，為了保證供體細(xì)胞正常的遺傳基礎(chǔ)，通常采用傳代10代以內(nèi)的細(xì)胞。

3.你認(rèn)為用上述體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物，是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？

提示：克隆動物絕大部分DNA來自于供體細(xì)胞核，但其核外還有少量的DNA，即線粒體中的DNA是來自于受體卵母細(xì)胞。所以，用教材中所述的方法克隆的動物不是供核動物完全相同的復(fù)制。

此外，即便動物的遺傳基礎(chǔ)完全相同，但動物的一些行為、習(xí)性的形成與所處環(huán)境有很大關(guān)系，核供體動物生活的環(huán)境與克隆動物所生活的環(huán)境不會完全相同，其形成的行為、習(xí)性也不可能和核供體動物完全相同，從這一角度看，克隆動物不會是核供體動物100%的復(fù)制。

（三）尋根問底

胰蛋白酶真的不會把細(xì)胞消化掉嗎？為什么？

提示：胰蛋白酶除了可以消化細(xì)胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細(xì)胞膜蛋白，對細(xì)胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。

（四）旁欄思考題

1.進(jìn)行動物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是什么成分？用胃蛋白酶行嗎？

提示：用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。胃蛋白酶作用的適宜pH約為2，當(dāng)pH大于6時，胃蛋白酶就會失去活性。胰蛋白酶作用的適宜環(huán)境pH為7.2～8.4。多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜pH為7.2～7.4，胃蛋白酶在此環(huán)境中沒有活性，而胰蛋白酶在此環(huán)境中活性較高，因此胰蛋白酶適宜用于細(xì)胞培養(yǎng)時的消化。

2.為什么對動物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時通常要添加血清？

提示：血清中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白質(zhì)主要為白蛋白和球蛋白。氨基酸有多種，是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的基本成分，其中有些氨基酸動物細(xì)胞本身不能合成（稱為必需氨基酸），必須由培養(yǎng)液提供。血清激素有胰島素、生長激素等及多種生長因子（如表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、類胰島素生長因子等）；血清還含有多種未知的促細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質(zhì)，能促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖和貼附。因此，細(xì)胞培養(yǎng)時，要保證細(xì)胞能夠順利生長和增殖，一般需添加10%～20%的血清。

2.2.2動物細(xì)胞融合與單克隆抗體

思考與探究

1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？

提示：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動物細(xì)胞融合是兩個體細(xì)胞直接融合。

2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？

提示：哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。

三、知識拓展

1.為什么要在避光條件下培養(yǎng)愈傷組織？

對于植物組織培養(yǎng)來說，光照條件非常重要，包括光照強度、時間和波長。但在愈傷組織的誘導(dǎo)階段往往要暗培養(yǎng)，而在分化再生的過程中一定要有光照。愈傷組織誘導(dǎo)階段的暗培養(yǎng)有利于細(xì)胞的脫分化產(chǎn)生愈傷組織，如果在光照條件下容易分化產(chǎn)生維管等組織，