DetectingMOinFoodsAims1.2.3.Outline1.2.3.4.5.6.7.8.9.

TounderstandthetraditionalmethodsandrapidmethodsfordetectingmicroorganismsinfoodsTounderstandtheprinciples,advantages,limits,andapplicationforeachdetectingmethodTounderstandtheissuesofthemetabolicallyinjuredmicroorganisms(MO)andtheviablebutnon-cultivableMO(VBNC)HomogenizationmethodsStandardplatecount(SPC)SpiralplatecountMembranefiltrationmethodsMicroscopeplatecountPetrifilmMPNDirectmicroscopiccountDyereductiontestDetectingMOonsurfacesMetabolicallyinjuredmicroorganismsViablebutnon-cultivablemicroorganisms(VBNC)Phisical,chemical,molecular,andimmunologicalmethods§均質(zhì)法（Homogenizationmethods）WaringBlendor vs. StomacherWaringBlendor 優(yōu)點(diǎn)：免於清洗、殺菌操作正常操作時(shí)間內(nèi)min）不生熱，不影響菌數(shù)噪音低均質(zhì)液易貯藏（細(xì)胞降低來(lái)自食品組成份之干擾（尤其在非SPC偵測(cè)法）9-1標(biāo)準(zhǔn)平板法〔StandardPlateCount活菌數(shù)1.計(jì)數(shù)：25~25030~300cfu）假設(shè)：各培養(yǎng)皿中之菌落源自單一菌體。所提供之條件（營(yíng)養(yǎng)、溫度等）而產(chǎn)生菌落。方法：混稀法（pourplate塗抹法（spreadplatecount,surfaceplate（與混稀法比較）無(wú)熱傷害有利好氧菌快速生長(zhǎng)容易計(jì)數(shù)可自動(dòng)化操作菌落易分離§螺旋平板法（Spiralplate所用培養(yǎng)基、平板、稀釋液、吸管均較少快速，50~60plate/h易受食物顆粒阻塞設(shè)備費(fèi)用高9-2§膜濾法（Membranefiltrationmethods）適用於水、飲料、或空氣等菌數(shù)低者以利過(guò)濾直接螢光過(guò)濾法（DirectEpifluorescentFilter留於濾膜上之菌株，以螢光染劑，如acridineorange染色，再以螢光顯微鏡計(jì)數(shù)操作： Foodhomogenate↓5μmnylonfilter↓filtrate,＋2mlTritonX-100&0.5mlTrypsin↓0.6μmNucleoporepolycarbonatefilter↓filterstainedwithacrineorange↓countMicrocolony-DEFTMicrocolonymethod：FiltrationSample→filter→plate,incubatefor3~6h→microscopiccountMicrocolony-DEFTSample→filter→plate,andincubated →acridineorangestain(nucleoporemembrane)-fluorescencemicroscopiccount9-3（HydrophobicGridMembraneFiltration,1600waxgrid/membrane減少稀釋操作totalcoliformsfecalcoliformsSalmonellaeE.coi157:H7§顯微鏡菌落計(jì)數(shù)（Microscopecolonycounts）0.1mlsample＋2mlnutrientagar→mix→spreadovera4cm2areaonaglassslide →incubated3~8hinawarmmoistchamber→airdried,flame-fixed,stainforcountwithmicroscope.§Petrifilm將培養(yǎng)基塗敷於數(shù)層纖維所構(gòu)成之薄膜上攜帶儲(chǔ)存方便可用於表面微生物分析§最可能菌數(shù)法MostProbableNumbe（MP活菌數(shù)3-tubeor5-tubeatleast3seriousdilutionsareusedmonitoredbyturbidity,colorchange,orgasproductionestimateddata,lessprecisethanagarplatingmethodsusedforlowcellcounts9-4§染劑還原法（DyeReductionTest活菌數(shù)原理： 菌體具當(dāng)菌體代謝時(shí)，故使培養(yǎng)液還原需時(shí)間與菌數(shù)成反比。還原指示劑：methyleneblue：從藍(lán)色變成無(wú)色resazurin從粉紅變無(wú)色，可因成粉紅。3.特性(1)SPC快(2)估測(cè)值(3)非所有MO.還原能力（速度）相同(4)指示劑可能對(duì)部分MO.有抑制作用(5)食品本身可能亦含還原劑或酵素而干擾§〔DirectMicroscopicCount（DM活、死菌操作0.01ml1(2)固定（40-5℃、乾燥染色油鏡下計(jì)數(shù)優(yōu)點(diǎn)品量極少。9-5缺點(diǎn)觀察者易疲勞；(4)菌體可能成團(tuán)，分散不均，或有些不易染色?，F(xiàn)已有方法區(qū)分死、活菌體HowardMoldCount1911B.J.Howard機(jī)械Geotrichumcandidum亦相似，均利用有凹槽載玻片，在顯微勞?！毂砻嫖⑸餀z驗(yàn)生物體表加工機(jī)械、器皿、工作臺(tái)Swab/Swab-RinseMethod最早、最廣泛使用者以棉花棒（濕）ATP分析法，塗抹後，可迅速得知結(jié)果，常用於清洗效果之評(píng)估用。9-6接觸平板法（Contactplate）15.5-16.5ml基表面，將之覆蓋於欲測(cè)物面，加蓋培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)?；厥章什桓?，有人云僅0.1％，即若測(cè)得10cfu/c（Swab較適用於低污染物表面。噴槍法（Spray以高壓水沖洗物體表面，再分析洗液中菌數(shù)。對(duì)肉品表面菌數(shù)分析，此法優(yōu)於塗抹法?！齑x性受傷之微生物（Metabolicallyinjuredorganisms）微生物受次死環(huán)境侵害，影響其代謝（但未死亡養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)，但可在非選擇性培養(yǎng)基生長(zhǎng)，故可將樣品分別選擇性及非選擇性培養(yǎng)基分析之，二者之差，即為Injured。食品病原菌之檢測(cè)管制，常為「不得檢出，故通常需將（1~4菌復(fù)原，再以選擇性培養(yǎng)基分析之。由部分研究顯示，培養(yǎng)液中含丙酮酸或催化等有助於受傷菌復(fù)原，此二物質(zhì)之功能均為分解過(guò)氧化物，故推測(cè)受傷菌可能缺乏（脂質(zhì)核醣體、、或某些酵素。9-7§不能培養(yǎng)的活菌（Viablebutnon-cultivableorganisms,VBNC）VBNC與代謝傷害性菌不同，後者可於非選擇性培養(yǎng)基修護(hù)。VBNC首被發(fā)現(xiàn)於海洋弧菌，當(dāng)海水溫度被降至5℃，弧菌成為VBNC狀態(tài)。此時(shí)，platecount者很低，但由以acridineorange之鏡檢法（可區(qū)分死、活VBNC即可恢復(fù)原來(lái)狀態(tài)，處?kù)禫BNC9-8§物理、化學(xué)、分子及免疫分析法物理方法電阻抗或?qū)щ姸确ǎ↖mpedance/Conductance原理：微生物生長(zhǎng)時(shí)，要利用（分解）環(huán)境（培養(yǎng)液）導(dǎo)電度。固定儀器，有其偵測(cè)之靈敏度。/導(dǎo)電度變化所需時(shí)間菌體數(shù)成反比。VitekBactometer測(cè)電阻抗；Malthus度。流電細(xì)胞計(jì)數(shù)法（flowcytometry）原用魚(yú)動(dòng)物細(xì)胞測(cè)定，現(xiàn)可用於酵母菌計(jì)數(shù)，若配合螢光抗體，可測(cè)特定細(xì)菌?；瘜W(xué)方法ThermostablenucleasecoagulasetherostablenucleaseThermostablenucleaseaureusenterococcusnuclease為thernostablenucleas（4.％。9-9分析thermostablenucleaseS.aureus生長(zhǎng)狀況之優(yōu)點(diǎn)：仍在，而S.aureus之腸毒素亦屬熱安定性。偵測(cè)比腸毒素快。比腸毒素早產(chǎn)生。不需濃縮即可偵測(cè)，腸毒素需濃縮。二者均為熱安定性。LimuluslysateforendotoxinsG－之outermembrane之lipopolysaccharieLP）—endotoxinLimuluspolyphemousamoebocyte（血球細(xì)胞）endotoxin極敏感（活化，使得lysate測(cè)可使lysate成gel之最大食品稀釋度（tite，為半定量法。近來(lái)，發(fā)展出呈色法，加入試劑（如gly(ala)-arg-ρ-nitroalanin（ρN，當(dāng)樣品中有LP，可使coagulase活化，其可將ρNA水解，產(chǎn)生ρ-nitroalanine，測(cè)405nm吸光值。EndotoxinFactorC FactorC*FactorB FactorB*Proclottingenzyme*：活化狀態(tài) (coagulase)

Clottingenzyme(coagulase*)Coagulogen9-10

CoagulinρNA:ρ-nitroalanineATP測(cè)定ATPATP含量恆定，以菌量而言，含量約10－18~10－17mole/cell，將菌體內(nèi)之ATP萃取出來(lái)，分析其含量，即間接代表菌數(shù)多寡。利用螢火蟲(chóng)發(fā)光機(jī)制，來(lái)分析ATP：2 2 LH＋E＋ATPE·LH－AMP＋PP2 2 E·LH2－AMP＋O2LH2：luciferinL＝O：oxyluciferin

E＋L＝O＋CO2＋AMP＋LightE：luciferasePPi：pyrophosphate9-11此法非?？焖?，可用在工廠清洗效率評(píng)估之快速偵測(cè)用。若應(yīng)用在食品上，需克服來(lái)自食品之ATP干擾，可利用離心、過(guò)濾等物理方除去食品顆粒，或添加酵素apyrase，選擇性地破壞食品ATP。常用基質(zhì)：4-methlumbelliferyl-β-D-glucuronide（MUG）4-methlumbelliferyl-β-D-galactoside（MUGal）o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（ONPG）bromo-4-chloro-3-Indoxyl-β-D-glucuronide（BCIG）L-alanine-P-nitroanilied（LAPN）其中以MUG之螢光性基質(zhì)最常用，其可被β-D-glucuronidase（GU4-methyl-umbelliferygrouE.coliE.coli檢驗(yàn)MUGlauryltryptosebrot（LTE.coli107cellE.coliGUD才足夠偵測(cè)MUG結(jié)果。ONPG亦同樣利用，經(jīng)β-D-galactosidase水解後，產(chǎn)生黃色（420nm吸光，用已偵測(cè)Coliform。若NPG及MUG營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，coliforms呈黃色菌落，黃色菌落同時(shí)有螢光者為E.coli。9-12Lux基因之發(fā)光Luxluciferase之合成，將luxgene轉(zhuǎn)殖到噬菌體，在噬（病原菌。C核酸探針/PCR尋找預(yù)測(cè)微生物特有的核酸片段，將之標(biāo)示，此即為核酸探針。當(dāng)此probe碰到與其互補(bǔ)序列，會(huì)結(jié)合orhybridization由probe之標(biāo)示物，我們可偵測(cè)之。典型分析法：預(yù)測(cè)cell→抽取DNA→內(nèi)切水解→電泳→轉(zhuǎn)至NCmembrane→加probehybridization→清洗→偵測(cè)，偵測(cè)敏感度：104~105，若低於此，樣品先經(jīng)enrichment，使少量菌增殖，再偵測(cè)之。（colonyhybridizatio，乃樣品均質(zhì)→membrane使菌溶製lysi，使DNA露出，成單股，加probe偵測(cè)之。近年來(lái)，伴隨PCR（polymerasechainreaction）之放大技術(shù)，使食品中存在之少數(shù)菌之DNA，在人為操控環(huán)境下進(jìn)行複製。Primer,DNApolymerase,dATP，dGTP，dCTP，dGTP9-13（20~50cycleDNA分子擴(kuò)增至17DNA1個(gè)cell，也可以測(cè)到。1.核酸探針的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)核酸探針的優(yōu)點(diǎn)：核酸探針不必單離、純化菌株，可節(jié)省不少的時(shí)間與成本。核酸探針可以快速鑑定、計(jì)數(shù)與之雜交的菌株。特異性高，其受微生物其基因突變或細(xì)胞內(nèi)的控制影響較少。 DNA高。靈敏度高。核酸探針的缺點(diǎn)：1/2利用32P-labeled核酸探針，其t =14天(b)核酸探針不能探知食品中已經(jīng)存在的毒素1/2核酸探針的一般特性：Targetnucleicacid的選擇（Wolcott,Targetnucleicacid可由下列四方面著手：為genomic特異性甚高。messengerRNA(mRNA)mRNA的量比genomicDNA高出很多，所以比較容易被偵測(cè)。為rRNAgenomicDNAmRNA為探針的點(diǎn)。最後核酸探針的來(lái)可由plasmidDNA所獲得，菌產(chǎn)生毒素的基因可能在plasmidDNA上，故可藉此作核酸探針。9-14探針的大小10nucleotide10,000bas（M.W.3,300,00，然而最常見(jiàn)的核酸探針在14至40之間。核酸探針可依其核酸探針的片段長(zhǎng)度區(qū)