實驗八微生物生理生化試驗1菌種大腸桿菌，普通變形桿菌，金黃色葡萄球菌，產(chǎn)氣腸桿菌2培養(yǎng)基尿素瓊脂試管，蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵管和乳糖發(fā)酵管各3支。3溶液和試劑甲基紅指示劑，5％萘酚，乙醚和吲哚試劑4儀器和其他用品接種針一實驗器材二目的要求1大分子物質(zhì)水解試驗（1）證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)；（2）掌握微生物大分子物質(zhì)水解實驗的原理和方法。2IMViC試驗了解IMViC與硫化氫反應(yīng)的原理及其在腸道細菌鑒定中的意義和方法。3糖發(fā)酵試驗（1）了解糖發(fā)酵的原理和在腸細菌鑒定中的重要作用。（2）掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。

三基本原理1大分子物質(zhì)水解試驗

微生物對大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要是水解酶，通過加水裂解大分子物質(zhì)為較小化合物，使其能被運輸至細胞內(nèi)。水解過程可通過底物的變化來證明，如細菌對大分子的淀粉不能直接利用，產(chǎn)生胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)，再被細菌吸收利用，這一過程可以用碘測定不再產(chǎn)生藍色來證明；水解明膠可觀察到明膠被液化；脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸改變培養(yǎng)基的pH，其中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色。明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25℃以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在，而在25℃以上明膠會液化。有些微生物能產(chǎn)生明膠酶，水解明膠蛋白，而使明膠液化，甚至在4℃仍能保持液化狀態(tài)。2IMViC（吲哚、甲基紅、伏－普和檸檬酸鹽）試驗這四個試驗主要是用來快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣桿菌，多用于水的細菌檢查。

吲哚試驗是用來檢測吲哚的產(chǎn)生，有些細菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成紅色的玫瑰吲哚（紅色化合物）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗可作為一個生物化學檢測的指標。

大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。

甲基紅試驗是用來檢測有葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。利用該試驗可區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。這兩個細菌在培養(yǎng)早期均產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH大約升至6。因此，此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。大腸桿菌為陽性（紅色），產(chǎn)氣腸桿菌為陰性（黃色）。

伏－普試驗用于測定某些細菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在堿性條件下能被空氣中的氧氣氧化成二乙酰。二乙酰與蛋白胨中的精氨酸的呱基作用，生成紅色化合物，即伏－普試驗陽性，不產(chǎn)生紅色化合物為反應(yīng)陰性。產(chǎn)氣腸桿菌為陽性，大腸桿菌為陰性。硫化氫試驗也是檢查腸道細菌的生化試驗。硫化氫試驗是檢測硫化氫的產(chǎn)生，也是用于腸道細菌檢查的常用生化試驗。有些細菌能分解含硫的有機物如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽等形成黑色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物，為硫化氫試驗陽性，可用于鑒別細菌。產(chǎn)氣腸桿菌為陽性，大腸桿菌為陰性。3糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道細菌的鑒定上尤為重要，不同的細菌含有發(fā)酵不同糖(醇)的酶，因此不同細菌在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、甲烷、二氧化碳等），有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。比如，大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，普通變形桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。糖發(fā)酵管含有蛋白胨、指示劑（溴甲酚紫）和不同的糖類。當發(fā)酵產(chǎn)酸時，溴甲酚紫指示劑可由紫色（pH6.8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5.2）。氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中有無氣泡來證明。2石蕊牛奶試驗（1）取2支石蕊牛奶培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。（2）用接種針分別穿刺接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌。（3）將接種后的試管置35℃培養(yǎng)24－48h。（4）觀察培養(yǎng)基顏色變化。石蕊在酸性條件下為粉紅色，堿性條件下為紫色，而被還原時為白色。3尿素試驗（1）取2支尿素培養(yǎng)基試管，用記號筆表面各管欲接種的菌名。（2）分別接種普通變形桿菌和金黃色葡萄球菌（兩種細菌對尿素的分解速度不同），需要觀察2次。（3）將接種后的試管置35℃培養(yǎng)24－48h。（4）觀察培養(yǎng)基顏色變化。

尿素酶存在時為紅色，無尿素酶時為黃色。（三）糖發(fā)酵試驗1在發(fā)酵管上標明所接種的細菌名稱。2取葡萄糖發(fā)酵管3支，分別接入大腸桿菌、普通變形桿菌，第三支不接種，作為對照，另取乳糖發(fā)酵管3支，同樣操作。3將接種和對照的發(fā)酵管置37℃培養(yǎng)24－48h。4觀察發(fā)酵管的顏色和有無氣泡。各試驗結(jié)果判定：（1）明膠水解試驗：明膠液化（＋），明膠不液化（－）（2）石蕊牛奶試驗：

酸性條件下粉紅色，堿性條件下紫色，被還原時白色。（3）尿素試驗：紅色為尿素酶陽性，黃色為尿素酶陰性葡萄球菌分解較慢，普通變形桿菌分解較快（4）糖發(fā)酵試驗：產(chǎn)酸為黃色,（＋）

普通變形桿菌，分解葡糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解乳糖；大腸桿菌分解乳糖和葡糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（5）硫化氫：培養(yǎng)基黑色為H2S陽性大腸桿菌陰性，產(chǎn)氣腸桿菌陽性（6）甲基紅:加入甲基紅試劑，紅色為陽性，黃色為陰性

大腸桿菌陽性，產(chǎn)氣腸桿菌陰性（7）伏－普試驗：先加甲液，再加等量乙液，用力振蕩，37℃溫箱中保溫15－30min。紅色為陽性，大腸桿菌陰性，產(chǎn)氣腸桿菌陽性

思考題1.為什么尿素實驗可用于鑒定