基因工程11大腸桿菌基因工程基因工程11大腸桿菌基因工程D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策大腸桿菌基因工程C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略B外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理A大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素2022/12/192D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策大腸桿菌基因工程C最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用2022/12/199強(qiáng)終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）2022/12/1910核糖體結(jié)合位點(diǎn)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它識(shí)別并與16SrRNA3’端的3’AUUCCUCC5’專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離重要而堿基組成不重要；在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處。基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基組成也較重要，這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)2022/12/1911大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：核糖體結(jié)合位生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量

在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用的自由能

如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量2022/12/1912生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性不同的生物，甚至同種生物不同的使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)的策略：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因2022/12/1913使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)的策略：外對(duì)于那些含有稀有密碼子出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個(gè)密碼子中，共含有22個(gè)精氨酸密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因2022/12/1914對(duì)于那些含有稀有密碼子出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道2022/12/1915質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前廣泛使用質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子pCP3PLMCSoriApr在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)粒拷貝數(shù)為60在42℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)粒拷貝數(shù)和基因的表達(dá)2022/12/1916質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建2022/12/1917C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)

在特定生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的工程菌大量合成異源蛋白質(zhì)，一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。此外包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。2022/12/1918包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)在特定生長(zhǎng)條件下以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅2022/12/1919以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。而這是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過(guò)30%。

如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。2022/12/1920包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作C

共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAAAAI

有效變復(fù)性過(guò)程中的中間狀態(tài)X

脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程，因此成為永遠(yuǎn)無(wú)活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人工變性和復(fù)性操作。2022/12/1921包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作C共價(jià)修飾的包涵體的溶解與變性：主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵；在人工條件下使蛋白溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑

鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)

混合溶劑

如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH

廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)2022/12/1922包涵體的溶解與變性：主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵；在人包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性使多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基重新折疊2022/12/1923包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作包涵體復(fù)性操作的方法包括：分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；?，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化2022/12/1924包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作包涵體復(fù)分泌型異源蛋白的表達(dá)表達(dá)的異源蛋白可通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。2022/12/1925分泌型異源蛋白的表達(dá)表達(dá)的異源蛋白可通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高

重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍。目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整

真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。若將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去。

2022/12/1926以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌并不多見(jiàn)。2022/12/1927分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的融合型異源蛋白的表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個(gè)開(kāi)放閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在融合蛋白中，受體細(xì)菌的蛋白通常位于N端，異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水平上設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以釋放回收異源蛋白。2022/12/1928融合型異源蛋白的表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高

尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離

利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達(dá)率高

與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件。

目的蛋白溶解性好

由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲得目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。2022/12/1929以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高尤其對(duì)分子融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體蛋白能高效表達(dá)，可通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)直接決定著融合蛋白的裂解工藝外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游。有時(shí)不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，以避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近，不利于目的蛋白分離回收兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架2022/12/1930融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）

維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構(gòu)象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）

促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2T外膜蛋白（OmpF）

促進(jìn)分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構(gòu)象2022/12/1931融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱目的蛋白的回收受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性；如果注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)。因此在生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：

化學(xué)斷裂法酶促裂解法

2022/12/1932目的蛋白的回收受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象目的蛋白的回收

用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高(可達(dá)到85%以上)，專一性強(qiáng)，且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法?；瘜W(xué)斷裂法：2022/12/1933目的蛋白的回收用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為目的蛋白的回收酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶

Arg-C葡萄球菌蛋白酶

Glu-C假單孢菌蛋白酶

Lys-C豬胰蛋白酶

Arg-C

Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，斷裂位點(diǎn)專一性強(qiáng)。在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段。但前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，而大分子量的異源蛋白含這三種氨基酸殘基的比率相當(dāng)高。ArgCNNC受體蛋白目的蛋白2022/12/1934目的蛋白的回收酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)

為克服單一殘基的蛋白酶的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭DNA片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此可廣泛用于回收各種目的蛋白。2022/12/1935目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)為克服單一殘基的目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目的基因MetStopIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收2022/12/1936目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目的基寡聚型異源蛋白的表達(dá)通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù),以提高目的蛋白產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。既增加外源基因劑量又能提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多個(gè)拷貝的外源基因串聯(lián)后克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代高拷貝載體僅含單拷貝外源基因的策略。2022/12/1937寡聚型異源蛋白的表達(dá)通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù),以提高目的蛋以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)?？截悢?shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以在一定程度上改善表達(dá)量穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的產(chǎn)物回收困難寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性2022/12/1938以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)粒寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：2022/12/1939寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegeneg整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的基因工程案例特別有意義目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償2022/12/1940整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)DNA體內(nèi)重組的基本原理在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，可能的生物學(xué)功能是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：

轉(zhuǎn)座因子依賴型同源序列依賴型2022/12/1941DNA體內(nèi)重組的基本原理在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)

在原核細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組。距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式2022/12/1942在原核細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因整合位點(diǎn)染色體DNA2022/12/1943同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)記基因+2022/12/1944同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建重組目的蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解的命運(yùn)。重組目的蛋白的不穩(wěn)定性源于對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。重組蛋白的半衰期可以通過(guò)序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞的改造加以控制。2022/12/1945蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建重組目的蛋白表達(dá)后都大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼。lon-的大腸桿菌突變株可使半衰期較短的細(xì)蛋白穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達(dá)的受體菌。蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon-）：2022/12/1946大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La

大腸桿菌中的熱休克蛋白可脅迫異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶降解較有利的構(gòu)象，從而提高異源蛋白對(duì)蛋白酶的敏感性。lon-htpR-的雙缺陷株非常適合高效表達(dá)不穩(wěn)定的重組異源蛋白。htpR基因缺陷的大腸桿菌受體（htpR-）：2022/12/1947大腸桿菌中的熱休克蛋白可脅迫異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶Asp離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。在蛋白質(zhì)C末端引入Asp，能顯著延長(zhǎng)半衰期?？沟鞍酌傅闹亟M異源蛋白序列的設(shè)計(jì)多肽鏈C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：2022/12/1948Asp離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。在蛋多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，穩(wěn)定性顯著改善。N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr，半衰期通常很短。尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是蛋白酶的超敏感區(qū)。多肽鏈N末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：2022/12/1949多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、CD基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略2022/12/1950D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）2022/12/1951基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)

以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：將parB基因引入表達(dá)型載體中，其產(chǎn)物可選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將致死性基因如sacB安裝在載體上2022/12/1952改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高2022/12/1953施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗控制目的基因的過(guò)量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子使用可控型復(fù)制子培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定2022/12/1954控制目的基因的過(guò)量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子使用可控型復(fù)制子培養(yǎng)基E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建2022/12/1955E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號(hào)肽B肽C肽A肽信號(hào)肽酶2022/12/1956胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽人胰島素的生產(chǎn)方法直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增多的糖尿病人的臨床需求。2022/12/1957人胰島素的生產(chǎn)方法直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模人胰島素的生產(chǎn)方法化學(xué)合成法制人胰島素根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個(gè)氨基酸從頭合成。這條化學(xué)全合成的路線從技術(shù)上來(lái)說(shuō)是能夠做到的，但生產(chǎn)成本奇高，限制了廣泛應(yīng)用。2022/12/1958人胰島素的生產(chǎn)方法化學(xué)合成法制人胰島素根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈人胰島素的生產(chǎn)方法化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素

豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個(gè)氨基酸的差異，豬的為Ala，人的為T(mén)hr，因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素不失為一種選擇。技術(shù)路線是：在pH為6-7的有機(jī)相中使胰蛋白酶催化其逆反應(yīng)，該酶在過(guò)量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來(lái)，所形成的胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素。該過(guò)程的總轉(zhuǎn)化率為60%。但工藝路線耗時(shí)，分離純化操作復(fù)雜，產(chǎn)品的價(jià)格不菲。2022/12/1959人胰島素的生產(chǎn)方法化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素豬的胰島基因工程法制人胰島素

1982年，美國(guó)ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。

上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒(méi)有任何區(qū)別，而且還具有無(wú)免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。2022/12/1960基因工程法制人胰島素1982年，美國(guó)ElyL重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：tactacb-Galb-GalApeptideBpeptideorioriAprAprMetMetMetMetMMNCMMNC化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列2022/12/1961重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法基因工表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線：MMNCMMNCb-Galb-GalABCNBr處理NCSSSSCNSSNCNCNCNCCys體外氧化和重折疊分離純化2022/12/1962表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線：MMNCMMNCb-Galb-GalAA鏈和B鏈分別表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：

由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低，通常只有10%-20%，因此采用這條工藝路線生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國(guó)ElyLiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。2022/12/1963A鏈和B鏈分別表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：由于A鏈和B第二種基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：tacb-GalCpeptideoriAprMetMetMMNCBpeptideApeptide人胰島素原cDNA重組人胰島素原轉(zhuǎn)化分離純化2022/12/1964第二種基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：tacb-GalCpeptid表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線：SSSSCN胰蛋白酶CpeptideApeptideBpeptideMRRKRCNBrRSSSSCNNCSSSSR羧肽酶BB鏈中第22位上的Arg和第29位上的Lys由于良好折疊的原因，對(duì)胰蛋白酶不敏感2022/12/1965表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線：SSSSCN胰蛋白酶Cpeptide生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：

在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于C肽的存在，胰島素原能形成良好的空間構(gòu)象，三對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)率也相應(yīng)提高，折疊率高達(dá)80%以上。雖然這條工藝路線并不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡(jiǎn)捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目前美國(guó)ElyLiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。2022/12/1966生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：在人胰島素原表達(dá)工藝中，由于CA鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法tacb-GaloriAprMetMetMMNCBpeptideApeptide化學(xué)合成AB鏈編碼序列重組人胰島素轉(zhuǎn)化分離純化CNBr處理特異性裂解體外折疊2022/12/1967A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法tacb-GaloriAprMetMet分泌型重組人胰島素表達(dá)法

上述路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，產(chǎn)生的融合蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。一種分泌策略是將編碼序列與b-內(nèi)酰胺酶基因拼接，b-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌具備穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的特性，為分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。2022/12/1968分泌型重組人胰島素表達(dá)法上述路線均采用胰島素或

結(jié)束語(yǔ)謝謝大家聆聽(tīng)?。?！69

結(jié)束語(yǔ)謝謝大家聆聽(tīng)！??！69基因工程11大腸桿菌基因工程基因工程11大腸桿菌基因工程D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策大腸桿菌基因工程C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略B外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理A大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素2022/12/1971D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策大腸桿菌基因工程C最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件最新基因工程11大腸桿菌基因工程課件強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來(lái)自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對(duì)于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用2022/12/1978強(qiáng)終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）2022/12/1979核糖體結(jié)合位點(diǎn)外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：位于翻譯起始密碼子上游的6-8個(gè)核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它識(shí)別并與16SrRNA3’端的3’AUUCCUCC5’專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動(dòng)翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)；SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離重要而堿基組成不重要；在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處?；蚓幋a區(qū)5’端若干密碼子的堿基組成也較重要，這一序列不能與mRNA的5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

核糖體結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)2022/12/1980大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個(gè)特征結(jié)構(gòu)要素：核糖體結(jié)合位生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對(duì)簡(jiǎn)并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛(ài)性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量

在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；而在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡(jiǎn)并密碼子占90%以上的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)密碼子與反密碼子相互作用的自由能

如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；細(xì)胞內(nèi)tRNA的含量2022/12/1981生物體對(duì)密碼子的偏愛(ài)性不同的生物，甚至同種生物不同的使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)的策略：外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因2022/12/1982使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)的策略：外對(duì)于那些含有稀有密碼子出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，選擇相關(guān)tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412個(gè)密碼子中，共含有22個(gè)精氨酸密碼子，其中7個(gè)AGG、2個(gè)AGA，而大腸桿菌受體細(xì)胞中tRNAAGG和tRNAAGA的豐度較低。為了提高人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個(gè)tRNA編碼基因克隆在另一個(gè)高表達(dá)的質(zhì)粒上。由此構(gòu)建的大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細(xì)胞對(duì)外源基因高效表達(dá)的制約作用。同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因2022/12/1983對(duì)于那些含有稀有密碼子出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前廣泛使用的表達(dá)型質(zhì)粒在每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中可達(dá)數(shù)百甚至上千個(gè)拷貝，質(zhì)粒的擴(kuò)增過(guò)程通常發(fā)生在受體細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)，正是細(xì)菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過(guò)度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢(shì)必會(huì)影響受體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴(kuò)增納入可控制的軌道2022/12/1984質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的影響目前廣泛使用質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子pCP3PLMCSoriApr在28℃時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為60在42℃時(shí)，拷貝數(shù)迅速增至300-600在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的CI基因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活因此，用一種手段同時(shí)控制質(zhì)?？截悢?shù)和基因的表達(dá)2022/12/1985質(zhì)粒拷貝數(shù)質(zhì)粒擴(kuò)增時(shí)序的控制pCP3擁有一個(gè)溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分泌型異源蛋白的表達(dá)融合型異源蛋白的表達(dá)寡聚型異源蛋白的表達(dá)整合型異源蛋白的表達(dá)蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建2022/12/1986C大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白的表達(dá)分包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)

在特定生長(zhǎng)條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無(wú)膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為包涵體（InclusionBodies，IB）。由高效表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的工程菌大量合成異源蛋白質(zhì)，一般情況下也以包涵體的形式存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。此外包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。2022/12/1987包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體及其性質(zhì)在特定生長(zhǎng)條件下以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離操作包涵體表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：包涵體的水難溶性及其密度遠(yuǎn)大于其它細(xì)胞碎片和細(xì)胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過(guò)高速離心即可將重組異源蛋白從細(xì)菌裂解物中分離出來(lái)能在一定程度上保持表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在形成包涵體之后，大腸桿菌的蛋白酶降解作用對(duì)異源重組蛋白的穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅2022/12/1988以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)能簡(jiǎn)化外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過(guò)有效的變性復(fù)性操作，才能回收得到具有正確空間構(gòu)象的目標(biāo)蛋白。而這是一個(gè)技術(shù)難題，尤其當(dāng)目標(biāo)蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時(shí)，體外復(fù)性蛋白質(zhì)的成功率相當(dāng)?shù)?，一般不超過(guò)30%。

如果未進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)（如分泌型表達(dá)或融合型表達(dá)），外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白量占細(xì)胞總蛋白量20%以上時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物一般傾向于形成包涵體。2022/12/1989包涵體表達(dá)形式的缺點(diǎn)：以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白喪失包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作C

共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)變性復(fù)性的動(dòng)力學(xué)原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAAAAI

有效變復(fù)性過(guò)程中的中間狀態(tài)X

脫離有效變復(fù)性過(guò)程而進(jìn)入集聚的中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)的蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)的蛋白質(zhì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價(jià)修飾的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入復(fù)性過(guò)程，因此成為永遠(yuǎn)無(wú)活性的蛋白質(zhì)。包涵體中的蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，因此需要在體外進(jìn)行人工變性和復(fù)性操作。2022/12/1990包涵體型異源蛋白的表達(dá)包涵體的變性與復(fù)性操作C共價(jià)修飾的包涵體的溶解與變性：主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵；在人工條件下使蛋白溶解并重新進(jìn)入復(fù)性途徑中。能有效促進(jìn)包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價(jià)，但影響復(fù)性和純化促溶劑

鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應(yīng)

混合溶劑

如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強(qiáng)極端pH

廉價(jià)，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)2022/12/1991包涵體的溶解與變性：主要任務(wù)是拆開(kāi)錯(cuò)配的二硫鍵和次級(jí)鍵；在人包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重折疊的主要任務(wù)是：通過(guò)次級(jí)鍵的形成使蛋白質(zhì)復(fù)性使多肽鏈中被拆開(kāi)的游離巰基重新折疊2022/12/1992包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體的復(fù)性與重包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作包涵體復(fù)性操作的方法包括：分段稀釋法，逐步降低變性劑的濃度，防止二次集聚的發(fā)生一步稀釋法，蛋白復(fù)性與濃度無(wú)關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大試劑添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法，氨基檸檬酸酐?；?，蛋白帶負(fù)電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法，將變性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侶法，GroEL、GroES、DnaK，固定化2022/12/1993包涵體的復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作包涵體復(fù)分泌型異源蛋白的表達(dá)表達(dá)的異源蛋白可通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于細(xì)胞周質(zhì)，甚至穿過(guò)外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列的存在是蛋白質(zhì)分泌的前提條件。2022/12/1994分泌型異源蛋白的表達(dá)表達(dá)的異源蛋白可通過(guò)運(yùn)輸或分泌方式定位于以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)定性高

重組人胰島素原若分泌到細(xì)胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細(xì)胞質(zhì)中的10倍。目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整

真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基，在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，N端的甲硫氨酸殘基往往不能被切除。若將外源基因與大腸桿菌的信號(hào)肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表達(dá)，N端的甲硫氨酸殘基便可在信號(hào)肽的剪切過(guò)程中被有效除去。

2022/12/1995以分泌形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)分泌表達(dá)形式的優(yōu)點(diǎn)：目的蛋白穩(wěn)分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)外源基因既便能分泌表達(dá)，但其表達(dá)率通常要比包涵體方式低很多，因此目前用于產(chǎn)業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌并不多見(jiàn)。2022/12/1996分泌表達(dá)形式的缺點(diǎn)：相對(duì)其它生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的融合型異源蛋白的表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，作為一個(gè)開(kāi)放閱讀框架進(jìn)行表達(dá)。由這種雜合基因表達(dá)出的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在融合蛋白中，受體細(xì)菌的蛋白通常位于N端，異源蛋白位于C端。通過(guò)在DNA水平上設(shè)計(jì)引入的蛋白酶切割位點(diǎn)或化學(xué)試劑特異性斷裂位點(diǎn)，可以釋放回收異源蛋白。2022/12/1997融合型異源蛋白的表達(dá)將外源基因與受體菌自身的蛋白質(zhì)編碼基因拼以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高

尤其對(duì)分子量較小的多肽效果更佳。目的蛋白易于分離

利用受體蛋白成熟的抗體、配體、底物進(jìn)行親和層析，可以快速獲得純度較高的融合蛋白。目的蛋白表達(dá)率高

與受體蛋白共用一套完善的表達(dá)元件。

目的蛋白溶解性好

由于受體蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好的空間構(gòu)象，且大多具有水溶性。目的蛋白需要回收

融合蛋白需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲得目的蛋白。在實(shí)際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要的成本往往就在該工段。2022/12/1998以融合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白穩(wěn)定性高尤其對(duì)分子融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體蛋白能高效表達(dá)，可通過(guò)親和層析進(jìn)行特異性簡(jiǎn)單純化兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)直接決定著融合蛋白的裂解工藝外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因的下游。有時(shí)不需要完整的受體結(jié)構(gòu)基因，以避免融合蛋白分子中兩種組份的分子量過(guò)于接近，不利于目的蛋白分離回收兩個(gè)蛋白編碼序列應(yīng)保持一致的翻譯閱讀框架2022/12/1999融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建原則：受體融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）

維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構(gòu)象pTrxFus麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）

促進(jìn)分泌金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2T外膜蛋白（OmpF）

促進(jìn)分泌b-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構(gòu)象2022/12/19100融合型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建用于融合蛋白構(gòu)建的受體蛋白：谷胱目的蛋白的回收受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象和生物活性；如果注入人體還會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)。因此在生產(chǎn)藥用目的蛋白時(shí)，將融合蛋白中的受體蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法有兩種：

化學(xué)斷裂法酶促裂解法

2022/12/19101目的蛋白的回收受體蛋白部分的存在可能會(huì)影響目的蛋白的空間構(gòu)象目的蛋白的回收

用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中的甲硫氨酸殘基側(cè)鏈的硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水的作用下肽鍵斷裂，形成兩個(gè)多肽降解片段其中上游肽段的甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端的第一位氨基酸殘基保持不變。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是回收率高(可達(dá)到85%以上)，專一性強(qiáng)，且所產(chǎn)生的目的蛋白的N端不含甲硫氨酸，與真核生物細(xì)胞中的成熟表達(dá)產(chǎn)物較為接近。然而，如果異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法。化學(xué)斷裂法：2022/12/19102目的蛋白的回收用于蛋白位點(diǎn)專一性化學(xué)斷裂的最佳試劑為目的蛋白的回收酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶

Arg-C葡萄球菌蛋白酶

Glu-C假單孢菌蛋白酶

Lys-C豬胰蛋白酶

Arg-C

Lys-C蛋白酶酶促裂解法的特點(diǎn)是斷裂效率更高，斷裂位點(diǎn)專一性強(qiáng)。在多肽鏈中的精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開(kāi)酰胺鍵，形成不含上述殘基的下游斷裂肽段。但前提條件是外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，而大分子量的異源蛋白含這三種氨基酸殘基的比率相當(dāng)高。ArgCNNC受體蛋白目的蛋白2022/12/19103目的蛋白的回收酶促裂解法：?jiǎn)螝埢稽c(diǎn)蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)梭菌蛋目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)

為克服單一殘基的蛋白酶的應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子的外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）的人工接頭DNA片段，該寡肽為具有蛋白酶活性的凝血因子X(jué)a的識(shí)別和作用序列，其斷裂位點(diǎn)在Arg的C末端。純化后的融合蛋白用Xa處理，即可獲得目的蛋白。由于Xa的識(shí)別作用序列由四個(gè)氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列的概率極少，因此可廣泛用于回收各種目的蛋白。2022/12/19104目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)為克服單一殘基的目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目的基因MetStopIle-Glu-gly-ArgIle-Glu-gly-Arg表達(dá)親和層析酶解回收2022/12/19105目的蛋白的回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)啟動(dòng)子受體基因接頭目的基寡聚型異源蛋白的表達(dá)通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù),以提高目的蛋白產(chǎn)量往往不能獲得滿意的效果。既增加外源基因劑量又能提高目標(biāo)蛋白產(chǎn)量的有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表達(dá)載體，即將多個(gè)拷貝的外源基因串聯(lián)后克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上，以取代高拷貝載體僅含單拷貝外源基因的策略。2022/12/19106寡聚型異源蛋白的表達(dá)通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù),以提高目的蛋以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)粒拷貝數(shù)的前提下，增加目的基因的拷貝數(shù)，可以在一定程度上改善表達(dá)量穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽短肽由于缺乏有效的空間結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌細(xì)胞中的半衰期較短。串聯(lián)短肽具有與蛋白質(zhì)相似的長(zhǎng)度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解的能力大幅度提高目的產(chǎn)物回收困難寡聚短肽需要裂解和進(jìn)一步分離，才能獲最終分子，但裂解后的短肽分子容易出現(xiàn)序列不均一性2022/12/19107以寡聚形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的蛋白高效表達(dá)在不提高質(zhì)粒寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：2022/12/19108寡聚型目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建PSDgenegenegeneg整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)定表達(dá)整合型的目的基因隨受體細(xì)胞染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制，相當(dāng)穩(wěn)定，工程菌在沒(méi)有選擇壓力存在下可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達(dá)盒，這對(duì)以改良物種遺傳性狀為目的基因工程案例特別有意義目的基因表達(dá)率低單拷貝整合的目的基因表達(dá)率受到限制，此時(shí)可通過(guò)強(qiáng)化表達(dá)元件而加以補(bǔ)償2022/12/19109整合型異源蛋白的表達(dá)以整合形式表達(dá)目的蛋白的優(yōu)缺點(diǎn)目的基因穩(wěn)DNA體內(nèi)重組的基本原理在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，廣泛存在著DNA的遺傳重組機(jī)制，可能的生物學(xué)功能是促進(jìn)生物種群的進(jìn)化。細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組可分為兩大類：

轉(zhuǎn)座因子依賴型同源序列依賴型2022/12/19110DNA體內(nèi)重組的基本原理在生物體細(xì)胞尤其是原核細(xì)菌細(xì)

在原核細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組。距離越遠(yuǎn)、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、同源性越高，重組的頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式同源序列依賴型的體內(nèi)重組：基本形式2022/12/19111在原核細(xì)胞中，染色體DNA鏈上的兩個(gè)同源區(qū)之間可發(fā)生同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因整合位點(diǎn)染色體DNA2022/12/19112同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源整合ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記基因交換區(qū)域染色體DNAori標(biāo)記基因+2022/12/19113同源序列依賴型的體內(nèi)重組：同源交換ori目的基因同源區(qū)域標(biāo)記蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建重組目的蛋白表達(dá)后都會(huì)面臨被降解的命運(yùn)。重組目的蛋白的不穩(wěn)定性源于對(duì)受體細(xì)胞蛋白酶系統(tǒng)的敏感性。重組蛋白的半衰期可以通過(guò)序列的人工設(shè)計(jì)以及受體細(xì)胞的改造加以控制。2022/12/19114蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建重組目的蛋白表達(dá)后都大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La和Ti降解的，兩者分別由lon和clp基因編碼。lon-的大腸桿菌突變株可使半衰期較短的細(xì)蛋白穩(wěn)定性大增，因此被廣泛用作外源基因高效表達(dá)的受體菌。蛋白酶缺陷型受體細(xì)胞的改造lon基因缺陷的大腸桿菌受體（lon-）：2022/12/19115大多數(shù)不穩(wěn)定的重組目的蛋白是被大腸桿菌中的蛋白酶La

大腸桿菌中的熱休克蛋白可脅迫異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶降解較有利的構(gòu)象，從而提高異源蛋白對(duì)蛋白酶的敏感性。lon-htpR-的雙缺陷株非常適合高效表達(dá)不穩(wěn)定的重組異源蛋白。htpR基因缺陷的大腸桿菌受體（htpR-）：2022/12/19116大腸桿菌中的熱休克蛋白可脅迫異源蛋白形成一種對(duì)蛋白酶Asp離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。在蛋白質(zhì)C末端引入Asp，能顯著延長(zhǎng)半衰期。抗蛋白酶的重組異源蛋白序列的設(shè)計(jì)多肽鏈C末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：2022/12/19117Asp離C末端越近，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性就越大。在蛋多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，穩(wěn)定性顯著改善。N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr，半衰期通常很短。尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是蛋白酶的超敏感區(qū)。多肽鏈N末端氨基酸序列對(duì)穩(wěn)定性的影響：2022/12/19118多肽鏈的N末端序列中含有較高比例的Ala、Asn、CD基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略2022/12/19119D基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式

基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式：結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失分配不穩(wěn)定性整個(gè)重組DNA分子從受體細(xì)胞中逃逸（curing）2022/12/19120基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機(jī)制工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)

以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：將parB基因引入表達(dá)型載體中，其產(chǎn)物可選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞正確設(shè)置載體上的多克隆位點(diǎn)，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將致死性基因如sacB安裝在載體上2022/12/19121改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略改進(jìn)載體受體系統(tǒng)以增大施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素根據(jù)載體上的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高2022/12/19122施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗控制目的基因的過(guò)量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子使用可控型復(fù)制子培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定2022/12/19123控制目的基因的過(guò)量表達(dá)使用可控型啟動(dòng)子使用可控型復(fù)制子培養(yǎng)基E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素的生產(chǎn)方法重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建2022/12/19124E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異性肽酶NC信號(hào)肽B肽C肽A