第四章

工業(yè)生物催化劑小組成員：陳麗蘭、楊歡、祁海平、葉欣、劉文虎第四章

工業(yè)生物催化劑小組成員：陳麗蘭、楊歡、祁海平、葉欣、Contents4.1概述

4.2酶制劑工業(yè)

4.3工業(yè)酶制劑的應用

4.4酶制劑的改性和提高4.5工業(yè)生物催化的前景4.6參考文獻

Contents4.1概述4.2酶制劑工業(yè)4.3工1.1生物催化劑的概念

生物催化劑是由生物合成的具有催化作用的物質。

現(xiàn)階段工業(yè)上應用的生物催化劑包括生物體（微生物）和酶類。

微生物是最常用的活細胞催化劑,酶催化劑則是從細胞中提取出來的,只在經濟合理時才被應用。1概述1.1生物催化劑的概念1概述1.2生物催化劑與化學催化劑的比較與傳統(tǒng)的化學催化劑相比，生物催化劑具有的優(yōu)點：（1）常溫常壓、近于中性條件下進行，因而投資少、能耗低、操作安全；（2）極高的催化效率和反應速度，比化學催化劑的催化效率高107～1013倍；（3）高度專一性（包括底物專一性和立體專一性），能有效催化一般化學催化劑難以催化的手性反應；（4）本身是微生物和蛋白質，易于生物降解，是理想的綠色催化劑缺點：（1）穩(wěn)定性較差（易受熱、受某些化學物質及雜菌的破壞而失活）；（2）反應時對溫度和pH范圍要求較高。1概述1.2生物催化劑與化學催化劑的比較1概述1.3工業(yè)生物催化劑應用現(xiàn)狀

生物催化應用于大規(guī)模工業(yè)生產是從20世紀60年代開始的，在幾十年的發(fā)展過程中，工業(yè)生物催化取得了長足的進步，利用生物技術生產的工業(yè)產品逐年增加。典型產品：1概述1.3工業(yè)生物催化劑應用現(xiàn)狀1概述2.1酶的幾種主要生產方法（1）提取法提取分離法是采用各種提取、分離、純化技術從動植物的組織、器官、細胞或微生物細胞中將酶提取出來。酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。主要的提取方法有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等。2酶制劑工業(yè)2.1酶的幾種主要生產方法2酶制劑工業(yè)（1）提取法提取分離法的特點：①設備較簡單；②操作較方便；③來源受到限制，不適于大規(guī)模的工業(yè)生產。（動植物的生產周期長易受地理、氣候和季節(jié)等因素的影響。）20世紀50年代以后，隨著發(fā)酵技術的發(fā)展，許多酶都采用生物合成法進行生產。然而，在動、植物或微生物的組織、細胞中提取所需的酶，仍然有其使用價值，至今仍然使用。例如，從動物的胰臟中提取分離胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶；從檸檬酸發(fā)酵后得到的黑曲霉菌體中提取分離果膠酶等。2.1酶的幾種主要生產方法（1）提取法2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法生物合成法生產用酶首先要經過篩選、誘變、細胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產物工程菌。然后在生物反應器中進行細胞培養(yǎng)，通過細胞反應條件優(yōu)化，再經過分離純化得到人們所需的酶。利用微生物細胞的生命活動獲得所需酶的方法又稱為發(fā)酵法，根據(jù)細胞培養(yǎng)方式的不同，發(fā)酵法可以分為液體深層發(fā)酵、固體培養(yǎng)發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵、固定化原生質體發(fā)酵等?，F(xiàn)在普遍使用的是液體深層發(fā)酵技術。2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法2.1酶的幾種主要生產方法2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法酶的工藝生產過程：①原料選擇；②菌種選育和發(fā)酵（固體培養(yǎng)與液體深層培養(yǎng)法）；③酶制劑生產的下游工程。2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法第五章-工業(yè)生物催化劑課件2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法發(fā)酵制取酶制劑的優(yōu)點：①種類繁多,凡是動植物體內有的酶幾乎都能從微生物中找到,并可根據(jù)應用特點和要求,篩選出最佳的產酶菌株；②繁殖快,發(fā)酵周期短,培養(yǎng)簡便,能通過控制培養(yǎng)條件大幅度提高酶的產量；③微生物具有較強的適應能力,可采用各種遺傳變異手段,培育出新的、更理想菌株。2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法（3）化學制取法

包括酶的化學全合成、酶類似物和模擬酶的化學合成?；瘜W合成法證明了酶等的化學本質是蛋白質,也說明人們可以通過化學的方法在實驗室中合成包括酶在內的各種生命物質?；瘜W制取法和提取法一樣，由于原料來源受限制,生產成本高,污染環(huán)境,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產。2.1酶的幾種主要生產方法（3）化學制取法2.1酶的幾種主要生產方法2.2提高酶產量的措施（1）添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類：酶的作用底物酶的催化反應產物作用底物的類似物2.2提高酶產量的措施（1）添加誘導物2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度據(jù)阻遏作用機理不同，可分為：產物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。①產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。②分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產量的有效措施。2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。

對于受代謝途徑末端產物阻遏的酶，可以通過控制末端產物的濃度的方法使阻遏解除。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度采用其他較難利2.2提高酶產量的措施（3）添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、曲通(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產中添加到培養(yǎng)基中。

2.2提高酶產量的措施（3）添加表面活性劑2.2提高酶產量的措施（4）添加產酶促進劑產酶促進劑是指可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。在酶的發(fā)酵生產過程中，添加適宜的產酶促進劑，往往可以顯著提高酶的產量。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1～20倍,添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產量。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗確定所添加的產酶促進劑的種類和濃度。2.2提高酶產量的措施（4）添加產酶促進劑2.3酶活性測定酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。酶活性是研究酶的特性、分離純化以及酶制劑生產和應用時的一項不可缺少的指標。

酶活性是用在一定條件下，它所催化某一反應的反應初速度來表示。

酶反應速度（指速初度）可用單位時間內單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。其單位為mol/s。2.3酶活性測定酶活性，是指酶催化一定化學反應的能2.3酶活性測定酶活性的測定方法：酶活性與底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑、抑制劑的濃度以及緩沖液的種類和濃度都密切相關。酶活性測定可用終止反應法或連續(xù)反應法。終止反應法是將酶反應按時間即刻完全停止，取出反應物或產物，予以分離，再確定反應物的消耗量，或產物的形成量，算出酶活性。連續(xù)反應法無需終止反應而是在酶反應過程中用光學儀器來監(jiān)測反應進行情況。其中以光譜吸收的變化更為準確。2.3酶活性測定酶活性的測定方法：2.4酶的提煉（1）酶溶液的制取酶溶液制備包括三個過程的工作：①材料預處理和破碎細胞；②抽提；③抽提液的濃縮。酶蛋白的分布：胞外酶、胞內酶（溶酶、結酶）2.4酶的提煉（1）酶溶液的制取第五章-工業(yè)生物催化劑課件2.4酶的提煉（2）根據(jù)分子大小輕重建立的分離純化方法①透析和超過濾；②離心分離；③凝膠過濾等。2.4酶的提煉（2）根據(jù)分子大小輕重建立的分離純化方法2.4酶的提煉（3）調節(jié)溶解度的分離方法調整溶解度的分離方法是根據(jù)酶和雜蛋白質在溶解度性質上不同而建立的一些方法。①鹽析法；②有機溶劑沉淀法；③共沉淀法；④選擇性沉淀法等。2.4酶的提煉（3）調節(jié)溶解度的分離方法2.4酶的提煉（4）按分子電荷的正負多少設計的分離方法分子荷正電多的物質，與荷負電性的物質反應強，受負電場的影響大；荷負電性多的物質正相反。①吸附交換分離法；②電泳分離法；③聚焦層析法等。2.4酶的提煉（4）按分子電荷的正負多少設計的分離方法2.4酶的提煉（5）根據(jù)親和作用建立的純化方法由于酶對底物、競爭性抑制劑、捕酶等配體具有較高的親和力，而其他雜蛋白對它們沒有或有很弱的親和作用。因此，可以根據(jù)酶、雜蛋白對配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來。已建立的方法有親和層析、親和電泳法等。2.4酶的提煉（5）根據(jù)親和作用建立的純化方法2.4酶的提煉（6）其他根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分離純化方法：熱變性法、酸堿變化法和表面變性法等。蛋白質(酶)的高效液相色譜分離分析法。2.4酶的提煉（6）其他2.5固定化酶以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的近一步發(fā)展。60年代以后，在酶學研究領域內涌現(xiàn)出固定化酶。

它是通過物理的或化學的手段，將酶束縛于水不溶的載體上、或將酶束縛在一定的空間內，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用。2.5固定化酶以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這2.5固定化酶（1）酶的固定化方法：①吸附法；②包埋法；③共價鍵結合法；④交聯(lián)法。2.5固定化酶（1）酶的固定化方法：第五章-工業(yè)生物催化劑課件2.5固定化酶（2）固定化酶的性質酶活性變化：與其溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。（原因：酶與不溶性載體相結合引起結構發(fā)生了變化；酶活性中心的重要氨甚酸殘基與載體相結合。）穩(wěn)定性變化：大多數(shù)酶在固定化后都不同程度地提高了穩(wěn)定性，延長了有效壽命。（原因：固定化增加了酶構象的牢固程度。擋住了不利因素對酶的侵襲。限制了酶分子間的相互作用。但是，如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導致酶穩(wěn)定性下降。）最適pH的變化最適溫度的變化動力學常數(shù)的變化2.5固定化酶（2）固定化酶的性質2.6固定化酶反應器（1）固定化酶反應器的類型①間歇式酶反應器（BatchReactor，BSTR）底物與酶一次性投入反應器內，產物一次性取出；反應完成后，固定化酶用過濾或超濾法回收，再轉入下一批反應。優(yōu)點：裝置較簡單，造價較低，傳質阻力很小，反應能迅速達到穩(wěn)態(tài)。缺點：操作麻煩，酶經多次反復回收使用后易失去活性，工業(yè)上很少用于固定化酶，常用于游離酶。2.6固定化酶反應器（1）固定化酶反應器的類型2.6固定化酶反應器②連續(xù)攪拌釜式反應器（ContinuousStirredTandReactor，CSTR）向反應器投入團定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應達到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流人底物溶液，同時，以相同流速輸出反應液(含產物)。優(yōu)點：在理想狀況下，混合良好，各部位組成相同，并與輸出成分一致。缺點：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損問定化酶顆粒。2.6固定化酶反應器②連續(xù)攪拌釜式反應器（Continuo2.6固定化酶反應器③填充床反應器（PackedBedReactor，PBR）將固定化酶填充于反應器內，制成穩(wěn)定的柱床，然后通入底物溶液，在一定的反應條件下實現(xiàn)酶催化反應，以一定的流速，收集輸出的轉化液(含產物)。優(yōu)點：高效率、易操作、結構簡單等，因而是目前工業(yè)生產及研究中應用最為普遍的反應器。缺點：傳質系數(shù)和傳熱系數(shù)相對較低。當?shù)孜锶芤汉腆w顆?；蝠ざ群艽髸r，不宜采用PBR。④其他流化床反應器（FluidizedBedReactor，F(xiàn)BR）；連續(xù)攪拌罐-超濾膜反應器（CSTR-UFR）等。2.6固定化酶反應器③填充床反應器（PackedBed2.6固定化酶反應器（2）固定化酶反應器的選擇影響酶反應器選擇的因素很多．但一般從以下幾個方面考慮：固定化酶的形狀；底物的物理性質；酶反應動力學特性；酶的穩(wěn)定性；操作要求及反應器本身的代價等。2.6固定化酶反應器（2）固定化酶反應器的選擇3工業(yè)酶制劑的應用3.11,3-丙二醇1,3-丙二醇（1,3-propanediol，PDO）是一種重要的化工原料，由PDO合成的聚酯如聚對苯二甲酸二醇酯（PTT）等具有良好的性能和廣闊的工業(yè)化前景。

主要用途：①作為產品中的組分提高產品性能，如化妝品、抗凍劑等；②作為醫(yī)藥和有機合成的中間體用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)，如合成增塑劑、防腐劑、乳化劑、香味增強劑等；③作為單體用于合成聚酯和聚氨酯，是PDO最重要的用途。3工業(yè)酶制劑的應用3.11,3-丙二醇3工業(yè)酶制劑的應用（1）1,3-丙二醇的化學合成方法PDO有多種合成方法，主要由環(huán)氧乙烷羰基化法和丙烯醛水解法。①環(huán)氧乙烷（EO）羰基化法EO+CO+2H2→PDO

反應壓力大，裝置投資較大。

②丙烯醛水解法CH2=CHCHO+H20→HOCH2CH2CHOHOCH2CH2CHO+H2→HOCH2CH2CH2OH丙烯醛本身也是一種重要的有機中間體，且屬劇毒、易燃、易爆物品，難以儲存和運輸。3工業(yè)酶制劑的應用（1）1,3-丙二醇的化學合成方法3工業(yè)酶制劑的應用（2）1,3-丙二醇的發(fā)酵法以葡萄糖為底物經由甘油生產，技術中使用克隆了肺炎克雷伯菌中的dha調節(jié)因子的大腸桿菌（基因工程菌）。由甘油到PDO反應的過程中，一部分底物甘油通過還原途徑，經甘油脫水酶和PDO氧化還原酶催化，得到PDO；另一部分甘油通過氧化途徑供菌體生長需要，并提供還原所需的NADH2。催化過程需要與菌體生長耦合在一起的多個酶協(xié)調作用，并且菌體在具有生物活性的時候，才能保證足夠的還原當量和一些輔酶的再生，最終保證催化反應的順利進行。3工業(yè)酶制劑的應用（2）1,3-丙二醇的發(fā)酵法第五章-工業(yè)生物催化劑課件3工業(yè)酶制劑的應用3.2L-異亮氨酸異亮氨酸(2-amino-3-methylvalericacid)由Ehrlich于1904年首次從甜菜糖漿中分離出來,其化學組成雖與亮氨酸相同,但理化性質各異,故命名為異亮氨酸。

異亮氨酸有4種光學異構體,自然界中存在的僅為L-異亮氨酸。作為人體必需的8種氨基酸之一,成年人每天需要從外界攝取20mg/kg(體重)的L-異亮氨酸。L-異亮氨酸是合成人體激素、酶類的原料,具有促進蛋白質合成和抑制其分解的效果,在人體生命活動中起著重要作用,因此,在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應用及商業(yè)價值。3工業(yè)酶制劑的應用3.2L-異亮氨酸3工業(yè)酶制劑的應用（1）L-異亮氨酸的生產方法L-異亮氨酸的生產方法有提取法、化學合成法、發(fā)酵法。提取法和化學合成法由于原料來源受限制,生產成本高,污染環(huán)境,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產。微生物發(fā)酵法生產L-異亮氨酸具有原料成本低,反應條件溫和,容易實現(xiàn)大規(guī)模生產等優(yōu)點,是目前生產L-異亮氨酸最主要的方法。

L-異亮氨酸發(fā)酵有添加前體發(fā)酵（又稱微生物轉化法）和直接發(fā)酵-種方法。3工業(yè)酶制劑的應用（1）L-異亮氨酸的生產方法3工業(yè)酶制劑的應用（2）L-異亮氨酸的生物合成途徑以葡萄糖為原料生物合成L-異亮氨酸涉及到EMP、HMP、TCA、乙醛酸循環(huán)、伍德沃克曼反應,以及蘇氨酸合成水平和分支鏈氨基酸合成水平的調控制,其生物合成途徑如圖1所示。

3工業(yè)酶制劑的應用（2）L-異亮氨酸的生物合成途徑第五章-工業(yè)生物催化劑課件3工業(yè)酶制劑的應用3.3酶制劑的其他工業(yè)應用（1）果葡糖漿（2）丙烯酰胺（3）手性化合物等3工業(yè)酶制劑的應用3.3酶制劑的其他工業(yè)應用4酶制劑的改性和提高4.1改性的目的、意義隨著丙烯酰胺、長鏈二元酸等大宗產品逐漸走向市場，許多關于生物催化技術的探索研究也廣泛地開展起來，并在一些領域取得了可喜成果。

但是，目前工業(yè)酶催化的生產過程還是比較有限，主要原因在于：①酶的種類少；②目前酶的活性、耐溫性、耐酸堿變化等性能比較差。利用生物技術對現(xiàn)有的酶進行改性研究，提高酶的活性和耐久性，拓寬了工業(yè)生物催化劑應用的領域，使其更有工業(yè)應用前景。近年來，這方面工作的研究主要集中在極端菌的探索，非水相酶的研究以及分子水平的定向進化、合理化設計等。

4酶制劑的改性和提高4.1改性的目的、意義4.2改性的手段（1）極端菌的研究近年來，人們發(fā)現(xiàn)一些菌在高溫、寒冷、強酸堿、高鹽濃度、高壓等一般生物無法生存的極端條件下任然可以生存，這些菌統(tǒng)稱為極端菌。對這些極端菌進行研究，有望逐步解決工業(yè)微生物對溫度和環(huán)境依賴性等缺陷，增強在工業(yè)上的應用前景。

極端菌包括嗜高溫菌、嗜低溫菌、嗜鹽菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜壓菌等。4.2改性的手段（1）極端菌的研究4.2改性的手段（1）極端菌的研究嗜高溫菌目前在工業(yè)上可以有兩種用途：一是利用菌體產生的酶進行高溫下的反應。如嗜熱古細菌Thermusaquoticus中分離出來得TaqDNA聚合酶可以用于PCR技術。二是利用菌體發(fā)酵。如用極端嗜熱菌生產乙醇，在高溫下進行這一反應，可以把生產和分離結合起來，消除乙醇的產物抑制作用。

其他極端菌在發(fā)現(xiàn)地和結構上也各有特點，決定了它們的不同工業(yè)用途。如由于嗜鹽菌在高鹽濃度下穩(wěn)定，它可用作低含水體系的催化劑。4.2改性的手段（1）極端菌的研究4.2改性的手段（1）極端菌的研究另一方面，利用基因工程技術將極端微生物特殊功能基因片段轉入一般微生物體內或將一般微生物特異基因片段導入極端微生物中，從而改造受體的生理功能，甚至創(chuàng)造新的物種也是一種很好利用極端菌的方法。4.2改性的手段（1）極端菌的研究4.2改性的手段（2）非水相酶催化水是酶促反應最常用的反應介質。但對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物（底物）在水介質中難溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應的發(fā)生。是否存在非水介質能保證酶催化？4.2改性的手段（2）非水相酶催化但對于大多數(shù)有機化合物來說4.2改性的手段（2）非水相酶催化1984年，克利巴諾夫（Klibanov）等人在有機介質中進行了酶催化反應的研究，他們成功地在利用酶有機介質中的催化作用，獲得酯類、肽類、手性醇等多種有機化合物，明確指出酶可以在水與有機溶劑的互溶體系中進行催化反應。4.2改性的手段（2）非水相酶催化4.2改性的手段（2）非水相酶催化酶非水相催化的幾種類型：有機介質中的酶催化氣相介質中的酶催化超臨界介質中的酶催化離子液介質中的酶催化4.2改性的手段（2）非水相酶催化4.2改性的手段（2）非水相酶催化酶在有機介質中由于水分子的減少，相對來說酶分子的構象表現(xiàn)出比水溶液中更具有“剛性”特點。因而使通過選擇不同性質的溶劑來調控酶的某些特性成為可能。例如在有機溶劑中，可以利用酶與配體的相互作用性質，誘導改變酶分子的構象，調控酶的底物專一性,、立體選擇性和手性選擇性等。由于引起酶變性的許多因素都與水的存在有關,因此在有機介質中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。由于有機溶劑的存在,水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和?；D移等。在有機介質中進行的酶促反應，可以省略產物的萃取分離過程,提高收率。4.2改性的手段（2）非水相酶催化酶在有機介質中由于水分子的4.3酶改性的兩種方法（1）合理設計基于對蛋白質結構、功能和機制的詳細了解，可以預先思考出氨基酸序列精確地改變，然后通過定點突變的方法引入這些改變。優(yōu)點：能優(yōu)化所需的性質，極大地提高對于酶結構與催化機制的認識。缺點：由于對提高酶性質的內在機制不夠了解等原因，多數(shù)的實驗是失敗的。4.3酶改性的兩種方法（1）合理設計4.3酶改性的兩種方法（2）定向進化定向進化不需要關于酶結構與功能關系的認識，采用一種隨機的過程產生一個巨大的變異基因庫，然后通過基因選擇或者高通量的篩選方法確定出具有性質改善的變異型。模擬自然進化的關鍵步驟——突變、重組和篩選，在較短時間內完成漫長的自然進化過程，有效改造蛋白質，使之適于人類需要。4.3酶改性的兩種方法（2）定向進化4.3酶改性的兩種方法（3）合理設計與定向進化的比較合理設計定向進化蛋白質結構的知識需要不需要對于機理的了解需要不需要點突變傾斜沒有偏向轉變二級結構設計可實行不可實行功能區(qū)設計可實行不可實行靈敏的酶的檢定需要不需要選擇方案不需要需要4.3酶改性的兩種方法（3）合理設計與定向進化的比較合理設計5工業(yè)生物催化的前景隨著科研工作的進一步開展以及各方面的努力，工業(yè)生物催化將得到迅速發(fā)展，預期在20年內，工業(yè)生物催化將有望實現(xiàn)以下突破：（1）在與生物生長代謝相關的有機化學品生產上，取代化學法成為主流生產工藝；（2）開發(fā)出利用生物法生產的安全、環(huán)保、節(jié)能新產品，引導消費取向和潮流；（3）原料消耗、水資源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和擴散減少30%；（4）對于生物催化體系，可以研制出比現(xiàn)在應用的化學催化劑效率更高、價格更低廉的生物催化劑。5工業(yè)生物催化的前景隨著科研工作的進一步開展以及各5工業(yè)生物催化的前景

生物催化的廣泛應用，將會給人們提供性能更佳的材料與能源。以可再生的生物原料為基礎的生物生產過程，將逐步取代化石原料生產過程，成為新世紀化工生產的主體，從而實現(xiàn)綠色化工、綠色生產的目標。5工業(yè)生物催化的前景生物催化的廣泛應用，將會給人們6參考文獻1歐陽平凱.發(fā)酵工程關鍵技術及其應用.北京:化學工業(yè)出版社,20052徐鳳彩.酶工程.北京:中國農業(yè)出版社,20013楊昌鵬.酶制劑生產與應用.北京:中國環(huán)境科學出版社,20064張宏蕊等.發(fā)酵產1,3-丙二醇的關鍵酶研究進展.化學與生物工程[J],2011.28(3)

:1-35師文靜等.生物轉化法生產1,3-丙二醇的技術進展.精細與專用化學品[J],2010.18（4）：32-356李光霞等發(fā)酵法生產L-異亮氨酸的研究進展食品與發(fā)酵工業(yè)，2006.32（1）：57-607林章凜.工業(yè)生物催化技術.生物加工過程[J],2003.5:12-168劉海洲等.生物催化劑的應用與篩選研究進展.化學工業(yè)與工程技術[J],2005.8:21-239張光亞等.生物催化劑的發(fā)現(xiàn)及改造.生命的化學[J],2006.26(3):258-26110王強.中國生物技術產業(yè)發(fā)展報告（2003）.北京：化學工業(yè)出版社，200411陳石根.酶學.上海:復旦大學出版社，200112羅立新.酶制劑技術.北京:化學工業(yè)出版社,20086參考文獻1歐陽平凱.發(fā)酵工程關鍵技術及其應用.北京:化學工謝謝。謝謝。第四章

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4.2酶制劑工業(yè)

4.3工業(yè)酶制劑的應用

4.4酶制劑的改性和提高4.5工業(yè)生物催化的前景4.6參考文獻

Contents4.1概述4.2酶制劑工業(yè)4.3工1.1生物催化劑的概念

生物催化劑是由生物合成的具有催化作用的物質。

現(xiàn)階段工業(yè)上應用的生物催化劑包括生物體（微生物）和酶類。

微生物是最常用的活細胞催化劑,酶催化劑則是從細胞中提取出來的,只在經濟合理時才被應用。1概述1.1生物催化劑的概念1概述1.2生物催化劑與化學催化劑的比較與傳統(tǒng)的化學催化劑相比，生物催化劑具有的優(yōu)點：（1）常溫常壓、近于中性條件下進行，因而投資少、能耗低、操作安全；（2）極高的催化效率和反應速度，比化學催化劑的催化效率高107～1013倍；（3）高度專一性（包括底物專一性和立體專一性），能有效催化一般化學催化劑難以催化的手性反應；（4）本身是微生物和蛋白質，易于生物降解，是理想的綠色催化劑缺點：（1）穩(wěn)定性較差（易受熱、受某些化學物質及雜菌的破壞而失活）；（2）反應時對溫度和pH范圍要求較高。1概述1.2生物催化劑與化學催化劑的比較1概述1.3工業(yè)生物催化劑應用現(xiàn)狀

生物催化應用于大規(guī)模工業(yè)生產是從20世紀60年代開始的，在幾十年的發(fā)展過程中，工業(yè)生物催化取得了長足的進步，利用生物技術生產的工業(yè)產品逐年增加。典型產品：1概述1.3工業(yè)生物催化劑應用現(xiàn)狀1概述2.1酶的幾種主要生產方法（1）提取法提取分離法是采用各種提取、分離、純化技術從動植物的組織、器官、細胞或微生物細胞中將酶提取出來。酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程。主要的提取方法有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等。2酶制劑工業(yè)2.1酶的幾種主要生產方法2酶制劑工業(yè)（1）提取法提取分離法的特點：①設備較簡單；②操作較方便；③來源受到限制，不適于大規(guī)模的工業(yè)生產。（動植物的生產周期長易受地理、氣候和季節(jié)等因素的影響。）20世紀50年代以后，隨著發(fā)酵技術的發(fā)展，許多酶都采用生物合成法進行生產。然而，在動、植物或微生物的組織、細胞中提取所需的酶，仍然有其使用價值，至今仍然使用。例如，從動物的胰臟中提取分離胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶；從檸檬酸發(fā)酵后得到的黑曲霉菌體中提取分離果膠酶等。2.1酶的幾種主要生產方法（1）提取法2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法生物合成法生產用酶首先要經過篩選、誘變、細胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產物工程菌。然后在生物反應器中進行細胞培養(yǎng)，通過細胞反應條件優(yōu)化，再經過分離純化得到人們所需的酶。利用微生物細胞的生命活動獲得所需酶的方法又稱為發(fā)酵法，根據(jù)細胞培養(yǎng)方式的不同，發(fā)酵法可以分為液體深層發(fā)酵、固體培養(yǎng)發(fā)酵、固定化細胞發(fā)酵、固定化原生質體發(fā)酵等?，F(xiàn)在普遍使用的是液體深層發(fā)酵技術。2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法2.1酶的幾種主要生產方法2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法酶的工藝生產過程：①原料選擇；②菌種選育和發(fā)酵（固體培養(yǎng)與液體深層培養(yǎng)法）；③酶制劑生產的下游工程。2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法第五章-工業(yè)生物催化劑課件2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法發(fā)酵制取酶制劑的優(yōu)點：①種類繁多,凡是動植物體內有的酶幾乎都能從微生物中找到,并可根據(jù)應用特點和要求,篩選出最佳的產酶菌株；②繁殖快,發(fā)酵周期短,培養(yǎng)簡便,能通過控制培養(yǎng)條件大幅度提高酶的產量；③微生物具有較強的適應能力,可采用各種遺傳變異手段,培育出新的、更理想菌株。2.1酶的幾種主要生產方法（2）生物合成法（3）化學制取法

包括酶的化學全合成、酶類似物和模擬酶的化學合成。化學合成法證明了酶等的化學本質是蛋白質,也說明人們可以通過化學的方法在實驗室中合成包括酶在內的各種生命物質?；瘜W制取法和提取法一樣，由于原料來源受限制,生產成本高,污染環(huán)境,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產。2.1酶的幾種主要生產方法（3）化學制取法2.1酶的幾種主要生產方法2.2提高酶產量的措施（1）添加誘導物對于誘導酶的發(fā)酵生產，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機，添加適宜的誘導物，可以顯著提高酶的產量。例如，乳糖誘導β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導蔗糖酶的生物合成等。誘導物一般可以分為3類：酶的作用底物酶的催化反應產物作用底物的類似物2.2提高酶產量的措施（1）添加誘導物2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度據(jù)阻遏作用機理不同，可分為：產物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。①產物阻遏作用是由酶催化作用的產物或者代謝途徑的末端產物引起的阻遏作用。②分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質經過分解代謝而產生的物質）引起的阻遏作用。控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產量的有效措施。2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應當控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。

對于受代謝途徑末端產物阻遏的酶，可以通過控制末端產物的濃度的方法使阻遏解除。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）2.2提高酶產量的措施（2）控制阻遏物的濃度采用其他較難利2.2提高酶產量的措施（3）添加表面活性劑表面活性劑可以與細胞膜相互作用，增加細胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、曲通(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產量增加。由于離子型表面活性劑對細胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對細胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產中添加到培養(yǎng)基中。

2.2提高酶產量的措施（3）添加表面活性劑2.2提高酶產量的措施（4）添加產酶促進劑產酶促進劑是指可以促進產酶、但是作用機理未闡明清楚的物質。在酶的發(fā)酵生產過程中，添加適宜的產酶促進劑，往往可以顯著提高酶的產量。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1～20倍,添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產量。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗確定所添加的產酶促進劑的種類和濃度。2.2提高酶產量的措施（4）添加產酶促進劑2.3酶活性測定酶活性，是指酶催化一定化學反應的能力。酶活性是研究酶的特性、分離純化以及酶制劑生產和應用時的一項不可缺少的指標。

酶活性是用在一定條件下，它所催化某一反應的反應初速度來表示。

酶反應速度（指速初度）可用單位時間內單位體積中底物的減少量或產物的增加量來表示。其單位為mol/s。2.3酶活性測定酶活性，是指酶催化一定化學反應的能2.3酶活性測定酶活性的測定方法：酶活性與底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑、抑制劑的濃度以及緩沖液的種類和濃度都密切相關。酶活性測定可用終止反應法或連續(xù)反應法。終止反應法是將酶反應按時間即刻完全停止，取出反應物或產物，予以分離，再確定反應物的消耗量，或產物的形成量，算出酶活性。連續(xù)反應法無需終止反應而是在酶反應過程中用光學儀器來監(jiān)測反應進行情況。其中以光譜吸收的變化更為準確。2.3酶活性測定酶活性的測定方法：2.4酶的提煉（1）酶溶液的制取酶溶液制備包括三個過程的工作：①材料預處理和破碎細胞；②抽提；③抽提液的濃縮。酶蛋白的分布：胞外酶、胞內酶（溶酶、結酶）2.4酶的提煉（1）酶溶液的制取第五章-工業(yè)生物催化劑課件2.4酶的提煉（2）根據(jù)分子大小輕重建立的分離純化方法①透析和超過濾；②離心分離；③凝膠過濾等。2.4酶的提煉（2）根據(jù)分子大小輕重建立的分離純化方法2.4酶的提煉（3）調節(jié)溶解度的分離方法調整溶解度的分離方法是根據(jù)酶和雜蛋白質在溶解度性質上不同而建立的一些方法。①鹽析法；②有機溶劑沉淀法；③共沉淀法；④選擇性沉淀法等。2.4酶的提煉（3）調節(jié)溶解度的分離方法2.4酶的提煉（4）按分子電荷的正負多少設計的分離方法分子荷正電多的物質，與荷負電性的物質反應強，受負電場的影響大；荷負電性多的物質正相反。①吸附交換分離法；②電泳分離法；③聚焦層析法等。2.4酶的提煉（4）按分子電荷的正負多少設計的分離方法2.4酶的提煉（5）根據(jù)親和作用建立的純化方法由于酶對底物、競爭性抑制劑、捕酶等配體具有較高的親和力，而其他雜蛋白對它們沒有或有很弱的親和作用。因此，可以根據(jù)酶、雜蛋白對配體親和力的差異，很容易地將酶分離出來。已建立的方法有親和層析、親和電泳法等。2.4酶的提煉（5）根據(jù)親和作用建立的純化方法2.4酶的提煉（6）其他根據(jù)穩(wěn)定性的差異建立的分離純化方法：熱變性法、酸堿變化法和表面變性法等。蛋白質(酶)的高效液相色譜分離分析法。2.4酶的提煉（6）其他2.5固定化酶以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這些水溶性酶催化結束后，極難回收，因而阻礙了酶工業(yè)的近一步發(fā)展。60年代以后，在酶學研究領域內涌現(xiàn)出固定化酶。

它是通過物理的或化學的手段，將酶束縛于水不溶的載體上、或將酶束縛在一定的空間內，限制酶分子的自由流動，但能使酶充分發(fā)揮催化作用。2.5固定化酶以往使用的酶絕大多數(shù)是水溶性的酶。這2.5固定化酶（1）酶的固定化方法：①吸附法；②包埋法；③共價鍵結合法；④交聯(lián)法。2.5固定化酶（1）酶的固定化方法：第五章-工業(yè)生物催化劑課件2.5固定化酶（2）固定化酶的性質酶活性變化：與其溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。（原因：酶與不溶性載體相結合引起結構發(fā)生了變化；酶活性中心的重要氨甚酸殘基與載體相結合。）穩(wěn)定性變化：大多數(shù)酶在固定化后都不同程度地提高了穩(wěn)定性，延長了有效壽命。（原因：固定化增加了酶構象的牢固程度。擋住了不利因素對酶的侵襲。限制了酶分子間的相互作用。但是，如果固定化觸及到酶活性敏感區(qū)域，也可能導致酶穩(wěn)定性下降。）最適pH的變化最適溫度的變化動力學常數(shù)的變化2.5固定化酶（2）固定化酶的性質2.6固定化酶反應器（1）固定化酶反應器的類型①間歇式酶反應器（BatchReactor，BSTR）底物與酶一次性投入反應器內，產物一次性取出；反應完成后，固定化酶用過濾或超濾法回收，再轉入下一批反應。優(yōu)點：裝置較簡單，造價較低，傳質阻力很小，反應能迅速達到穩(wěn)態(tài)。缺點：操作麻煩，酶經多次反復回收使用后易失去活性，工業(yè)上很少用于固定化酶，常用于游離酶。2.6固定化酶反應器（1）固定化酶反應器的類型2.6固定化酶反應器②連續(xù)攪拌釜式反應器（ContinuousStirredTandReactor，CSTR）向反應器投入團定化酶和底物溶液，不斷攪拌，反應達到平衡之后，再以恒定的流速連續(xù)流人底物溶液，同時，以相同流速輸出反應液(含產物)。優(yōu)點：在理想狀況下，混合良好，各部位組成相同，并與輸出成分一致。缺點：攪拌漿剪切力大，易打碎磨損問定化酶顆粒。2.6固定化酶反應器②連續(xù)攪拌釜式反應器（Continuo2.6固定化酶反應器③填充床反應器（PackedBedReactor，PBR）將固定化酶填充于反應器內，制成穩(wěn)定的柱床，然后通入底物溶液，在一定的反應條件下實現(xiàn)酶催化反應，以一定的流速，收集輸出的轉化液(含產物)。優(yōu)點：高效率、易操作、結構簡單等，因而是目前工業(yè)生產及研究中應用最為普遍的反應器。缺點：傳質系數(shù)和傳熱系數(shù)相對較低。當?shù)孜锶芤汉腆w顆粒或黏度很大時，不宜采用PBR。④其他流化床反應器（FluidizedBedReactor，F(xiàn)BR）；連續(xù)攪拌罐-超濾膜反應器（CSTR-UFR）等。2.6固定化酶反應器③填充床反應器（PackedBed2.6固定化酶反應器（2）固定化酶反應器的選擇影響酶反應器選擇的因素很多．但一般從以下幾個方面考慮：固定化酶的形狀；底物的物理性質；酶反應動力學特性；酶的穩(wěn)定性；操作要求及反應器本身的代價等。2.6固定化酶反應器（2）固定化酶反應器的選擇3工業(yè)酶制劑的應用3.11,3-丙二醇1,3-丙二醇（1,3-propanediol，PDO）是一種重要的化工原料，由PDO合成的聚酯如聚對苯二甲酸二醇酯（PTT）等具有良好的性能和廣闊的工業(yè)化前景。

主要用途：①作為產品中的組分提高產品性能，如化妝品、抗凍劑等；②作為醫(yī)藥和有機合成的中間體用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)，如合成增塑劑、防腐劑、乳化劑、香味增強劑等；③作為單體用于合成聚酯和聚氨酯，是PDO最重要的用途。3工業(yè)酶制劑的應用3.11,3-丙二醇3工業(yè)酶制劑的應用（1）1,3-丙二醇的化學合成方法PDO有多種合成方法，主要由環(huán)氧乙烷羰基化法和丙烯醛水解法。①環(huán)氧乙烷（EO）羰基化法EO+CO+2H2→PDO

反應壓力大，裝置投資較大。

②丙烯醛水解法CH2=CHCHO+H20→HOCH2CH2CHOHOCH2CH2CHO+H2→HOCH2CH2CH2OH丙烯醛本身也是一種重要的有機中間體，且屬劇毒、易燃、易爆物品，難以儲存和運輸。3工業(yè)酶制劑的應用（1）1,3-丙二醇的化學合成方法3工業(yè)酶制劑的應用（2）1,3-丙二醇的發(fā)酵法以葡萄糖為底物經由甘油生產，技術中使用克隆了肺炎克雷伯菌中的dha調節(jié)因子的大腸桿菌（基因工程菌）。由甘油到PDO反應的過程中，一部分底物甘油通過還原途徑，經甘油脫水酶和PDO氧化還原酶催化，得到PDO；另一部分甘油通過氧化途徑供菌體生長需要，并提供還原所需的NADH2。催化過程需要與菌體生長耦合在一起的多個酶協(xié)調作用，并且菌體在具有生物活性的時候，才能保證足夠的還原當量和一些輔酶的再生，最終保證催化反應的順利進行。3工業(yè)酶制劑的應用（2）1,3-丙二醇的發(fā)酵法第五章-工業(yè)生物催化劑課件3工業(yè)酶制劑的應用3.2L-異亮氨酸異亮氨酸(2-amino-3-methylvalericacid)由Ehrlich于1904年首次從甜菜糖漿中分離出來,其化學組成雖與亮氨酸相同,但理化性質各異,故命名為異亮氨酸。

異亮氨酸有4種光學異構體,自然界中存在的僅為L-異亮氨酸。作為人體必需的8種氨基酸之一,成年人每天需要從外界攝取20mg/kg(體重)的L-異亮氨酸。L-異亮氨酸是合成人體激素、酶類的原料,具有促進蛋白質合成和抑制其分解的效果,在人體生命活動中起著重要作用,因此,在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應用及商業(yè)價值。3工業(yè)酶制劑的應用3.2L-異亮氨酸3工業(yè)酶制劑的應用（1）L-異亮氨酸的生產方法L-異亮氨酸的生產方法有提取法、化學合成法、發(fā)酵法。提取法和化學合成法由于原料來源受限制,生產成本高,污染環(huán)境,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產。微生物發(fā)酵法生產L-異亮氨酸具有原料成本低,反應條件溫和,容易實現(xiàn)大規(guī)模生產等優(yōu)點,是目前生產L-異亮氨酸最主要的方法。

L-異亮氨酸發(fā)酵有添加前體發(fā)酵（又稱微生物轉化法）和直接發(fā)酵-種方法。3工業(yè)酶制劑的應用（1）L-異亮氨酸的生產方法3工業(yè)酶制劑的應用（2）L-異亮氨酸的生物合成途徑以葡萄糖為原料生物合成L-異亮氨酸涉及到EMP、HMP、TCA、乙醛酸循環(huán)、伍德沃克曼反應,以及蘇氨酸合成水平和分支鏈氨基酸合成水平的調控制,其生物合成途徑如圖1所示。

3工業(yè)酶制劑的應用（2）L-異亮氨酸的生物合成途徑第五章-工業(yè)生物催化劑課件3工業(yè)酶制劑的應用3.3酶制劑的其他工業(yè)應用（1）果葡糖漿（2）丙烯酰胺（3）手性化合物等3工業(yè)酶制劑的應用3.3酶制劑的其他工業(yè)應用4酶制劑的改性和提高4.1改性的目的、意義隨著丙烯酰胺、長鏈二元酸等大宗產品逐漸走向市場，許多關于生物催化技術的探索研究也廣泛地開展起來，并在一些領域取得了可喜成果。

但是，目前工業(yè)酶催化的生產過程還是比較有限，主要原因在于：①酶的種類少；②目前酶的活性、耐溫性、耐酸堿變化等性能比較差。利用生物技術對現(xiàn)有的酶進行改性研究，提高酶的活性和耐久性，拓寬了工業(yè)生物催化劑應用的領域，使其更有工業(yè)應用前景。近年來，這方面工作的研究主要集中在極端菌的探索，非水相酶的研究以及分子水平的定向進化、合理化設計等。

4酶制劑的改性和提高4.1改性的目的、意義4.2改性的手段（1）極端菌的研究近年來，人們發(fā)現(xiàn)一些菌在高溫、寒冷、強酸堿、高鹽濃度、高壓等一般生物無法生存的極端條件下任然可以生存，這些菌統(tǒng)稱為極端菌。對這些極端菌進行研究，有望逐步解決工業(yè)微生物對溫度和環(huán)境依賴性等缺陷，增強在工業(yè)上的應用前景。

極端菌包括嗜高溫菌、嗜低溫菌、嗜鹽菌、嗜酸菌、嗜堿菌、嗜壓菌等。4.2改性的手段（1）極端菌的研究4.2改性的手段（1）極端菌的研究嗜高溫菌目前在工業(yè)上可以有兩種用途：一是利用菌體產生的酶進行高溫下的反應。如嗜熱古細菌Thermusaquoticus中分離出來得TaqDNA聚合酶可以用于PCR技術。二是利用菌體發(fā)酵。如用極端嗜熱菌生產乙醇，在高溫下進行這一反應，可以把生產和分離結合起來，消除乙醇的產物抑制作用。

其他極端菌在發(fā)現(xiàn)地和結構上也各有特點，決定了它們的不同工業(yè)用途。如由于嗜鹽菌在高鹽濃度下穩(wěn)定，它可用作低含水體系的催化劑。4.2改性的手段（1）極端菌的研究4.2改性的手段（1）極端菌的研究另一方面，利用基因工程技術將極端微生物特殊功能基因片段轉入一般微生物體內或將一般微生物特異基因片段導入極端微生物中，從而改造受體的生理功能，甚至創(chuàng)造新的物種也是一種很好利用極端菌的方法。4.2改性的手段（1）極端菌的研究4.2改性的手段（2）非水相酶催化水是酶促反應最常用的反應介質。但對于大多數(shù)有機化合物來說，水并不是一種適宜的溶劑。因為許多有機化合物（底物）在水介質中難溶或不溶。由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應的發(fā)生。是否存在非水介質能保證酶催化？4.2改性的手段（2）非水相酶催化但對于大多數(shù)有機化合物來說4.2