觀察瘢痕疙瘩及其不同表型與HLA單倍體的關(guān)聯(lián)性,皮膚病學(xué)論文疲痕疙瘩(KeloidsOMIMNo.148100)是皮膚損傷后引發(fā)的膠原異常積累所致的過度疲痕化，是人類特有的一種病理愈介現(xiàn)象。疲痕疙瘩是皮膚科和整形外科領(lǐng)域的常見病，多發(fā)病。疲痕疙瘩可發(fā)生于所有人群，流行病學(xué)調(diào)查表示清楚，有色人種如黑種人和黃種人疲痕疙瘩的發(fā)生率明顯高于自種人，黑人發(fā)病率約為自人的5-15倍，黑種人、歐洲自種人、亞洲黃種人發(fā)病率在4.5%一16%最高可接近20%。山于病因小明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜及種族和個體差異，當(dāng)前尚無特別有效的根治方案[f21。該病好發(fā)于胸骨區(qū)，亦可見于肩部，而部，頸部和耳部等處，病程慢性拖延，嚴(yán)重影響患者的容貌，形象及自我評價，進(jìn)而在很大程度上影響患者的心理健康。同時繼發(fā)于燒傷，燙傷者可構(gòu)成大而積損害，嚴(yán)重者可影響受累肢體功能，給患者身心健康帶來嚴(yán)重影響，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)疲痕疙瘩的病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未完全說明，當(dāng)前普遍以為該病是一種多基因或基因與環(huán)境因素共同作用的一種復(fù)雜性疾病。大量研究表示清楚遺傳因素與疾病發(fā)病密切相關(guān)。華而不實(shí)免疫遺傳因素在疲痕疙瘩的發(fā)病中起著重要作用。因而，尋找疲痕疙瘩免疫遺傳相關(guān)易感基因并討論其功能是從根本上揭示疾病病因和發(fā)病機(jī)制的重要途徑，對今后疾病的預(yù)防和治療方案的改良具有重要意義，同時可以能揭示基底成纖維細(xì)胞異常增殖的分子遺傳學(xué)機(jī)制，進(jìn)而有助于其他疲痕性疾病的研究。近年來人們對免疫遺傳研究主要集中在人類主要組織相容性抗原復(fù)介體(majorhistocompatibilitycomplexMHC)，然而，至今與疲痕疙瘩相關(guān)的MHC區(qū)域易感基因沒有能被真正確認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用聚介酶鏈反響一序列特異性引物(PCR-SSP)技術(shù)觀察疲痕疙瘩及其小同表型與HLA單倍體的相關(guān)性，為進(jìn)一步討論免疫遺傳學(xué)因素在疲痕疙瘩的發(fā)病機(jī)理中的作用提供理論根據(jù)。一、資料與方式方法1.檢測對象:疲痕疙瘩組為2018年8月至2020年12月女徽省立醫(yī)院、女徽六女市人民醫(yī)院、徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、無錫二院門診就診的疲痕疙瘩患者，均符介疲痕疙瘩的診斷標(biāo)準(zhǔn)。肥厚性疲痕和其他伴有疲痕疙瘩的綜介征患者均被排除在外。研究人群包括91例男性患者和101例女性患者，年齡79歲，平均31.54歲;每例患者均填寫知情同意書。對照組為同期在門診就診的非疲痕疙瘩患者或外科住院患者的健康家屬，無血緣關(guān)系，共收集血標(biāo)本252份，年齡5^70歲，平均32.40士10.05)歲，華而不實(shí)男124例，女128例。兩組性別、年齡構(gòu)成均無統(tǒng)計學(xué)差異。本研究采用統(tǒng)一設(shè)計的疲痕疙瘩流行病學(xué)調(diào)查表，山經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的調(diào)查員以一樣的態(tài)度對先證者及正常對照進(jìn)行問卷調(diào)查。調(diào)查表內(nèi)容包括一般情況(姓名、年齡、性別、住址、、文化程度和婚姻狀況等)，發(fā)病年齡，疾病病程，發(fā)病部位，皮損形狀、數(shù)目和而積，皮損特點(diǎn)以及嚴(yán)重程度評分。選用疲痕疙瘩的顏色(正常、淡紅和赤紅)、高度(平坦、1-4mm.5-8mm和8mm以上)、質(zhì)地(正常、稍軟、硬如橡皮和硬如軟骨)、能否瘤癢(無、偶然、時常和居」烈)和疼痛(無、有時、經(jīng)常和劇烈)作為病情輕重程度的指標(biāo)。每項(xiàng)指標(biāo)根據(jù)臨床表現(xiàn)賦子0-3分，分?jǐn)?shù)越高代表病情越重。綜介評分為0-15分，再將其分為0-5分(輕度)、6-10分(中度)和11一15分(重度)三組。記錄每位患者疲痕疙瘩的數(shù)量和發(fā)生部位。2.血標(biāo)本收集:每例受檢者收集2ml，全血放入含構(gòu)椽酸鈉的試管內(nèi)，2000r/min離心10min取出華而不實(shí)的自細(xì)胞，置于2ml離心管內(nèi)，放人一85℃冰箱保存。3.基因組DNA制備:采用改進(jìn)鹽析法從分離的細(xì)胞中提取基因組DNA，用紫外分光光度計測DNA原液吸光度，算出DNA原液濃度，用滅菌雙蒸餾水將DNA模板配制成質(zhì)量濃度為50ng/閃的使用液，置于一20℃冰箱保存。4.等價菜因序列特異性引物:按u獻(xiàn)介成序列特異性引物及內(nèi)對照引物。利用PCR-SSP法分析HLA-A.B.Cw.DQA1.DQB1.DRB1各座位等位基因及單倍型的分布情況。另外介成2條內(nèi)參照引物，用于擴(kuò)增HLA-DRB1基因第3內(nèi)含子796by片段的保守序列。所有引物均山上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司介成。5.PCR反響及產(chǎn)物檢測:每個反響總體積10閃，雙蒸水，內(nèi)參照引物(2.0}mol/L)1.0}1}1.25nmol/LdNTP1.0}1(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)10倍緩沖液(含25mmol/LMgC12)1.0等位基因特異性引物(10mmol/1}P3,等位基因特異引物(10mmol/1}PS)0.5Taq酶5U單l0.1}1，待測基因組(50ng單1)3.0。采用Touch-DownPCR程序1:94℃變性5min，94℃變性45s，退火溫度從70℃開場，每個循環(huán)下降0.5℃，退火時間45s,72℃延伸45s，共30個循環(huán)，720C延伸5minxPCR反響在T-GradientPCR儀(德國Biometra公司)上進(jìn)行。將PCR產(chǎn)物力II2}1澳酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含0.5fig/澳化乙陡)上進(jìn)行，在AAB紫外線透射凝膠成像儀系統(tǒng)(AdvancedAmericanBiotechnology公司產(chǎn)品)觀察結(jié)果。6.數(shù)據(jù)處理:等位基因頻率(AFB、連鎖小平衡CLD即△)、單倍型頻率(Pna}、連鎖小平衡值C4AB)的計算見文獻(xiàn)fizl。采用InfoEpi6.SPSS軟件對疲痕疙瘩患者及正常人對照，小同嚴(yán)重度、發(fā)病能否有家族史及正常人對照間進(jìn)行等位基因頻率比擬。比擬采用擴(kuò)檢驗(yàn)，以P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。二、結(jié)果HAL-I、II類等位基因間的兩點(diǎn)單倍型連鎖小平衡分析，10個二位點(diǎn)單倍型與疲痕疙瘩發(fā)病呈正相關(guān)結(jié)果見表1。以上基因間的連鎖均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05。攜帶A*25-B*07x2=3.36,P}0.05)和B*07-DRB1*15x2=17.82,P}0.05)單倍型的疲痕疙瘩患者更多表現(xiàn)為有陽性家族;攜帶HLA-A*25-B*07x2=4.03，P}0.05)，B*07-DRB1*15(擴(kuò)=5.53，P}0.05)和DQA1*0104-DQB1*0503(擴(kuò)=20.66,P}0.05單倍型的疲痕疙瘩患者更多的表現(xiàn)中等嚴(yán)重度。表示清楚小同類型的疲痕疙瘩患者可能有小同的遺傳基礎(chǔ)(表2-6)。三、討論當(dāng)前已有越來越多的證據(jù)表示清楚疲痕疙瘩是一種遺傳性疾病。首先，疲痕疙瘩愈加容易出如今膚色較深的民族;其次，家族遺傳性和雙胞胎中的高發(fā)病率也顯示疲痕疙瘩具有遺傳性。疲痕疙瘩的遺傳學(xué)研究多集中在疲痕疙瘩相關(guān)基因的表示出水平上，華而不實(shí)較多的集中在疲痕疙瘩與P53基因、FAS基因c-myc,c-fos,ras基因、Bcl-2家族、ICE家族等各種凋亡基因以及細(xì)胞因子TGF-p、IL等相關(guān)性研究its-t但也只是停留在探尋求索性研究階段，迄今為比尚未有統(tǒng)一的定論。近年來，免疫遺傳因素在異常疲痕構(gòu)成的重要性越來越遭到重視。一些研究已經(jīng)表示清楚免疫遺傳因素在增生性疲痕和疲痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制起到一定的作用。Santucci等在對增生性疲痕和疲痕疙瘩調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)疲痕疙瘩皮損組織有大量的免疫細(xì)胞浸潤，華而不實(shí)包括CD3-,CD45R0一和CD4-T淋巴細(xì)胞。當(dāng)前免疫遺傳研究熱門主要集中在主要組織相容性復(fù)介體(MHC，即作為已經(jīng)知道的人類自細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)。人類主要組織相容性復(fù)介體(majorhistocompatibilitycomplexMHC)編碼的基因是位于人類第6對染色體短臂上嚴(yán)密連鎖的基因群。此區(qū)域是人類基因組中基因密度極高的區(qū)域之一，是免疫功能相關(guān)基因中最集中、最多的一個區(qū)域，是迄今所知人類基因多態(tài)性最豐富的一個區(qū)域，是與疾病關(guān)聯(lián)最為密切的一個區(qū)域。早在1977年Laurentaci和Dioguardi等初次報道了HLA-B14和B16抗原與疲痕疙瘩發(fā)病顯著相關(guān)，此后，國內(nèi)外一些學(xué)者陸續(xù)對HLA等位基因與疲痕疙瘩的相關(guān)性進(jìn)行研究，小斷發(fā)現(xiàn)了和疲痕疙瘩及其小同臨床表型的相關(guān)性位點(diǎn)，然而國內(nèi)對疲痕疙瘩的遺傳學(xué)研究較少。HLA復(fù)介體是一組嚴(yán)密連鎖的基因群。這些連鎖在一條染色體上的等位基因很少發(fā)生同源染色體間的交換，構(gòu)成單倍型。在遺傳經(jīng)過中，HLA單倍型作為一個完好的遺傳單位山親代遺傳給子代。HLA系統(tǒng)最突出的一個特點(diǎn)是某些HLA等位基因在一起的頻率比預(yù)期的時機(jī)更多。假如單倍型頻率比預(yù)期的隨機(jī)重組率高，講明兩個基因座存在著連鎖小平衡。某些疾病的易感基因可能小是單一的等位基因，而可能是多個等位基因組成的基因群，檢測擴(kuò)展單倍型能夠在尋找某些疾病基因方而提供更有價值的信息。我們能夠通過家系或群體資料估計出單倍型和基因的頻率。本研究通過對HLA-A.B.C.DQA1.DQB1.DRB1構(gòu)建的單倍型，經(jīng)過病例對照研究，發(fā)現(xiàn)10個有陽性意義的單倍型，包括A*03-B*07.A*03-Cw*0802.A*25-B*07、A*25-Cw*0802、B*07-Cw*0802、B*07-DQB10501.B*07-DRB1*15.DQA1*0104-DQB1*0501、DQA1*0104-DQB1*0503.DQB1*0503-DRB1*15與疲痕疙瘩呈正相關(guān)，攜帶這些單倍型的人群疲痕疙瘩易感性明顯升高。以們的報道中未見有關(guān)單倍型與疲痕疙瘩小同臨床表型之間相關(guān)性的報道，本研究通過分層分析發(fā)現(xiàn)，小同臨床表型與HLA單倍型的相關(guān)性小同。通過HLA單倍型與疲痕疙瘩小同嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析，未發(fā)現(xiàn)只與嚴(yán)重型疲痕疙瘩有相關(guān)性的單倍型，而發(fā)現(xiàn)3個單倍型HLA-A*25-B*07,B*07-DRB1*15,DQA1*0104-DQB1*0503與疲痕疙瘩的中等程度有相關(guān)性，講明攜帶該單倍型的患者易患中等程度疲痕疙瘩?？赡茉蛴写M(jìn)一步討論。疲痕疙瘩的發(fā)生存在著家族聚集現(xiàn)象，通過HLA單倍型與疲痕疙瘩陽性家族史的相關(guān)性分析，顯示了A*25-B*07和B*07-DRB1*15單倍型與有陽性家族史的患者呈正相關(guān)性。B*07-DQB1*0501與散發(fā)患者有相關(guān)性。以上結(jié)果表示清楚，家族史陽性的疲痕疙瘩病患者與散發(fā)患者可能存在