生物制品生物制品：利用微生物、寄生蟲及其組織成分或代謝產(chǎn)物以及動(dòng)物或人的血液與組織液等生物材料，通過生物學(xué)、生物化學(xué)以及生物工程學(xué)的方法制成的，用于傳染病或其他疾病的預(yù)防、診斷和治療的生物制劑單克隆抗體MonoclonalAntibody應(yīng)用于臨床診斷和治療單克隆抗體理論依據(jù)一個(gè)B淋巴細(xì)胞只能識別抗原的一個(gè)表位，所以只能產(chǎn)生針對該表位的特異性抗體。若能把此B細(xì)胞由脾臟中挑出來，單獨(dú)培養(yǎng)成細(xì)胞株，則可得單一種類的抗體，只會(huì)對一種抗原決定基反應(yīng)，其專一性極高。B細(xì)胞特點(diǎn)：不易體外生長，壽命短,分泌特異系性抗體癌（瘤）細(xì)胞的生長不受控制，很容易在培養(yǎng)基中生長，有很多已經(jīng)建立好的癌細(xì)胞株，其生長特性均已了解。骨髓瘤細(xì)胞特點(diǎn)：壽命長單克隆抗體理論依據(jù)利用癌細(xì)胞永續(xù)生長的特性和融合法，把癌細(xì)胞導(dǎo)入可生產(chǎn)有用抗體的B細(xì)胞中，則可在培養(yǎng)基中永久生長的B細(xì)胞株，此即雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞特點(diǎn)：壽命長，可產(chǎn)生單克隆抗體單抗純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)雜交瘤技術(shù)原理：聚乙二醇（PEG）：細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復(fù)的免疫學(xué)檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細(xì)胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細(xì)胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體流程單克隆抗體制備：雜交瘤技術(shù)一、動(dòng)物免疫免疫抗原制備（免疫抗原是越純越好）。免疫動(dòng)物的選擇

根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)椋械墓╇s交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。就小鼠而言，初次免疫時(shí)以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。免疫程序的確定細(xì)胞融合細(xì)胞選擇髓瘤細(xì)胞的選擇

骨髓瘤細(xì)胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthineguanosine

phosphoribosyl

transferase，HGPRT）的骨髓瘤細(xì)胞，目前建立的骨髓瘤細(xì)胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞系，只分泌一種針對預(yù)定的抗原的抗體分子。

SP2/0-Ag14的選擇優(yōu)點(diǎn)：1、喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，便于HAT（A氨基喋呤是葉酸的類似物）培養(yǎng)基的篩選未融合的細(xì)胞。2、可在8－氮雜鳥嘌呤（嘌呤核苷酸代謝類似物）培養(yǎng)基中生長，便于篩選“返祖”的HGPRT+細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備

取已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時(shí)的陽性對照血清。取脾臟，收獲脾細(xì)胞懸液，通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個(gè)脾細(xì)胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細(xì)胞。

飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入其他活細(xì)胞使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。它促進(jìn)其他細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明了，一般認(rèn)為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細(xì)胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細(xì)胞對細(xì)胞密度的依賴性。HAT培養(yǎng)基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細(xì)胞通過替代途徑合成DNAHAT選擇作用：淋巴細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細(xì)胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻單抗檢測時(shí)間：融合后2周左右檢測方法特點(diǎn)抗體檢測方法的原則是快速、敏感、特異、可靠、花費(fèi)小和節(jié)省人力常用檢測方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫檢測雜交瘤細(xì)胞的克隆化

所謂克隆化是指使單個(gè)細(xì)胞無性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個(gè)培養(yǎng)過程。克隆化的原因從原始孔中得到的陽性雜交瘤細(xì)胞，可能來源于二個(gè)或多個(gè)雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系（又稱亞克隆），需要克隆化。長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測抗體分泌情況。雜交瘤細(xì)胞的克隆化原因雜交瘤細(xì)胞的克隆化方法

克隆化的方法很多，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類儀（FACS）分離法。限稀釋法、軟瓊脂法最常用的兩種方法。有限稀釋法計(jì)數(shù)103/ml102/ml10/ml0.1/ml/孔軟瓊脂法飼養(yǎng)細(xì)胞（小鼠腹腔細(xì)胞）單層吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液取雜交瘤細(xì)胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層克隆生長至2mm時(shí)小結(jié)

雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的原理是利用聚乙二醇作為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)

胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一

體，在HAT選擇